間充質干細胞衰老的研究進展

陶寧，王華

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有高度自我更新能力、多向分化潛能和低免疫原性的異質細胞群，其來源廣泛，可從骨髓、臍帶、胎盤、脂肪、牙髓等多種組織中獲得[1]。MSCs 可以在不同誘導條件下分化為多種組織和細胞，并分泌多種生物活性物質，其良好的免疫調節(jié)與組織修復功能為再生醫(yī)學提供了新的策略及思路。

在細胞治療過程中需要大量的 MSCs，這就需要對組織分離得到的 MSCs 進行體外擴增。在臨床級的細胞制備過程中發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的 MSCs 增殖能力有限，隨著傳代次數(shù)的增加，還可能引發(fā)由細胞衰老導致的功能障礙，這極大地限制了 MSCs 的臨床應用。并且供體的身體狀況、年齡和基因組成等因素也會影響 MSCs 的生物學功能和最終的治療效果，這其中的差異可能是 MSCs 發(fā)生了衰老所致[2]。

衰老的 MSCs 表現(xiàn)為增殖和分化能力降低，蛋白質表達和表觀遺傳改變。越來越多的證據(jù)表明，衰老細胞可以促進多種與年齡相關疾病的發(fā)生，從而影響機體健康，縮短壽命[3]。本文主要從 MSCs 衰老的分類、表型改變、誘導機制及相關解決策略等四方面進行綜述，以期為干預 MSCs細胞衰老提供參考。

1 MSCs 細胞衰老的分類

細胞衰老是指當細胞受到外源性和內源性刺激后，處于穩(wěn)定的細胞周期阻滯的狀態(tài)，這種狀態(tài)的維持與大分子的改變和促炎因子的分泌有關[4]。根據(jù)觸發(fā)機制的不同，MSCs細胞衰老大致分為以下四種類型。

1.1 復制性衰老

當細胞經歷復制周期后，端粒的長度就會縮短，當縮短到一定限度時，就會發(fā)生衰老，這種因為細胞過度增殖所觸發(fā)的衰老稱為復制性衰老，是較為常見的體外細胞衰老類型，它與其他幾類細胞衰老密切相關[5]。MSCs 的復制性衰老是一個持續(xù)過程，在這個過程中，細胞衰老的相關指標會發(fā)生動態(tài)變化，細胞的表型、分化潛能和基因表達譜等也會發(fā)生相應改變，這些改變都為尋找抗 MSCs 衰老治療的靶點提供參考依據(jù)[6]。

1.2 致癌基因誘導衰老

致癌基因的激活也會誘導 MSCs 衰老，如細胞周期蛋白 E、快速加速纖維肉瘤激酶（rapidly accelerated fibrosarcoma ， RAF ）、 有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和鼠肉瘤病毒癌基因同源物 B1（v-raf murine viral oncogene homolog B1，BRAF）等的激活和（或）過表達都會觸發(fā) MSCs 的衰老[5]。致癌基因的激活可能作為一種遺傳應激，導致培養(yǎng)的細胞發(fā)生不可逆的生長停滯，這個過程通常伴隨著細胞核結構的整體變化，特別是衰老相關易染色質灶（senescence-associated heterochromatic foci，SAHF）的形成。在人類衰老的細胞中通常會出現(xiàn)聚集的 DNA/染色質核區(qū)域，這些異染色質區(qū)域可能會抑制促增殖基因的表達，從而進一步加劇細胞衰老[7]。

1.3 壓力誘導衰老

在活性氧簇（reactive oxidative species，ROS）、電離輻射、滲透應激、機械應激、缺氧和熱休克等壓力的刺激下，細胞也會發(fā)生衰老，此類衰老稱為壓力誘導衰老，它的許多細胞和分子特征都與發(fā)生復制衰老的細胞相似[8]。當 MSCs受到 ROS 刺激時，會觸發(fā)腫瘤蛋白 p53/細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 1A（p21）通路和 p38 MAPK 通路的激活，從而引發(fā)不可逆的細胞周期阻滯[9]。因此，調節(jié) ROS 的含量可以直接緩解骨髓來源 MSCs 的細胞衰老。

