靶向GPCRs的藥物篩選方法

孟慶余，高永靜

G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR）是一類 7-次跨膜蛋白，參與介導多種重要的生理功能，是暢銷藥物中占比最高和最成功的靶點之一。幾十年來，靶向GPCR 的藥物研發(fā)一直是學術界和制藥界的熱門焦點，這些已發(fā)現(xiàn)并批準使用的 GPCR 藥物為多種人類疾病的治療提供了可能性，包括癌癥、病毒感染、炎癥性疾病和代謝性疾病等，例如艾塞那肽、利拉魯肽、利西拉肽和阿比魯肽等靶向胰高血糖素樣肽 1 受體的肽類藥物已用于 2 型糖尿病的治療[1]；靶向鈣敏感受體的變構調(diào)節(jié)劑西那卡塞已批準用于甲狀旁腺功能亢進治療[2]。

目前，一些基于熒光或化學發(fā)光檢測的功能性分析試劑盒已商品化，便于 GPCR 藥物篩選開發(fā)。然而，就研發(fā)新藥而言，現(xiàn)有技術的高投資和低產(chǎn)出的矛盾凸顯出對更高效的藥物篩選方法的需求。傳統(tǒng)的 GPCR 藥物篩選技術通常是基于放射性的競爭結合分析，不僅價格昂貴而且有害健康。目前，盡管已經(jīng)有多種靶向 GPCR 藥物開發(fā)成功的案例，但是該類藥物多數(shù)仍呈現(xiàn)出一定的毒副作用，并且尚有超過 100 種孤兒 GPCRs（oGPCRs）的配體未知。因此，開發(fā)新的靶向 GPCR 的藥物需要更經(jīng)濟高效的藥物篩選方法，這無疑是未來藥物發(fā)現(xiàn)工作的新挑戰(zhàn)。在過去幾十年中，為了發(fā)現(xiàn)更精準和全面的 GPCR 靶向藥物，人們一直致力于開發(fā)基于細胞水平的信號依賴性的分析方法，這些策略的開發(fā)為藥物發(fā)現(xiàn)提供了重要平臺。近年來，由于受體藥理學的進展、結構生物學的突破和生物技術的創(chuàng)新，GPCR藥物發(fā)現(xiàn)的新途徑相繼出現(xiàn)，包括高內(nèi)涵成像技術、3D 晶體學藥理分析技術以及虛擬篩選等。在多種靶向 GPCR 藥物高通量篩選（high throughput screening，HTS）的技術中選擇合理的篩選策略對于獲得高效、高特異性和低毒性的靶向藥物至關重要。

本綜述總結了使用最廣泛的 GPCR 檢測方法及其優(yōu)缺點以及用于 GPCR 藥物發(fā)現(xiàn)的 HTS 技術的最新進展。

1 GPCRs 及其信號通路

GPCRs 也稱為 7-次跨膜螺旋（7TM）受體，是人類膜蛋白中一類最大的受體超家族，大約 800 個成員，可感知包括光、氣味、味道、激素和神經(jīng)遞質在內(nèi)的多種細胞外信號[3]，在生理學和病理學方面發(fā)揮關鍵的功能。研究表明，大約 40% 的臨床批準藥物靶向 GPCRs[4]。因此，了解GPCR 的信號機制對于更好地開發(fā) GPCR 靶向藥物至關重要。

GPCR 通過與異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結合調(diào)節(jié)蛋白（G 蛋白）偶聯(lián)[5]。異源三聚體 G 蛋白由 α、β 和 γ 亞基組成，在基礎狀態(tài)下，Gα 被二磷酸鳥苷（GDP）占據(jù)，激動劑激活受體后，導致 GDP 與三磷酸鳥苷（GTP）交換，隨后 Gα 亞單位與 Gβγ 亞單位分離，分別與下游效應蛋白相互作用，繼而引發(fā)一系列級聯(lián)反應，完成跨膜信號轉導[6]。根據(jù)其下游功能和序列，Gα 亞基分為四個家族：Gαs（Gαs和 Gαolf）、Gαi/o（Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo、Gαt1、Gαt2、Gαt3 和 Gαz）、Gαq/11（Gαq、Gα11、Gα14 和 Gα16）和Gα12/13（Gα12 和 Gα13）[7]（圖1）。一個受體可與多個G 蛋白亞型偶聯(lián)。

