針對SARS-CoV-2核衣殼蛋白的單克隆抗體的制備和鑒定

徐雙媛，劉 鈞，曹李妍，丁睿清，尚月月，康喜龍,3，顧 丹,3，焦新安,3，潘志明,3，孟 闖,3

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)自2020年起已呈全球大流行狀態(tài)，對經(jīng)濟發(fā)展和人類生命健康造成了重大威脅[1]。SARS-CoV-2是一種β-冠狀病毒屬的正鏈RNA病毒，基因組全長約30 kb，其與SARS-CoV相似性約80%，與中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV)相似性約50%[2]。SARS-CoV和MERS-CoV曾引起了大范圍流行傳播，感染后死亡率較高，分別為9%和26.6%～59.4%，SARS-CoV-2導致的死亡率有所降低，但傳染性更強，危害更嚴重[3-5]。SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)主要編碼刺突蛋白(Spike,S)、膜蛋白(Membrane,M)、包膜蛋白(Envelope,E)和核衣殼蛋白(Nucleocapsid,N) 4種結(jié)構(gòu)蛋白。其中，N蛋白含量最豐富，位于病毒內(nèi)部，在病毒顆粒組裝時與病毒RNA結(jié)合形成螺旋核衣殼，保護病毒基因組。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的 N蛋白參與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復制、病毒基因組的包裝，還可抑制宿主細胞干擾素產(chǎn)生、肌動蛋白重組和細胞凋亡[6-9]。Wang等[10]評估發(fā)現(xiàn)病人血漿中SARS-CoV-2 N蛋白的濃度與疾病嚴重程度相關(guān)，表明該蛋白是潛在檢測靶標。SARS-CoV-2 的N蛋白單克隆抗體的研制是建立免疫學檢測方法的重要基礎(chǔ)。

本研究通過大腸桿菌系統(tǒng)制備SARS-CoV-2重組N蛋白，利用B細胞雜交瘤技術(shù)制備了N蛋白特異性單克隆抗體，并通過間接免疫熒光試驗和間接ELISA分析了其對不同來源SARS-CoV-2 N蛋白的反應性和用于SARS-CoV-2檢測的潛能，為下一步研究提供了重要基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞及實驗動物 pGEX-6P-1質(zhì)粒、pET-28a質(zhì)粒、HEK-293T細胞、骨髓瘤細胞SP2/0由江蘇省人獸共患病學重點實驗室保存。6～8周齡、9～10周齡雌性BALB/c小鼠以及6～8周齡雌性ICR小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心。實驗動物操作符合揚州大學實驗動物倫理委員會規(guī)定(倫理審查編號：202102101)。

1.3 目的序列的擴增和重組載體的構(gòu)建 參考NCBI中SARS-CoV-2 N的全長基因序列(Gene ID:43740575)，合成DNA片段作為PCR模板，同時利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物。引物序列如表1所示，下劃線部分為同源臂序列，引物由擎科生物科技有限公司合成，DNA模板由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成，PCR反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；72 ℃ 5 min。將pET-28a載體質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，pGEX-6P-1載體質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，與純化后的PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，進行菌落PCR和測序篩選鑒定陽性重組質(zhì)粒，命名為pET-28a-N、pGEX-6P-1-N。

表1 N目的基因原核和真核表達質(zhì)粒構(gòu)建PCR擴增引物Tab.1 PCR amplification primers for prokaryotic and eukaryotic N target gene expression plasmids

1.4 重組蛋白的表達和純化 將pET-28a-N、pGEX-6P-1-N重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞獲得重組菌BL21(DE3)-pET-28a-N和BL21(DE3)-pGEX-6P-1-N，接種至含相應抗性的液體LB培養(yǎng)基，加入工作濃度為0.4 mmol/L的IPTG進行誘導表達，其中BL21(DE3)-pET-28a-N于37 ℃振蕩培養(yǎng)5 h，BL21(DE3)-pGEX-6P-1-N于15 ℃振蕩培養(yǎng)16 h；離心收集菌體進行超聲裂解(30 Hz，超聲3 s暫停5 s)，裂解物于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達情況。取可溶性表達的His-N和GST-N裂解上清液，分別利用Ni2+親和層析、GST標簽蛋白純化柱進行純化，SDS-PAGE和BCA蛋白濃度測定試劑盒分析純化蛋白的純度和濃度。