1.4 發(fā)育性衰老

并非所有衰老對細胞產生的影響都是消極的。在非病理狀態(tài)下，機體也可以通過多種途徑或多功能基因的調控而觸發(fā)細胞衰老，這被稱為發(fā)育性衰老，是細胞的正常發(fā)育過程[10]。其中，胰島素樣信號通路、雷帕霉素靶蛋白和Sirtuins/NAD+三條信號通路在 MSCs 的發(fā)育性衰老過程中發(fā)揮著重要作用[11]。值得注意的是，這三條通路均與細胞新陳代謝的調控有關，但其發(fā)揮作用的具體機制尚在研究之中。

2 衰老 MSCs 表型的改變

衰老的細胞會發(fā)生一系列的特征性改變，如：細胞形態(tài)的改變、增殖能力的降低、衰老相關 β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-D-galactosidase，SA-β-Gal）活性的增強和衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）表達的升高等。

2.1 細胞形態(tài)改變，增殖能力降低

早期傳代的 MSCs 體積小，呈成纖維細胞樣紡錘體形態(tài)，但在長期培養(yǎng)中會逐漸變得肥大、扁平，并產生更多的偽足和肌動蛋白應力纖維。此外，由于 p53/p21-細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 2A（p16）/腫瘤抑制因子 RB 轉錄輔阻遏因子 1（RB transcriptional corepressor 1，Rb）這兩條信號通路激活，導致 MSCs 細胞周期阻滯，具體表現(xiàn)為細胞有絲分裂活性降低，集落形成單位不斷減少[12]。因此，細胞增殖能力的降低，p53、p21、p16 和 Rb 基因的高表達都成為鑒定細胞衰老的有力依據(jù)。

2.2 SA-β-Gal 活性增強

雖然衰老細胞經歷了不可逆的生長阻滯，但仍保持一定的代謝活性，顯示出特征性的基因表達變化，通常表現(xiàn)為SA-β-Gal 活性增強，DDR 蛋白表達的改變，SAHFs 的特征性擴大和持續(xù)的 DNA 損傷灶（persistent DNA damage nuclear foci，PDDF）[7,13]。其中，β-Gal 是一種溶酶體酶，在 pH 6.0 時具有催化 β-半乳糖苷的活性。SA-β-Gal 反映了溶酶體的功能障礙，它是廣泛使用的細胞衰老標志物，也是目前鑒定細胞衰老最常用的方法之一。在衰老過程中，由于溶酶體活性增加和胞漿 pH 值改變，SA-β-Gal 陽性的MSCs 百分比明顯增加[7,14-15]。但是由于衰老表型的復雜性，目前仍沒有任何指標能夠單獨鑒定 MSCs 的衰老。

2.3 SASP 表達升高

SASP 是一種復雜的、快速變化的多組分成分，并在一定程度上隨時間變化[16]。SASP 的一個顯著特征就是衰老細胞分泌大量的促炎分子，包括細胞因子、趨化因子、生物活性脂質和損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）等[17]。越來越多的證據(jù)表明：細胞衰老與機體衰老及年齡相關疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。

臨床級 MSCs 的療效可歸功于有益旁分泌因子的作用。因此，包含這些分泌因子的 MSCs 條件培養(yǎng)基在各種疾病的治療中發(fā)揮有益作用。如：在骨髓來源的衰老 MSCs中，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胎盤生長因子（placental growth factor，PGF）和肝生長因子（hepatic growth factor，HGF）等促進血管生成的因子分泌減少，而血栓反應蛋白-1（thrombospondin-1，TBS1）和纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）等抗血管生成因子分泌增加[18]。因此，衰老會對血管生成產生負面影響，并直接影響 MSCs 的治療效果。

3 MSCs 衰老的機制

正常的體細胞增殖能力有限，具有有絲分裂能力的細胞通過細胞衰老來響應多種應激原的刺激。這些應激原主要包括：端粒功能失調、DNA 損傷、線粒體功能障礙、細胞自噬失衡以及表觀遺傳改變等，其中 DNA 損傷反應（DNA damage response，DDR）居于核心地位。

3.1 DNA 損傷

DDR 對于細胞基因組穩(wěn)定性和組織存活都是至關重要的。DNA 損傷可通過改變特定基因的表達，直接導致細胞功能障礙；也可以通過觸發(fā)細胞對損傷的應答，間接導致細胞功能障礙，從而能夠更廣泛地改變基因表達[19-20]。由于DNA 復制錯誤以及暴露于內源性和外源性誘變劑環(huán)境中，DNA 損傷會在生物體的整個生命周期內累積。

