廣泛期小細胞肺癌BRCA2基因突變狀態(tài)與一線化療疾病無進展生存期的相關(guān)性分析

楊 盛 劉 鑫 邢亞桓

肺癌為胸部惡性腫瘤，癌細胞來源于支氣管黏膜上皮[1]。據(jù)流行病學顯示，肺癌發(fā)生率與死亡率逐年上升，且男性發(fā)病人群多于女性[2]。小細胞肺癌不同于非小細胞肺癌具有典型癥狀，且病情發(fā)展快、惡性程度高，患者生存時間較短[3]。故早期診斷治療對延長患者生存時間具有重要意義。二代測序(NGS)技術(shù)發(fā)展使基因檢測進入高通量測序時代，該技術(shù)檢測樣本范圍廣，檢測通量大、效率高，其特異性強且靈敏度高[4-5]。隨著NGS測序技術(shù)在臨床中的逐步應(yīng)用，研究表明小細胞肺癌的基因突變頻率較高，在其發(fā)生發(fā)展中存在多個驅(qū)動基因異常。BRCA2基因是有27個外顯子組成，定位于染色體13q12.3上，存在無義、移碼、缺失等多種形式突變。BRCA突變后使蛋白質(zhì)產(chǎn)物減少、蛋白質(zhì)功能出現(xiàn)障礙。目前臨床對非小細胞肺癌的BRCA2基因突變研究較多，關(guān)于廣泛期小細胞肺癌的研究相對較少[6]。為此，本研究通過研究廣泛期小細胞肺癌患者的基因突變情況與一線化療方案療效，分析BRCA2基因突變狀態(tài)與化療后生存期關(guān)系，為臨床治療及評估預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，選擇2019年3月至2020年6月我院89例廣泛期小細胞肺癌患者，其中男性46例，女性43例；年齡為39～70歲，平均(57.36±10.28)歲；吸煙情況：吸煙65例、不吸煙24例；解剖類型：中央型78例、周圍型11例。納入標準：經(jīng)病理診斷確診為廣泛期小細胞肺癌[7]；初始治療前接受NGS檢測；簽署知情同意書。排除標準：局限期小細胞肺癌患者；合并其他惡性腫瘤患者；血壓無法控制患者；肝腎功能衰竭患者；精神疾病或意識障礙患者。

1.2 方法

一線化療方案：患者入組后給予依托泊苷以100 mg/m2標準并聯(lián)合鉑類方案化療，以21 d為一個療程；當出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)終止實驗，不良反應(yīng)參照美國國立癌癥研究通用的毒性標準[8]。

抽取患者化療前清晨空腹靜脈血，離心后取上層清液冷凍保存。

NGS檢測方法[9]：采用Ion Torrent測序技術(shù)進行NGS檢測。文庫制備：采用科吉安(來源于北京雅康博生物科技有限公司)肺癌文庫制備試劑盒。①文庫制備前采用定量儀(Qubit 3.0)初步估測樣本中DNA濃度，當DNA濃度超過1.7 ng/ml且量超過10 ng表示樣本合格。②向樣本中加DNA PCR反應(yīng)液，混勻后加入引物、DNA、無核酸酶水，設(shè)置PCR參數(shù)循環(huán)22次：第一階段參數(shù)為99 ℃、3 min，第二階段為99 ℃、15 s，第三階段60 ℃、4 min。③向樣本中加入引物消化液，再次行PCR，參數(shù)設(shè)置：第一階段50 ℃、10 min，第二階段55 ℃、10 min，第三階段60 ℃、20 min，反應(yīng)后放于恒溫箱中備用。④樣本中加入連接緩沖液、DNA連接酶行連接接頭PCR，參數(shù)設(shè)置：第一階段22 ℃、30 min，第二階段72 ℃、10 min，反應(yīng)后放恒溫箱備用。⑤制備后的樣本放入EP管，加純化磁珠混勻后于恒溫箱內(nèi)孵育，取上層液放于另一EP管內(nèi)，加70%乙醇轉(zhuǎn)洗磁珠，沉淀后去其上層液，重復1次后完成純化連接產(chǎn)物。⑥純化后的樣本加PCR緩沖液行缺口連接、擴增，完成5個循環(huán)，參數(shù)設(shè)置：第一階段98 ℃、2 min，第二階段98 ℃、15 s，第三階段60 ℃、1 min。⑦按步驟⑤進行文庫純化，采用定量儀進行定量。制備測序模板與富集：采用IonPGMTMTemplate OT2 Reagents 200試劑盒(來源于Life Tech公司)。①樣本加入EP管內(nèi)混勻放冰盒中備用；②向樣本中加無核酸酶水、PCR緩沖液、PCR酶、稀釋后的文庫，將其混勻后作擴增液；③將擴增液連續(xù)3次打入模板制備器內(nèi)，加制備反應(yīng)油繼續(xù)油包水PCR反應(yīng)，反應(yīng)后離心去除溶液，取下層油包水產(chǎn)物移入新EP管中，加無核酸酶水震蕩離心去溶液，加模板重懸液。④取吐溫、氫氧化鈉制備Melt-off溶液；⑤取磁珠100 μl放入EP管內(nèi)，除去液體，加C1磁珠清液混勻，去除上層液，向EP管中加C1磁珠重懸液混勻。⑥樣本放入陽性模板中富集。測序：采用IonPGMTMSequencing Supplies 200 v2試劑盒(來源于Life Tech公司)。①儀器清洗后初始化，W1瓶內(nèi)加氫氧化鈉，W2瓶內(nèi)加測序溶液Ⅱ，W3瓶內(nèi)加測序溶液Ⅲ進行第一階段初始化；根據(jù)機器所示位置將試劑管分別放在標記的G、C、A、T位置行第二階段初始化；②富集產(chǎn)物與質(zhì)控模板混勻后離心，去除上層液，加緩沖液與測序溶液后退火，參數(shù)設(shè)置：第一階段95 ℃、2 min，第二階段37 ℃、2 min，第三階段25 ℃保存。③于服務(wù)器中輸入試劑盒信息，設(shè)置編號，上樣、測序；使用VariantCaller插件分析樣本測序。