1.5 重組蛋白的Western blot鑒定 分別將純化的His-N、GST-N重組蛋白和空載體對照進行SDS-PAGE，使用Pyxis Protein Transfer Stack試劑盒快速轉(zhuǎn)印NC膜，含5%脫脂奶的PBST室溫封閉2 h，PBST洗滌3次，分別加入1∶5 000稀釋的抗His、抗GST標簽蛋白單抗或1∶500稀釋的健康人陽性血清(接種新冠病毒滅活疫苗)和陰性血清，4 ℃過夜孵育，分別加入1∶5 000稀釋的羊抗鼠-HRP、羊抗人IgG-HRP二抗，室溫孵育2 h，PBST洗滌6次，BeyoECL Star顯色液顯色，超靈敏多功能成像儀觀察并保存結(jié)果。

1.6 小鼠免疫與間接ELISA方法的建立 以His-N為免疫原，皮下多點免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，80 μg/只，第1次免疫以弗氏完全佐劑，第2和3次用弗氏不完全佐劑乳化蛋白，每次免疫間隔2周。第3次免疫7 d后，對小鼠進行眼眶靜脈采血，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清，測定小鼠血清中抗體的效價，選擇效價最高的小鼠，腹腔注射80 μg蛋白進行加強免疫，3 d后按常規(guī)細胞融合方法進行融合[11]。以純化的GST-N蛋白作為檢測原，利用方陣試驗確定最佳蛋白包被濃度和樣品稀釋倍數(shù)，建立用于檢測抗體效價的間接ELISA方法，具體步驟參考文獻[12]進行。

1.7 陽性雜交瘤細胞的篩選與鑒定 以1.6建立的間接ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中抗體的效價，篩選陽性雜交瘤細胞，通過有限稀釋法進一步純化，選取效價高的陽性雜交瘤細胞腹腔注射10周齡的BALB/c小鼠，體內(nèi)誘生法制備單抗腹水[12]。將采集好的腹水送去南京金斯瑞生物科技有限公司進行純化，利用間接ELISA方法測定腹水效價和親和力，親和力測定公式:K=([Ag′]/[Ag]t-1)/2(n[Ab′]-[Ab]t)，其中：[Ab′]表示抗原濃度為[Ag′]時OD=1/2 ODmax對應的抗體摩爾濃度，[Ab]t表示抗原濃度為[Ag]t時OD=1/2 ODmax對應的抗體摩爾濃度，n為抗原[Ag′]與[Ag]t間的稀釋倍數(shù)。使用鼠源單克隆抗體亞類鑒定試劑盒(Sigma)測定單抗體亞類。

1.8 單抗的Western blot分析 取純化的His-N、GST-N重組蛋白和空載體對照進行SDS-PAGE，以1∶5 000稀釋的11F4單抗純化后腹水抗體作為一抗，加入1∶5 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP作為二抗，Western blot分析單抗特異性識別重組蛋白的能力，具體操作步驟同1.5。

1.9 間接免疫熒光試驗分析單抗反應性

1.9.1 真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)表1中列出的引物，通過PCR分別擴增SARS-CoV-2、SARS-CoV及傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis virus,IBV)N蛋白目的片段，PCR擴增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；72 ℃ 5 min，應用DNA膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。以限制性核酸內(nèi)切酶SalⅠ和NotⅠ對pCMV-Myc載體質(zhì)粒進行雙酶切，用ClonExpress One Step Cloning一步法連接試劑盒連接目的片段與載體，構(gòu)建重組載體，測序驗證后將陽性重組質(zhì)粒分別命名為pCMV-SARS-CoV-2-N、pCMV-SARS-CoV-N以及pCMV-IBV-N。

1.9.2 間接免疫熒光試驗 將HEK-293T細胞以2×105個/孔置于24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)約16 h，使用LipofectamineTM2000分別將重組的真核表達質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)染細胞，具體操作按照說明書要求進行。轉(zhuǎn)染24 h后進行間接免疫熒光試驗，用冰甲醇固定細胞，含5% BSA的PBST封閉2 h，依次加入1∶100稀釋的單抗細胞上清、1∶1 000稀釋的羊抗鼠IgG-FITC作為一抗和二抗，同時使用His-N蛋白免疫后的小鼠多抗血清作為陽性對照，進行間接免疫熒光試驗，于熒光顯微鏡下觀察細胞中的熒光強度并拍照保存。