細胞在不斷復制過程中，端粒會發(fā)生縮短，這是 MSCs衰老過程中發(fā)生的內源性變化之一。當端?？s短到一定程度時，就會導致 DNA 無法繼續(xù)復制，染色體的穩(wěn)定性也無法保證，從而觸發(fā)由 p53 介導的 DDR，進而誘發(fā)衰老應答。

此外，氧化應激、電離輻射、缺氧和機械應激等其他因素也可能導致細胞 DNA 損傷，并引起 DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）[6,21]。DSBs 是細胞衰老有效的激活因子。

當細胞發(fā)生 DNA 損傷時，會觸發(fā) DDR 網(wǎng)絡，從而感知損傷并啟動突變修復[22]。DDR 網(wǎng)絡首先通過激活細胞周期相關蛋白 p53 的表達，誘導細胞周期蛋白依賴性激酶 2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2）的調節(jié)基因p21WAF1/Cip1的表達，從而使細胞進入周期阻滯狀態(tài)[22]。當細胞持續(xù)產生 DNA 損傷應答信號時，p38MAPK 介導的線粒體功能障礙和 ROS 的產生會激活 p16INK4A，導致 CDK的抑制和 Rb1 的激活，從而誘導衰老[23]。因此，增強 DNA修復途徑的活性可能有助于緩解 MSCs 的衰老。

3.2 線粒體功能障礙

線粒體作為細胞能量代謝的中心，參與多種細胞活動，如細胞基質的代謝、凋亡和信號轉導通路的啟動。發(fā)生復制性衰老的 MSCs，其線粒體會變長，當受損嚴重時，會出現(xiàn)破碎的、片狀線粒體，并引發(fā)線粒體功能障礙[5]。線粒體功能障礙則可通過破壞胞質中 NAD+/NADH 的比值、ROS的產生和其他機制誘導衰老。

其中，ROS 在線粒體中的過度積累是造成線粒體功能障礙的主要原因，而輻射、紫外線、缺氧和低溫等外部因素都會促進 ROS 的產生。ROS 作為一種代謝副產物，可以通過產生次級活性代謝產物來誘導氧化和其他類型的細胞反應。雖然生理水平的 ROS 對于細胞的增殖和分化都是必要的，但過量的 ROS 可以誘導 DNA 損傷并加速端粒縮短，這兩種損傷均可激活 DDR，從而觸發(fā) MSCs 的衰老[24]。與正常細胞相比，線粒體功能障礙所致的衰老（mitochondrial dysfunction-associated senescence，MiDAS）MSCs 會釋放大量 ROS，導致 DDR 的持續(xù)激活，從而在衰老進程中形成正反饋[25]。研究表明：色氨酸代謝產物如5-甲氧基色氨酸（5-methoxytryptophan，5-MTP）和褪黑素，可以通過維持線粒體完整性和功能，減少 ROS 生成，以緩解金屬汞誘導的 MSCs 衰老[26]。

3.3 細胞自噬失衡

自噬是一種高度保守的生理過程，在真核細胞中廣泛存在。它可以調控分子降解和細胞器更新，因而在生理和病理條件下對于維持細胞穩(wěn)態(tài)都發(fā)揮著關鍵作用，但是過度的自噬可能引起細胞死亡[27]。減少細胞內損傷的積累有助于維持細胞靜止期和衰老狀態(tài)之間的平衡，細胞自噬可以通過降解蛋白質和線粒體等受損的細胞成分，從而減少與細胞衰老相關的損傷[28]。衰老的 MSCs 通常表現(xiàn)為自噬減少，這會導致細胞中蛋白酶水平失衡，線粒體活性、氧化應激和代謝狀態(tài)的提高，從而進一步加劇了細胞的衰老[22]。自噬作為抗衰老的靶點已被廣泛應用，通過用 AMPK 激活劑阿卡地辛和 Sirtuin 激活劑煙酰胺抑制雷帕霉素靶蛋白 C1（mammalian target of rapamycin C1，mTORC1）可以促進自噬，保留 MSCs 的自我更新和分化能力，并減輕與細胞衰老相關的變化[29]。