圖1 GPCRs 偶聯(lián)不同類型 G 蛋白信號通路示意圖（Gα 亞基可分為 Gαs、Gαi/o、Gαq/11 和 Gα12/13，在配體結合后，GPCR 改變其構象并激活偶聯(lián)的 G 蛋白，隨后通過下游效應器促進相應第二信使和報告基因的產(chǎn)生。圖中紅色字體表示常用 HTS 分析的檢測點，包括 cAMP 檢測、Ca2+ 通道檢測和報告基因分析）

GPCR 的典型信號通路是通過激活位于細胞表面的受體，將細胞外化學信號傳遞到胞內(nèi)。目前的研究表明，GPCRs主要通過兩條途徑介導和調(diào)節(jié)生理功能：G 蛋白途徑和β-arrestin 途徑。傳統(tǒng) GPCR 激動劑與受體結合后激活 G蛋白信號通路，而 β-arrestin 偏好配體則主要激活β-arrestin 通路[8-9]。Gαs 和 Gαi/o 蛋白偶聯(lián)信號通路作用于腺苷酸環(huán)化酶（AC）從而催化 ATP 轉化為環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）。與 Gαs 蛋白偶聯(lián)的受體直接激活該過程，促進 cAMP 的產(chǎn)生；而與 Gαi/o蛋白偶聯(lián)的受體則抑制 AC 產(chǎn)生 cAMP。因此，與 Gαs 結合的 GPCR 可以抵消與 Gαi/o 結合的 GPCR 產(chǎn)生的效應，反之亦然。細胞質中 cAMP 的含量對生理病理條件下的多種離子通道的開放和絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶 A（PKA）家族成員的激活狀態(tài)起著關鍵的作用。cAMP 被認為是第二信使，PKA 是第二效應器[10-11]。Gαq/11 通路的效應物是磷脂酶 C-β（PLCβ），它催化膜結合的 4,5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）裂解為 1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―AG），IP3 作用于內(nèi)質網(wǎng)（ER）膜上的 IP3 受體，促進內(nèi)質網(wǎng)釋放 Ca2+，而 DAG 沿質膜擴散并激活膜的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶 C（PKC）結合部分[12-14]。

β-arrestin 是細胞中重要的調(diào)節(jié)蛋白，包括 β-arrestin 1和 β-arrestin 2，在持續(xù)激動劑刺激的情況下，GPCR 被特異性 GPCR 激酶（G protein-coupled receptor kinases，GRK）磷酸化，β-arrestins 招募到磷酸化 GPCR 使受體與 G 蛋白解偶聯(lián)，并將受體靶向網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞囊泡，最終終止 G蛋白信號傳導[15]。β-arrestin 募集是一種普遍存在的 GPCR信號負調(diào)控機制，在幾乎所有 GPCR 通路中已經(jīng)得到證實[16]，并且該途徑是 G 蛋白非依賴性的，可以通過偏倚配體獨立地進行藥理學調(diào)節(jié)[17]，這可能為 GPCR 信號的功能選擇性（偏倚激活）以及 GPCR 藥物開發(fā)提供了一種新的、通用的、與 G 蛋白無關的方法。這種分析對于篩選 Gαi 偶聯(lián)的 GPCR 和孤兒 GPCR 特別有利。此外，β-arrestins 不僅可以阻斷 G 蛋白信號轉導，而且在 GPCRs 的脫敏、內(nèi)化、復合致敏、細胞增殖反應和基因轉錄等方面都發(fā)揮重要作用[8,18]。

除了上述作用途徑，GPCR 可以從細胞內(nèi)部或在內(nèi)化過程中的任意時間段內(nèi)發(fā)出傳遞信號[18-19]。原則上，通過改變配體的物理化學性質，可以改變其在細胞上和細胞內(nèi)的分布[20]。是否可以通過藥物干預來控制內(nèi)化和再循環(huán)/降解的速度還有待研究。

