胃癌組織中LC3、ATG5和SATB2-AS1在不同部位表達與臨床病理特征及預后的相關性

袁冬冬 溫艷艷 何慧麗 聶志勇 洪永貴 吳 濤

胃癌(gastric carcinoma，GC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是一種高發(fā)病率、高死亡率的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，起源于胃黏膜上皮，具有早期診斷難、晚期難治療的特征[1-2]。有研究稱胃癌的預后與患者淋巴結轉移、TNM分期、病理類型、腫瘤浸潤深度等有關[3-4]，但是無法在患者早期患病時輕松獲取此類信息，因此需要尋找對胃癌患者的預后做出準確評估的新型生物學標志物。近期有研究發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)生發(fā)展與自噬活性的改變有關，且自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)和自噬相關基因-5(autophagy related gene-5，ATG5)均是參與自噬活性調控的重要基因[5-6]。在多種被發(fā)現(xiàn)的 lncRNAs 中，SATB2 反義RNA 1(SATB2 antisense RNA 1，SATB2-AS1)定位于2q33.1 區(qū)域，為 SATB2 的天然反義 lncRNA，最早被報道為一種在骨肉瘤中發(fā)揮致癌作用的lncRNA，能在體外促進細胞增殖、生長和細胞周期進程[7-8]。因此，本研究探討胃癌組織中LC3、ATG5和SATB2-AS1在不同部位表達與臨床病理特征及預后的相關性，在臨床中具有重要的研究價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年5月至2019年10月本院收治的胃癌患者50例，年齡38～77歲，平均(67.32±7.64)歲。納入標準：①符合《胃癌規(guī)范化診療指南(試行)》[9]中關于胃癌的診斷標準，患者經病理檢查確診為胃癌； ②行根治術或姑息術切除腫瘤，且術前未接受過放化療、免疫治療患者；③所有患者病理組織均可進行免疫組織化學檢測；④患者簽署自愿受試同意書，患者及其家屬需簽署知情同意書。排除標準：①合并其他器官嚴重性病變患者；②合并其他惡性腫瘤患者。

1.2 免疫組化法檢測LC3和ATG5表達

獲取手術完整切除的胃癌組織，經固定、脫水、包埋、切片，由病理科醫(yī)師選定蠟塊。將包埋制作好的組織芯片蠟塊切成3～5 um的薄片，烘片后置于二甲苯中20 min，經無水乙醇、90%、80%、70%梯度乙醇清洗，ddH2O清洗后，3%H2O2溶液浸泡，PBS浸泡后加封閉液37 ℃封閉1 h。PBS浸泡后加一抗，4 ℃孵育過夜。PBS浸泡后加二抗，室溫孵育1 h，PBS浸泡清洗后加DAB顯色。ddH2O漂洗后蘇木精襯染后自來水沖洗玻片，65 ℃烘干后中性樹膠封固。結果判定：應用Dmetrix 掃描系統(tǒng)掃描成數(shù)字切片，采用雙盲法閱片。在低倍鏡(100×)、高倍鏡(400×)下觀察癌周與癌巢部位染色強度，細胞核呈棕黃色顆粒為陽性。根據陽性細胞百分比計分：無陽性細胞數(shù)為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。其中低表達為0～1分，高表達為2～3分。

1.3 RT-PCR檢測SATB2-AS1表達

采用TRIzol提取組織中總RNA，選取500 ng總RNA與2 μl 5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)混勻后進行逆轉錄反應，隨后取擴增產物行qPCR，25 μl反應體系包含TB GreenFast qPCR Mix(2×)12.5 μl、上下游引物各1 μl、DNA模板2 μl和滅菌水8.5 μl，反應條件:預變性95 ℃ 30 s，40個循環(huán)的95 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s，整個qPCR操作于ABI 7300實時熒光定量PCR上完成。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt表示SATB2-AS1的相對表達量。SATB2-AS1上游引物：5'-GAGGAG-CAGGGGGTAGAGAA-3'，下游引物:5'-GTGTCAC-CCAACCTCTCCTG-3'；GAPDH上游引物:5'-GTAT-GACTGGGGGTGTTGGG-3'，下游引物:5'-AGCCACACCATCCTAGTTGC-3。

1.4 隨訪

收集患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑等臨床資料。采用電話及門診或住院復查等方式進行隨訪，了解患者生存情況。隨訪時間截止2021年5月。根據隨訪結果將患者分為死亡組和生存組。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 胃癌中LC3、ATG5和SATB2-AS1在癌周和癌巢表達與臨床病理特征的關系