3.4 表觀遺傳的改變

表觀遺傳的變化既是對細胞衰老的響應，也是影響衰老發(fā)生的重要因素[30]。表觀遺傳的變化是指在 DNA 序列不改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質重塑等在此過程中發(fā)揮了重要作用[31]。研究表明，來自老年個體的 MSCs 表現(xiàn)出異染色質相關 H3K9me3 表達普遍減少以及異染色質維持蛋白表達下調[32]。在 Werner 早衰綜合征的胚胎干細胞模型中也出現(xiàn)類似的改變，研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，異染色質紊亂可能會導致細胞功能障礙[32]。目前的研究結果顯示：表觀遺傳的變化是衰老 MSCs 的普遍特征，但是還需要進一步研究來明確這些變化與 MSCs 衰老的因果關系。

4 MSCs 衰老的解決策略

目前，對于細胞衰老的調控研究主要集中在利用基因工程、基因編輯和藥理學等方法調節(jié)衰老關鍵信號分子/通路及相關細胞因子等的表達。

細胞基因工程是一種可預防細胞衰老的方法。核小體組裝蛋白 1（nucleosome assembly protein 1，NAP1）是一個高度保守的基因家族，它與真核生物中的核小體裝配、組蛋白修飾、轉錄調控和細胞增殖等過程密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，其家族成員 NAP1L2 表達水平的升高與骨髓來源 MSCs的衰老和成骨潛能受損相關。實驗通過感染病毒敲低NAP1L2 基因的表達，結果顯示 MSCs 的 SA-β-Gal 陽性細胞數(shù)減少，衰老及炎癥相關基因表達水平降低[33]。

基因編輯技術的應用是近年來的研究熱點，如誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）衍生的MSCs，細胞在重編程過程中會發(fā)生再生。其 DNA 甲基化譜保持供體特異性，而組織特異性及與年齡和衰老相關的DNA 甲基化譜則在重編程過程中被清除，從而表現(xiàn)出更好的細胞活力，使得細胞可以傳代超過 40 次而不表現(xiàn)出衰老特征[34-35]。

藥理學方法也可以作為抑制體外培養(yǎng)中 MSCs 衰老的有效手段?？箟难嵩谠S多生物過程中都扮演輔助因子的角色，它作為一種天然的抗氧化劑，能夠有效清除細胞中的ROS[36]。研究結果發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸可以通過激活 Akt/mTOR信號通路抑制 MSCs 中的 ROS 生成，并減少 D-半乳糖處理的 MSCs 中 SA-β-Gal 陽性細胞的數(shù)量和 p16 的表達，緩解 MSCs 的衰老[37]。

由于衰老誘發(fā)因素的多樣性和復雜性，以及衰老調控機制之間存在錯綜復雜的聯(lián)系，致使 MSCs 衰老現(xiàn)象不能用單一的機制進行闡釋，也無法通過單一的方法來干預多種類型的細胞衰老。雖然目前已有的手段對于體外干預細胞衰老顯示出初步成效，但是普遍存在操作技術復雜、持久安全性無法保證的缺點。

5 結語

細胞衰老是一種由不同應激刺激的異質性細胞狀態(tài)。在體內，衰老細胞的慢性累積會導致組織功能障礙和各種年齡相關疾病發(fā)生風險的增加；在體外，衰老細胞會對其細胞治療的效果產生嚴重影響，這就需要我們對 MSCs 的衰老進行多方面多層次的深入探索。

首先，深入探索 MSCs 衰老的形成機制。MSCs 衰老的誘發(fā)因素及細胞表型的改變錯綜復雜，MSCs 衰老分子機制的闡明有助于進一步明確 MSCs 功能障礙的驅動因素和效應因素，從而在緩解 MSCs 功能障礙以及提升臨床級MSCs 療效方面提出可行性方案。

其次，發(fā)現(xiàn)細胞早期衰老的標志物。目前建立的衰老標志物如 p16、p53 和 SA-β-Gal 等均可用于識別衰老細胞，但都不能作為鑒定早期細胞衰老的獨立指標。因此，我們還需要探究與 MSCs 衰老相關的特異性的新靶點，以更好地鑒定 MSCs 的早期衰老。

最后，提出干預 MSCs 衰老的新策略。目前已有的抗MSCs 衰老手段很多，但是在持久的安全性方面都無法得到保障，這極大限制了這些干預手段在臨床上的應用。因此，對干預 MSCs 衰老新策略的探究，仍是未來研究的發(fā)展方向。