2 GPCRs 藥物篩選技術發(fā)展歷程及功能分析平臺

鑒于 GPCR 在正常生理狀態(tài)和疾病中的重要性，以及它們通過使用小分子作為調(diào)節(jié)因子進行治療干預的潛力，GPCR 是目前市場上最大的藥物治療靶點家族，每年的利潤在數(shù)十億美元[21]。然而現(xiàn)有的藥物篩選技術仍然不同程度地限制了 GPCR 靶點藥物的開發(fā)，因此，GPCR 相關檢測方法和配體的篩選一直處于研究和發(fā)展階段。GPCR 高通量藥物篩選技術的發(fā)展歷程主要包括傳統(tǒng)的經(jīng)典途徑和近年來發(fā)現(xiàn)的新途徑。傳統(tǒng)的經(jīng)典靶向通路涉及機制較單一，測量方法局限于一維層面。最早應用于 GPCR 藥物研究的方法是放射性配基結合技術。1970年，Lefkowitz 等[22]使用放射性標記的激素進行了第一次放射性配基結合實驗，以確定其受體的結合親和力。從那時起，3H 或125I 標記的配體開始廣泛用于表征化合物對靶 GPCR 的親和力。然而由于放射性配基標記繁雜、價格昂貴、并且需要復雜的清洗和過濾步驟，導致了其他替代技術的產(chǎn)生，包括依賴于檢測G 蛋白介導的第二信使的經(jīng)典途徑，例如 cAMP 檢測技術、基于鈣流的熒光成像讀片器（fluorometric imaging plate reader，F(xiàn)LIPR）技術、基于共振能量轉移的福斯特熒光共振能量轉移（f?rster resonance energy transfer，F(xiàn)RET）和生物發(fā)光共振能量轉移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET）技術，以及 G 蛋白非依賴性檢測途徑——β-arrestin 的募集實驗等。此外，對相關報告基因的檢測也已廣泛使用[23]。這些基于熒光或化學發(fā)光檢測的功能性分析試劑盒可以從公司購買。

為使篩選方法更可行、篩選結果更準確，GPCR 藥物篩選技術的新方法正在逐步更新和開發(fā)，并且用于 GPCR的藥物篩選工具也更加先進。近年來，出現(xiàn)了多種 GPCR藥物開發(fā)的新途徑，包括熒光素酶雙亞基系統(tǒng)、高內(nèi)涵篩選技術、無標簽全細胞分析技術以及虛擬篩選等（表1）。

表1 GPCR 篩選技術總結

2.1 cAMP 檢測法

cAMP 由 ATP 生成，是介導神經(jīng)遞質、激素和藥物參與多種生理反應的最重要的第二信使之一，也是 GPCR 藥物研發(fā)途徑中的重要一環(huán)。如前所述，與 Gαs 和 Gαi/o 蛋白偶聯(lián)的 GPCR 分別激活或抑制腺苷酸環(huán)化酶，從而增加或降低 cAMP 水平。

cAMP 水平通常使用競爭法測量，例如 LANCE cAMP和 HTRF-cAMP 檢測試劑盒。LANCE cAMP 試劑盒是一種均相時間分辨熒光能量轉移（TR-FRET）免疫測定法。該測定基于銪標記的 cAMP 示蹤劑復合物和樣品 cAMP 競爭 Alexa Fluor 647 染料標記的 cAMP 特異性抗體上的結合位點。銪標記的 cAMP 示蹤劑復合物是由生物素化-cAMP和 Eu-鏈霉親和素之間的緊密相互作用形成的。當抗體與Eu-鏈霉親和素/生物素-cAMP 示蹤劑結合時，340 nm 的光脈沖激發(fā)示蹤劑的銪螯合物分子，導致能量轉移到熒光團，熒光團可在 665 nm 處發(fā)光。因此，測試樣本中的 cAMP水平越高，競爭水平越高，發(fā)出的信號越低，反之亦然（圖2）[24-25]。HTRF-cAMP 的檢測原理是基于均相時間分辨熒光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）技術，該方法是由細胞產(chǎn)生的天然 cAMP 與修飾的別藻藍蛋白染料標記的 cAMP 之間的競爭性免疫測定。cAMP 檢測法可用于高通量藥物發(fā)現(xiàn)，靈敏度高，但受限于需要清楚偶聯(lián)機制，不利于篩選 oGPCR 的激動劑或拮抗劑。在cAMP 分析中，篩查 Gs 偶聯(lián)受體通常較簡單，而篩查 Gi/o偶聯(lián)受體則困難得多。