胃癌中LC3在癌周和癌巢表達與患者腫瘤分化程度、淋巴結轉移情況有關(P<0.05)；ATG5在癌周表達與患者腫瘤分化程度、腫瘤分期有關(P<0.05)，ATG5在癌巢表達與腫瘤分化程度、腫瘤分期和淋巴結轉移情況有關(P<0.05)；SATB2-AS1在癌周表達與患者腫瘤分化程度、腫瘤最大直徑有關(P<0.05)，SATB2-AS1在癌巢表達與患者腫瘤分化程度、腫瘤最大直徑和臨床分期有關(P<0.05)。見表1～3。

表1 胃癌中LC3在癌周和癌巢表達與臨床病理特征的關系

表2 胃癌ATG5在癌周和癌巢表達與臨床病理特征的關系

表3 胃癌中SATB2-AS1在癌周和癌巢表達與臨床病理特征的關系

2.2 影響胃癌患者預后的單因素分析

隨訪至2021年5月，50例患者死亡23例。單因素分析發(fā)現(xiàn)分化程度、淋巴結遠處轉移、癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表達是影響胃癌預后的因素(P<0.05)，見表 4。

表4 影響胃癌患者預后的單因素分析/例

2.3 影響胃癌患者預后的多因素分析

多因素分析顯示腫瘤分化程度、淋巴結遠處轉移、癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表達是影響胃癌預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表5。

表5 影響胃癌患者預后的多因素分析

3 討論

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)生率與死亡率分別位居全球第5位與第3位[10]。我國胃癌發(fā)病率與死亡率僅次于肺癌，居第2位，是造成社會負擔的重要因素，多數(shù)患者因中晚期胃癌就診[11-12]。胃癌的主要臨床表現(xiàn)為遠期生存狀況低下、臨床治療效果差，且具有易復發(fā)、易轉移的特點[13]。盡管近年來晚期胃癌患者手術及放化療方案不斷發(fā)展，但是5年生存率仍然較低[14]。針對表皮生長因子受體、c-met等藥物正在進行臨床試驗，但是胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步驟的復雜過程，在胃癌中的應用存在局限性[15-16]。另外關于胃癌發(fā)生發(fā)展和轉移的分子機制尚不清楚，因此探討胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移及復發(fā)等過程的作用機制，尋找新的預后指標是目前臨床研究亟待解決的問題。

LC3 是酵母 Atg8p 的哺乳動物同源物，被認為是自噬體的重要組成部分[17]，包括 LC3A、LC3B、LC3C 3種同工型，其中 LC3B 與自噬水平相關[18]。LC3 已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤包括卵巢癌、腦癌、結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤中異常表達[19-20]。LC3 表達與FIGO 分期相關[21]。 LC3 表達與血管浸潤顯著相關；高 LC3 表達表明總體生存率 (OS) 較差[22-23]。ATG5是一種重要的自噬體形成相關蛋白，在真核細胞中充當 E1 樣激活酶[24]。ATG5 已被證明在病毒感染、腫瘤細胞凋亡和腫瘤增殖中起到重要作用，有望成為臨床癌癥治療的新靶點[25-26]。LncRNA 是一類長度大于 200 個核苷酸且沒有蛋白質編碼能力的轉錄子[27]。越來越多的研究數(shù)據表明，lncRNAs是基因表達的重要調節(jié)因子，參與多種生理和病理過程，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[28]。有研究發(fā)現(xiàn)了一種新的 lncRNA，SATB2-AS1在結直腸癌中的表達水平顯著降低，并且與結直腸癌的預后相關[29]。有研究發(fā)現(xiàn)SATB2-AS1可以抑制結直腸癌轉移并調節(jié)結直腸癌細胞中TH1型趨化因子的分泌[30]。本研究發(fā)現(xiàn)雖然癌周組織中LC3、ATG5和SATB2-AS1的表達和患者的預后不存在相關性，但與臨床病理特征有關，提示癌周組織中LC3、ATG5和SATB2-AS1表達參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。本研究中癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表達與患者預后存在相關，即高表達的患者的生存率更低，癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表達是影響胃癌預后的獨立危險因素，提示癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表達有潛力成為預測胃癌患者預后的生物標志物，但其中具體作用機制尚不明確，潛在的原因還需進一步試驗數(shù)據來驗證。

綜上所述，本研究胃癌癌周和癌巢組織中LC3、ATG5和SATB2-AS1表達與臨床病理特征存在相關性，癌巢組織LC3、ATG5和SATB2-AS1表達可作為預測胃癌患者預后的生物標志物。