1.10 間接ELISA檢測不同冠狀病毒N蛋白 以商品化SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E重組N蛋白為包被抗原，以1 μg/mL包被于ELISA板，以1∶10 000稀釋的11F4單抗純化腹水為一抗，同時設(shè)立小鼠血清作為陽性對照和PBS作為陰性對照，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌5遍，加入1∶5 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌7遍，TMB顯色，酶標儀檢測OD450值。

2 結(jié) 果

2.1 目的片段與表達載體的鑒定 N基因目的片段的PCR擴增結(jié)果如圖1，在約1 260 bp處均存在清晰單一的條帶，結(jié)果符合預期值，結(jié)合重組表達質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果與測序分析，說明目的片段的擴增和表達載體的構(gòu)建正確。

M:DL2000 DNA marker;1-3:pET-28a-N;4-7:pGEX-6P-1-N圖1 N基因目的片段的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of the target N gene

2.2 重組N蛋白的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE分析重組蛋白His-N(圖2A)和GST-N(圖2B)的表達和純化情況，結(jié)果表明2種蛋白均主要以可溶性形式在上清中大量表達，大小與理論分子量相符。BCA蛋白試劑盒測定純化His-N蛋白濃度為3.55 mg/mL，GST-N蛋白濃度為1.15 mg/mL。

M:蛋白marker;1:BL21(DE3)-pET-28a 空載體對照;2:BL21(DE3)-pET-28a-N 誘導后上清;3:BL21(DE3)-pET-28a-N 誘導后沉淀;4:純化后His-N 蛋白;5:BL21(DE3)-pGEX-6P-1空載體對照;6:BL21(DE3)-pGEX-6P-1-N 誘導后上清;7:BL21(DE3)-pGEX-6P-1-N誘導后沉淀;8:純化后GST-N 蛋白圖2 重組His-N(A)和重組GST-N(B)蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant His-N (A) and recombinant GST-N (B) proteins

2.3 重組N蛋白的Western blot分析 使用抗His、GST標簽蛋白單抗對重組蛋白進行Western blot分析，His-N(圖3A)和GST-N(圖3B)分別在53 kD，73 kD處出現(xiàn)符合預期大小的單一條帶，表明純化的蛋白純度較高。進一步使用接種新冠病毒滅活疫苗的人陽性血清以及未接種疫苗的陰性血清作為一抗進行Western blot分析，結(jié)果顯示，His-N(圖4A)和GST-N(圖4B)與人血清中的天然抗體具有良好的反應性，其大小符合預期，表明重組蛋白作為SARS-CoV-2天然N蛋白替代物的可行性。

M:蛋白marker;1:BL21(DE3)-pET-28a 空載體對照;2:純化后 His-N蛋白;3:BL21(DE3)-pGEX-6P-1 空載體對照;4:純化后 GST-N蛋白圖3 抗標簽蛋白單抗鑒定重組蛋白His-N(A)和GST-N(B)Fig.3 Identification of His-N (A) and GST-N (B) with mAbs to tag proteins

M:蛋白marker;1,3:BL21(DE3)-pET-28a 空載體對照;2,4:純化后His-N protein;5,7:BL21(DE3)-pGEX-6P-1空載體對照;6,8:純化后GST-N蛋白;1,2,5,6：一抗為人陽性血清;3,4,7,8：一抗為人陰性血清圖4 人血清鑒定重組蛋白His-N(A)和GST-N(B)Fig.4 Identification of His-N (A) and GST-N (B) with human serum

2.4 N蛋白單克隆抗體的制備 利用有限稀釋法將保持陽性的雜交瘤細胞亞克隆，獲得了1株穩(wěn)定分泌抗N重組蛋白單抗的雜交瘤細胞株，并命名為11F4。利用小鼠單抗亞類鑒定試劑盒測定11F4單抗的亞型為IgG1，通過間接ELISA方法測其細胞上清、腹水效價和親和力分別為2.0×104、2.0×107以上和4.44×108M-1。

2.5 單抗的Western blot分析 以11F4單抗純化后腹水為一抗，Western blot分析其與重組蛋白His-N、GST-N以及空載體對照的反應性，結(jié)果如圖5所示。單抗對重組His-N、GST-N蛋白表現(xiàn)出良好的反應性，出現(xiàn)與預期大小一致的單一條帶，而與空載體對照均無反應性，表明制備的單抗具有良好的特異性。