圖2 LANCE cAMP 競爭法測定原理[A：在胞內(nèi)待測 cAMP 不充足的情況下，Eu 標記的 cAMP 探針與抗 cAMP 特異性抗體結合，340 nm 的光脈沖激發(fā)示蹤劑的銪螯合物分子，導致能量轉移到熒光團，熒光團可在 665 nm 處產(chǎn)生熒光信號；B：隨著游離 cAMP（細胞 cAMP）濃度的增加，測試樣本中的 cAMP 競爭性結合 cAMP 特異性抗體，導致熒光信號減弱]

此外，21 世紀初，BD Biosciences 有限公司開發(fā)了ACTOne 檢測法，這是一種可以實時檢測細胞內(nèi) cAMP 水平變化的技術，該分析可以高通量進行，無需細胞裂解步驟，這種檢測基于含專有外源性環(huán)核苷酸門控（CNG）通道的細胞系，可以對細胞內(nèi) cAMP 水平進行終點和動力學測量，并已成功用于測量 Gs 和 Gi 偶聯(lián) GPCR 活性[26]。

2.2 基于細胞內(nèi) Ca2+ 檢測法

在 GPCR 信號通路中，細胞內(nèi) Ca2+是 GPCR 信號傳導的另一個第二信使。該方法是基于 G 蛋白偶聯(lián) GPCR信號通路對細胞內(nèi) Ca2+熒光進行定量分析[27]。用于測量細胞中 Ca2+通量的 FLIPR 是 20 世紀 90年代早期的一項重要發(fā)明，在高通量藥物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了重要作用。該法主要用于分析 Gq 偶聯(lián)的 GPCR，但也可以通過嵌合 G 蛋白或混雜 G 蛋白的表達來檢測 Gαi/o、Gαs 或 Gα12 偶聯(lián)的GPCR[28-30]。

自從 Tsien 及其同事在 1989年開發(fā)出熒光鈣指示劑fluo-3 以來，基于熒光的細胞內(nèi)鈣測定已變得越來越流行[31]，相繼開發(fā)出了 fluo-3 類似物 fluo-4。Fluo-4 由 Ca2+螯合劑和熒光素類似物組成，一旦與 Ca2+結合，熒光團的電子性質和光譜性質就會發(fā)生改變，即可檢測到熒光[30]。為增加其細胞膜滲透性，fluo-4 以 fluo-4-AM（乙酰氧基甲基酯）的形式施用于細胞，進入細胞后 fluo-4-AM 被細胞內(nèi)酯酶水解，導致細胞膜不可滲透性負電荷形式 fluo-45-的產(chǎn)生，fluo-45-與胞內(nèi) Ca2+結合從而能夠檢測到發(fā)光信號。然而一些細胞會表達某種有機陰離子轉運體，這會導致帶負電的 fluo-45-的丟失，從而導致信號降低，這種現(xiàn)象可以通過向細胞中添加丙磺舒（一種轉運體抑制劑）來防止（圖3）。

圖3 基于熒光鈣結合染料 fluo-4 的細胞內(nèi)鈣測定原理

Ca2+測定是活細胞的功能測定，也可用于高通量藥物篩選。這種方法可以用于檢測激動劑、拮抗劑和變構調(diào)節(jié)劑，然而由于熒光很容易受到化合物的干擾，因此該法不利于反向激動劑和慢結合激動劑的篩選。

2.3 報告基因分析法

報告基因分析為篩選 GPCR 靶點提供了另一個穩(wěn)健且經(jīng)濟高效的高通量同質分析平臺。GPCR 激活后通過第二信使的響應元件改變基因轉錄。GPCR 的激活導致 G 蛋白 α 亞基與 βγ 二聚體亞基解離，進而啟動下游第二信使通路的級聯(lián)反應，并最終通過 cAMP 反應元件（CRE）、活化 T 細胞核因子響應元件（NFAT-RE）、血清響應元件（SRE）和血清反應因子響應元件（SRF-RE）等各種反應元件誘導基因轉錄[32-33]（圖1）。常用的報告基因包括熒光素酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-內(nèi)酰胺酶和多種熒光蛋白。熒光素酶通常是首選的報告基因。例如，通過使用位于熒光素酶基因上游的 T 細胞反應元件（NFAT-RE）監(jiān)測與 Gq 蛋白偶聯(lián)的受體的活性。受體的激活導致細胞內(nèi)Ca2+的增加，進而激活蛋白激酶 C 使 NFAT-RE 結合蛋白磷酸化。當磷酸化的 NFAT-RE 結合蛋白與 NFAT-RE 序列結合時，細胞內(nèi)的熒光素酶濃度會增加，從而導致熒光素酶基因的轉錄率增加。該平臺屬于均相測定，需要較長的孵育時間，并且測量的信號事件遠離受體激活時間，這可能會導致大量假陽性，并且該法受限于需要了解耦合機制，因此不利于對孤兒 GPCR 的篩查。