1.3 觀察指標

療效評估標準：患者經(jīng)治療后行胸部增強CT或MRI檢查，根據(jù)檢查結(jié)果判斷：影像學檢查顯示病灶消失，且持續(xù)時間≥4周為完全緩解(CR)；病灶長徑相對于首次縮小≥30%表示部分緩解(PR)；病灶長徑縮小<30%或增加不足20%為疾病穩(wěn)定(SD)；病灶長徑較首次檢查增加超過20%，或其他部位有新病灶為疾病進展(PD)。PR與SD代表病情控制，PD代表病情未控制[10]。無進展生存期(PFS)為終末時間與初始時間之差[11]；患者首次就診為初始時間，疾病進展患者發(fā)生死亡時為終末時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 患者BRCA2基因突變情況比較

經(jīng)NGS技術(shù)檢測，BRCA2基因突變12例，突變率為13.48%。不同性別、年齡、吸煙史患者BRCA2基因突變率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，周圍型患者BRCA2基因突變率高于中央型(P<0.05)。見表1。

表1 患者BRCA2基因突變情況比較(例，%)

2.2 患者BRCA2基因突變與一線化療PFS的關(guān)系

患者化療后PR 14例、SD 47例、PD 28例；隨訪結(jié)果顯示，患者中位PFS為4.8個月。單因素顯示，患者性別、年齡、有無吸煙、解剖類型對其PFS無顯著影響(P>0.05)，病情有無控制、BRCA2基因是否突變對PFS有顯著影響(P<0.05)，見表2。

表2 BRCA2基因突變與一線化療PFS的關(guān)系

2.3 BRCA2基因與PFS相關(guān)性分析

經(jīng)Cox回歸分析顯示，一線化療療效、BRCA2基因突變狀態(tài)是患者PFS的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 患者BRCA2基因與PFS的Cox模型分析

3 討論

小細胞肺癌惡性程度高、病情發(fā)展快、預(yù)后差。不同于其他類型腫瘤，小細胞肺癌診斷的前驅(qū)癥狀時間較短，確診后不及時治療，患者生存期不超過3個月[12]。研究顯示，由于患者早期癥狀不典型，大多患者確診時處于廣泛期，有淋巴道或血行轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[13]。手術(shù)切除治療對小細胞肺癌的效果較差，但該腫瘤對放化療具有較高的敏感性。目前治療廣泛性小細胞肺癌的一線化療方案為依托泊苷與鉑類藥物聯(lián)合化療，但部分患者化療過程中易出現(xiàn)不耐受而使疾病無進展[14]。隨著基因檢測技術(shù)不斷發(fā)展，靶向治療為攜帶特定基因突變的肺癌患者重要治療方式[15]。目前基因測序雖能檢測小細胞肺癌大多基因突變，但關(guān)于其基因突變與臨床問題研究相對較少。隨著基因檢測技術(shù)進步與肺癌免疫治療開展，腫瘤基因突變負荷被逐漸了解，是腫瘤基因組外顯子區(qū)域出現(xiàn)非同義突變總數(shù)。BRCA2基因突變在乳腺癌中研究較多，在肺癌中研究較少，目前尚無文獻報道BRCA2基因突變與小細胞肺癌間的關(guān)系[16]。為此，本研究對兩者間的相關(guān)性進行研究。

BRCA2基因位于染色體13q12.3，是由27個外顯子組成，3418個氨基酸組成其編碼蛋白。BRCA2蛋白氨基末端有轉(zhuǎn)錄激活域，中間部分由外顯子11編碼且含有與RAD51結(jié)合的反復序列，其羧基末端有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，有助于促進BRCA2蛋白和單鏈或雙鏈DNA結(jié)合[17]。BRCA突變繼發(fā)功能喪失使正常細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤干細胞或起源細胞，并促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[18]。目前發(fā)現(xiàn)BRCA2基因存在無義突變、缺失突變及移碼突變等1800多種形式，多數(shù)BRCA突變后蛋白質(zhì)產(chǎn)物下降或其功能出現(xiàn)障礙。小細胞肺癌的發(fā)生與吸煙因素有關(guān)，多發(fā)于男性人群，但臨床中仍有小部分患者為女性及不吸煙人群[19]。故探究該部分患者基因突變能進一步認識該類患者相關(guān)特征。通過二代測序檢測基因突變，89例患者中12例有BRCA2基因突變，性別、年齡、吸煙史對BRCA2基因突變率無顯著影響。經(jīng)PFS比較發(fā)現(xiàn)，性別、吸煙等因素與一線化療PFS無相關(guān)性，患者BRCA2基因突變的PFS短于未突變患者；進一步Cox分析顯示，一線化療療效、BRCA2基因突變是影響PFS的獨立危險因素，該結(jié)論與國內(nèi)外研究一致[20-21]。

綜上所述，廣泛期小細胞肺癌患者的BRCA2基因突變是影響其化療PFS的獨立危險因素，NGS技術(shù)檢測基因突變能有效評估患者療效與預(yù)后，在臨床中具有重要意義。