M:蛋白 marker;1:BL21(DE3)-pET-28a 空載體對照;2:純化后His-N蛋白;3:BL21(DE3)-pGEX-6P-1 空載體對照;4:純化后GST-N蛋白圖5 11F4單抗的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of 11F4 mAb

2.6 單抗的間接免疫熒光分析 通過間接免疫熒光試驗分析單抗與HEK-293T細胞表達的SARS-CoV-2 N蛋白的特異性反應。首先構(gòu)建了SARS-CoV-2、SARS-CoV及IBV的N基因真核表達質(zhì)粒，結(jié)合PCR鑒定結(jié)果和測序分析表明重組質(zhì)粒的構(gòu)建正確。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，以11F4單抗細胞上清和小鼠陽性血清為一抗進行間接免疫熒光試驗。結(jié)果如圖6所示，SARS-CoV-2-N轉(zhuǎn)染組胞漿中產(chǎn)生大量熒光斑點，SARS-CoV-N轉(zhuǎn)染組有少量熒光斑點，而IBV-N轉(zhuǎn)染組和空載體對照組無熒光，顯示11F4單抗能特異性結(jié)合真核表達的SARS-CoV-2 N蛋白。

圖6 間接免疫熒光分析11F4單抗與真核表達N蛋白的反應性(10×)Fig.6 Indirect immunofluorescence analysis of 11F4 mAb to eukaryotically expressed N proteins(10×)

2.7 單抗在不同冠狀病毒N蛋白檢測中的應用 利用間接ELISA方法進一步分析11F4單抗在不同冠狀病毒中N蛋白檢測中的應用潛力。以SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV及HCoV-229E重組N蛋白作為包被原，11F4單抗抗體為一抗進行間接ELISA檢測。結(jié)果如圖7所示，11F4單抗與SARS-CoV-2 N蛋白表現(xiàn)出強陽性反應，與SARS-CoV的N蛋白呈弱陽性反應(OD450約為0.5)，而不與MERS-CoV、HCoV-229E的N蛋白反應，顯示11F4單抗具備特異性識別SARS-CoV-2 重組N蛋白的能力，具備用于SARS-CoV-2檢測的潛能。

圖7 間接ELISA分析11F4單抗在不同冠狀病毒中的應用Fig.7 Indirect ELISA analysis of the application of 11F4 mAbs to different coronaviruses

3 討 論

SARS-CoV-2具有高傳染性、高致病性的特點，截至2022年5月11日全球累計約5.1億確診病例，其中625萬人死亡，是嚴重的全球性健康威脅[13]。SARS-CoV-2基因突變率高，已出現(xiàn)很多變異株，其中Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron是發(fā)生大范圍傳播的主要變異株。不同SARS-CoV-2變異株主要在S蛋白上發(fā)生多個錯義突變，而N蛋白基因序列相對更保守。Surjit等[14]分析不同患者樣本發(fā)現(xiàn)N蛋白基因序列的變異最小，筆者對主要變異株N蛋白序列(包括Omicron株)的相似性進行了分析，確認了N蛋白的高度保守性。Omicron變異株目前占主導地位，相比其他變異株傳播速度更快，相比Delta變異株的臨床病死率更高，顯示其致病性并不低，特別是對于高齡和未接種疫苗等高危人群[15-17]。新型冠狀病毒肺炎疫情形勢仍舊嚴峻，無癥狀感染者的存在進一步加大了SARS-CoV-2追蹤的難度，快速靈敏的檢測方法對精準發(fā)現(xiàn)傳染源、有效控制擴散十分重要[18]。目前，實時熒光定量PCR仍然是SARS-CoV-2檢測的“金標準”方法，但需要專門的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，檢測結(jié)果易受各種因素影響[19]。利用單克隆抗體的抗原/抗體的檢測已成為SARS-CoV-2快速篩查、回溯分析以及免疫應答評價的有效工具。SARS-CoV-2不同變異株N蛋白的高度保守性，進一步彰顯了其在檢測中的重要應用潛力。