2.4 共振能量轉移檢測法

共振能量轉移（resonance energy transfer，RET）是一種光物理過程，通過熒光供體將能量轉移到合適的熒光能量受體而檢測發(fā)光信號，它們在描述活細胞中的 GPCR 激活和信號通路方面非常有價值。根據(jù)標簽的不同，RET 傳感器可分為FRET 和 BRET[34-35]。FRET 的原理是熒光共振能量轉移，當供體和受體彼此非常接近時，光子可以從一個受激發(fā)的熒光團（供體）轉移到另一個熒光團（受體）并使后者發(fā)光[36]。BRET 通常是基于發(fā)光酶——熒光素酶進行生物發(fā)光共振能量轉移（圖4）[37]。例如，G 蛋白 α（能量供體）和 γ（能量受體）亞單位可以用相應的熒光蛋白標記，GPCR 激活后即可獲得 BRET 信號[38-39]。BRET 已被用于研究融合到腎素熒光素酶（Rlu）的 GPCR 與融合到GFP 的細胞質支架蛋白 β-arrestin 的相互作用，以及識別GPCR 的偏倚效應、變構和多譜關聯(lián)[40]。

圖4 FRET 和 BRET 檢測兩種蛋白質之間的能量轉移[A：FRET 中有兩個熒光團，當供體和受體彼此靠近時，激光激發(fā)能量供體熒光團，光子從該供體轉移到另一個熒光團（受體）并使后者發(fā)光；B：BRET 中當兩個熒光團靠近時，熒光素酶（供體）與底物反應發(fā)出的熒光可以激發(fā)受體上的 GFP 熒光團，GFP 隨后發(fā)出更高波長的可檢測信號。其中 FRET 需要外部激光激發(fā)，而 BRET 是采用生物發(fā)光]

根據(jù)實驗的具體情況，RET 傳感器可以根據(jù)標記單位的不同分為幾種表達方式，如 GPCR/G 蛋白信號功能測定、GPCR/β-arrestin 信號功能測定[41]、分子內(nèi)構象 GPCR傳感器和分子內(nèi)構象 GPCR 二聚化傳感器[42]。FRET 和BRET 的實際應用取決于具體的實驗情況，F(xiàn)RET 測定提供了更高的空間和時間分辨率，熒光探針的高度多樣性提供了廣泛的探針對，但是這種技術需要外部光源來激發(fā)供體，并且高背景會導致信噪比降低。相比之下，BRET 檢測是基于酶促反應，不需要額外的激發(fā)光，更容易量化結果[36]。

2.5 G 蛋白非依賴的 β-arrestin 招募法

基于 β-arrestin 的分析方法是一種不依賴于 G 蛋白的測定方法，特別適用于 oGPCR 的分析和篩選。研究發(fā)現(xiàn)，有些 GPCRs 的配體在激活信號通路時呈現(xiàn)出一種“不平衡效應”，它們能夠誘導受體選擇性地偶聯(lián)不同類型的 G 蛋白亞基或與非 G 蛋白調(diào)控因子 β-arrestin 直接作用[43-45]，從而使胞內(nèi)的信號偏向某一通路，這種配體稱為“偏向性配體”或“偏倚配體”[17]。因此針對一種 G 蛋白的特殊信號通路的功能性藥物篩選分析可能會導致對這種偏倚配體的忽略。此外，通過異源二聚體的受體串擾可使受體信號通路更加復雜[46]。

最近開發(fā)了多種基于 β-arrestin 招募的藥物篩選分析方法，可以通過聯(lián)合 BRET、PathHunterTM技術和 TangoTM技術進行檢測。BRET 是最早用于監(jiān)測 GPCR-β-arrestin 相互作用的分析方法之一[47]，該技術的分析原理是將 GPCR的 C 端和 β-arrestin 分別用海腎熒光素酶（RLuc）和熒光蛋白標簽（eGFP2、GFP10 或 YFP）標記[48]，當 β-arrestin被招募時，這兩個標簽彼此非常接近，RLuc 反應發(fā)出的光激發(fā)熒光蛋白，然后熒光蛋白發(fā)出更高波長的用于信號檢測（圖5A）。BRET 已應用于包括趨化因子、阿片類、多巴胺和前列腺素受體等在內(nèi)的 GPCR 靶向藥物篩選[49-50]。在PathHunterTM檢測中，β-arrestin 與無催化活性的 β-半乳糖苷酶缺失突變體融合，在 GPCR 的 C 端用 β-半乳糖苷酶N 端缺失序列的另一個小片段標記，GPCR-β-arrestin 相互作用后，β-半乳糖苷酶的兩個部分緊密靠近而活化，導致底物裂解并產(chǎn)生化學發(fā)光信號（圖5B）[51]。

圖5 β-arrestin 招募分析（A：BRET 實驗；B：PathHunterTM 實驗）

2.6 NanoBiT 熒光素酶檢測系統(tǒng)

最近，熒光素酶雙亞基系統(tǒng)新技術開發(fā)成功。NanoLuc二元技術（NanoBiT）包括一個 18 kD 的大亞基片段 LgBiT和一個 1.3 kD 的小亞基片段 SmBiT，該系統(tǒng)可用于細胞內(nèi)蛋白質相互作用的檢測。LgBiT 和 SmBiT 亞基分別與靶蛋白融合[52]，這兩個亞基之間的內(nèi)在親和力極低（Kd= 190 μmol/L），當目的蛋白表達時，蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions，PPI）使兩個亞基靠近而形成一種功能性酶，進而能夠催化底物產(chǎn)生明亮的發(fā)光信號[53-54]。在 NanoBiT 系統(tǒng)的開發(fā)中，鑒定出另一種不同于SmBiT 的小互補肽-HiBiT，它是一個僅有 11 個氨基酸的序列，對 LgBiT 具有非常高的親和力（Kd= 700 pmol/L)。由于 LgBiT 是細胞不可滲透的，因此 HiBiT-LgBiT 互補系統(tǒng)提供了一種區(qū)分內(nèi)化蛋白質和保留在細胞表面的蛋白質的方法（圖6）。

圖6 NanoBiT 熒光素酶檢測系統(tǒng)[A：蛋白質-蛋白質相互作用檢測（將目的蛋白 A 和 B 分別與 LgBiT 和 SmBiT 融合，并在細胞內(nèi)表達。融合蛋白的相互作用導致 LgBiT 與 SmBiT 的結構互補，形成可產(chǎn)生明亮發(fā)光信號的有功能的酶）；B：Nano-Glo HiBiT 細胞外檢測系統(tǒng)（將目的蛋白標記 HiBiT 標簽并在細胞內(nèi)表達，當外源性加入 LgBiT 蛋白和底物后，兩者結合形成復合物產(chǎn)生明亮的發(fā)光酶，通過檢測熒光強度，可判斷細胞膜表面或分泌到胞質的 HiBiT 標記的目的蛋白量）]

NLuc 系統(tǒng)用途廣泛，已用于生物醫(yī)學研究的若干領域，包括蛋白質-蛋白質相互作用、遺傳調(diào)節(jié)和細胞信號、監(jiān)測蛋白質穩(wěn)定性和分子成像等。據(jù)報道，NLuc 已經(jīng)成功地監(jiān)測了 G 蛋白偶聯(lián)松弛素家族肽受體（RXFP3）的內(nèi)化，通過在 HEK 293T 細胞中表達 NLuc 標記的 RXFP3，利用生物發(fā)光來量化檢測結果[55]。此外，已有研究通過基因組編輯技術將 HiBiT 標簽標記到程序性死亡配體 1（PD-L1）的 C 端，并在肺腺癌細胞系 PC9-KI 中，用藥物篩選鑒定調(diào)節(jié) PD-L1 表達的化合物[56]。