SARS-CoV-2的 N蛋白在病毒的復制中起重要作用，感染早期患者的血液中即存在高水平的N蛋白[20]。N蛋白具有良好的免疫原性，感染后7 d產(chǎn)生IgM抗體，感染后7～14 d可檢測到IgG，抗體出現(xiàn)時間早且持續(xù)時間長[21-23]。N蛋白及其特異性抗體，均是SARS-CoV-2感染的重要檢測靶標。研究顯示，針對SARS-CoV-2以及SARS-CoV的 N蛋白抗體的檢測相比S蛋白均表現(xiàn)出更高的敏感性[24]。本研究利用大腸桿菌系統(tǒng)構(gòu)建SARS-CoV-2的N蛋白重組表達菌，經(jīng)誘導表達和純化獲得大量可溶性重組N蛋白。Western blot分析顯示該蛋白與接種SARS-CoV-2滅活疫苗的人血清中天然抗體呈特異性反應，顯示出良好的免疫反應性，表明原核表達的重組N蛋白能用于SARS-CoV-2感染的血清學檢測。國內(nèi)也有學者通過大腸桿菌系統(tǒng)制備了SARS-CoV-2重組N蛋白，免疫小鼠獲得的多抗血清能特異性結(jié)合HEK-293T細胞表達的 N蛋白，表明原核表達N蛋白用于制備N蛋白單克隆抗體的可行性[25]?；诖?，本研究進一步利用制備的重組N蛋白作為免疫原，通過B細胞雜交瘤技術(shù)篩選鑒定了一株特異性識別SARS-CoV-2重組N蛋白的單克隆抗體11F4，其親和力、腹水效價較高。

通過比較其他冠狀病毒與SARS-CoV-2的N蛋白氨基酸序列的相似性發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、IBV的相似性較高，分別達89%、54%、38%和42%，可能會對基于N蛋白的SARS-CoV-2檢測造成較大非特異性干擾[26]。此外，大腸桿菌表達系統(tǒng)由于缺乏翻譯后修飾功能，其表達的蛋白相比真核細胞表達系統(tǒng)與天然蛋白的構(gòu)象差異更大。因此，本研究進一步分析了11F4單抗特異性識別不同表達系統(tǒng)表達的SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E和IBV的 N蛋白的能力。間接免疫熒光試驗結(jié)果表明，11F4單抗與真核細胞表達SARS-CoV-2的N蛋白有良好反應性，而與IBV的 N蛋白無任何交叉反應，表明11F4單抗特異性和免疫反應性良好。進一步利用11F4單抗檢測了不同冠狀病毒N蛋白，其能特異性識別細胞表達及體外制備SARS-CoV-2的N蛋白，顯示出與天然SARS-CoV-2的 N蛋白特異性反應的潛能。間接免疫熒光試驗和間接ELISA結(jié)果均顯示，11F4單抗與SARS-CoV的N蛋白也呈現(xiàn)弱陽性反應。研究顯示，SARS-CoV-2與SARS-CoV 的N蛋白氨基酸序列相似性約為90%，都有類似的內(nèi)在無序區(qū)和保守結(jié)構(gòu)區(qū)模塊化結(jié)構(gòu)[27]，表明兩種蛋白之間存在較多的共同表位，使11F4單抗出現(xiàn)了交叉反應。很多研究也發(fā)現(xiàn)了不同單抗對SARS-CoV-2和SARS-CoV抗原的交叉反應性。Dai等利用SARS-CoV-2的全長N蛋白可與感染SARS-CoV的患者血清發(fā)生交叉反應，而將N蛋白截短后減少了非特異性反應且檢測敏感性不變[28]?？筍ARS-CoV單抗CR3022可與SARS-CoV-2 RBD相結(jié)合，并識別與ACE2結(jié)合位點不同的表位[29]?；謴推赟ARS患者的血清可減少S蛋白介導的SARS-CoV-2進入靶細胞并交叉中和SARS-CoV-2的感染[30]。考慮到SARS-CoV的流行現(xiàn)狀，11F4單抗的這一交叉反應性不會對其用于SARS-CoV-2的檢測造成干擾。相比肖琦等[31]的研究，本研究進一步分析了11F4單抗對真核表達SARS-CoV-2的 N蛋白特異性識別能力及與其他冠狀病毒的交叉反應性，并初步明確其用于SARS-CoV-2特異性檢測的潛能。

本研究成功制備了SARS-CoV-2 的N蛋白特異性單克隆抗體，其對天然SARS-CoV-2的 N蛋白具有良好的特異性識別能力，與其他冠狀病毒N蛋白無交叉反應，具備特異性檢測SARS-CoV-2的潛能，為下一步應用研究提供了重要基礎(chǔ)材料。

利益沖突：無