NLuc 技術與其他系統(tǒng)相比具有多種優(yōu)點。首先，它將成為更準確的 PPI 生物學模型。LgBiT 和SmBiT 都是較小的蛋白標記物，對目標蛋白的構象干擾極微弱。第二，NanoBiT 具有更高的靈敏度和信噪比[57-58]。第三，由于LgBiT 和 SmBiT 之間的相互作用是可逆的，該系統(tǒng)還可用于檢測結合后快速分離的蛋白質。第四，NanoBiT 檢測方法簡單，無需特定過濾器或進樣器，用普通發(fā)光檢測器即可檢測，并且試劑穩(wěn)定性高。第五，該法可調(diào)節(jié)放大測試通量，適用于 96 孔、384 孔和 1536 孔板的高通量檢測，以用于藥物開發(fā)[59-60]。此外，該方法不受特定 G 蛋白類型的限制，可用于篩選 Gαs 和 Gαi/o 以及任何其他相偶聯(lián)的 G 蛋白亞家族。

2.7 其他新興藥物篩選技術

近年來，通過高分辨率熒光顯微鏡和自動圖像分析使GPCR 可視化的高內(nèi)涵篩選（high-content screening，HCS）成為另一種重要的藥物篩選分析方法[61-62]。HCS 主要用于細胞毒性、受體調(diào)節(jié)劑和活性物質釋放等影響細胞功能方面的研究。在藥物篩選方面，HCS 也發(fā)揮了重要作用。與傳統(tǒng)的細胞分析法相比，HCS 可以識別每個細胞中的個體反應，從而獲得細胞周期階段、細胞轉染率或自然變異性的可靠數(shù)據(jù)。目前，許多制藥和生物技術公司已將 TransFluor 檢測法確認為 HCS 金標準分析。據(jù)報道，Ross 等[63]已利用TransFluor 技術通過檢測熒光信號強弱與分布及其變化對GPCR 進行高內(nèi)涵篩選。

無標簽技術極大地推進了 GPCR 全細胞分析手段，該方法使用生物傳感器，將配體誘導的活細胞變化總和轉換為光學、電學、量熱、聲學、磁性或其他可量化信號，可以用于檢測包括細胞黏附、增殖、遷移和死亡的特征性變化。目前基于光學的儀器包括 BindTM（SRU 生物系統(tǒng)）和 EpicTM（康寧公司）系統(tǒng)，這兩個系統(tǒng)都已成功地用于研究細胞形態(tài)變化和 GPCR 信號通路[64]。但無標簽全細胞分析也容易出現(xiàn)假陽性和假陰性結果[65]。

基于結構的藥物設計長期以來在藥物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮著重要作用，尤其是對于具有酶靶點的藥物。目前，基于 GPCR結晶學的最新突破[66-67]，發(fā)現(xiàn) 44 種不同的 GPCR 結構和196 種配體-受體復合物可用于人類 GPCR 研究，這為虛擬篩選和細胞非依賴發(fā)現(xiàn)新藥物提供了重要依據(jù)[68-69]。例如，最近針對 μ 阿片受體結構的對接實驗確定了一種 Gi 蛋白偏向的激動劑 PZM21，其療效與嗎啡相似，但減少了對小鼠的不良反應[70]。與傳統(tǒng)分析方法相結合，這些新興的藥物篩選平臺在 GPCR 藥物篩選和開發(fā)中有著廣闊的發(fā)展前景。

3 小結

GPCR 靶向藥物是學術界和制藥界最廣泛的研究焦點。GPCR 蛋白家族在糖尿病、肥胖、阿爾茨海默癥等為代表的疾病中具有重要臨床用藥價值。此外，一些孤兒受體已鎖定為多種適應證的新靶點，這為該領域的藥物研發(fā)工作提供了強大動力。由于 X 射線晶體學、蛋白質工程和生物物理技術的發(fā)展，GPCR 先導化合物的開發(fā)技術正在逐漸迭代更新，新的分析方法更加高效和多維，例如 3D 晶體學結構分析、無標記熒光分析和虛擬篩選等。

盡管如此，讓 GPCR 靶向藥物真正服務于臨床仍然是一項具有挑戰(zhàn)性的工作，這對高通量篩選技術的工藝優(yōu)化和新技術開發(fā)提出了更高的要求。展望未來，基于結構和傳感器的方法與傳統(tǒng)的 HTS 相結合，可能會為 GPCR 藥物發(fā)現(xiàn)領域帶來新的機遇，從而擴大潛在靶向界面范圍，為更精準的藥物治療提供可能性。