升血小板膠囊對小鼠免疫性血小板減少癥的治療作用及其機(jī)制

劉建強(qiáng)，侯圣貴，李曉燕，竇愛霞

1 濟(jì)南市第四人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，濟(jì)南 250032；2 濟(jì)南市第四人民醫(yī)院藥學(xué)部；3 山東大學(xué)第二醫(yī)院血液科

免疫性血小板減少癥（ITP）是一種因血小板減少導(dǎo)致的出血性疾病［1］。研究證實(shí)，ITP患者存在免疫耐受機(jī)制異常，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞（Tregs 細(xì)胞）的免疫抑制功能降低，血液中循環(huán)促炎癥細(xì)胞因子水平升高。ITP 治療過程中需要應(yīng)用免疫抑制劑，如糖皮質(zhì)激素類藥物。但是老年患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療過程中，往往出現(xiàn)高血壓、高血糖、骨質(zhì)疏松、感染等嚴(yán)重不良反應(yīng)。因此，如何減少ITP 患者治療過程中的藥物不良反應(yīng)十分重要。2020年1月—2022年1月，我們制作ITP小鼠模型并選擇升血小板膠囊治療；通過觀察模型小鼠治療過程中血小板數(shù)目、免疫細(xì)胞以及炎癥因子的變化，探討升血小板膠囊對ITP的治療作用及減少不良反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 4～6周齡雌性C57BL/6J近交系小鼠購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量平均為0.020 kg。升血小板膠囊由陜西郝其軍制藥股份有限公司提供（批號：2208116；規(guī)格：每盒24粒，每粒0.45 g）。強(qiáng)的松片（每片5 mg）溶于生理鹽水中制成0.45 mg/mL濃度的藥液待用。大鼠抗小鼠CD41（血小板抗體，克隆號MWRG30）購自美國BD 公司，按照產(chǎn)品說明用生理鹽水配制成一定濃度的藥液。小鼠Tregs 細(xì)胞分 離 試 劑 盒 購 自Invitrogen 公 司（Carlsbad，CA，USA），小鼠Tregs 細(xì)胞流式檢測試劑盒購自eBioscience公司（San Diego，CA，USA）。

1.2 ITP 小鼠模型構(gòu)建及分組處理 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)美國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用手冊》進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)記錄編號為KYLL-2021（KJ）A-0046。將40 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對照組、模型組、膠囊組、強(qiáng)的松組，每組10 只。除對照組外，其余三組均用抗血小板抗體于小鼠腹腔內(nèi)注射，誘導(dǎo)持續(xù)性血小板減少成功建立ITP 模型。對照組、模型組按照10 mL/（kg·d）給予生理鹽水灌胃，強(qiáng)的松組按照10 mg/（kg·d）給予相同體積的強(qiáng)的松溶液灌胃，膠囊組按體質(zhì)量4.5 g/（kg·d）給予相同體積的升血小板膠囊溶液灌胃。各組灌胃均每日1 次，連續(xù)8 d。如未經(jīng)治療，ITP 模型維持時(shí)間為4～7周，選擇4周處死動(dòng)物。

1.3 ITP 小鼠模型外周血小板計(jì)數(shù)、骨髓液涂片染色 用藥4 周分別處死動(dòng)物。先摘眼球取血，進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)測定。然后取右側(cè)股骨，分離骨髓，取骨髓液涂片，晾干后做瑞氏-姬姆薩染色。

1.4 小鼠脾臟Tregs細(xì)胞構(gòu)成檢測 采用流式細(xì)胞儀檢測。無菌操作取脾臟淋巴結(jié)，制備ITP 小鼠單個(gè)核細(xì)胞懸液，檢測Tregs 細(xì)胞構(gòu)成比例。主要步驟：按照磁珠分選試劑盒步驟取所需體積磁珠移入玻璃試管，加入等體積或至少1 mL 的分離緩沖液，震蕩混勻后在磁場中靜置2 min，棄上清后等體積分離緩沖液重懸磁珠。收集各組脾臟和引流淋巴結(jié)提取的單個(gè)核細(xì)胞，分離CD4+T 細(xì)胞。分離到的CD4+T 細(xì)胞中加入抗CD25 抗體室溫孵育20 min，預(yù)冷，分離緩沖液2 mL清洗，離心、重懸，加入75 μL清洗Flow Comp 磁珠，室溫振蕩孵育15 min。置于磁場中2 min，上清取出后用2 mL 分離緩沖液重懸沉淀，再次置于磁場2 min，棄上清。移出磁場后加入0.5 mL 洗脫液重懸細(xì)胞，室溫振蕩孵育20 min。輕柔吹打后移入磁場，靜置2 min，分別計(jì)數(shù)CD4 細(xì)胞和CD4+CD25+T 細(xì)胞，CD4+CD25+T 細(xì)胞即為Tregs 細(xì)胞，計(jì)算Tregs 細(xì)胞構(gòu)成比及Tregs/CD4 值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 小鼠脾臟T 細(xì)胞IL-2 mRNA、Foxp3 mRNA 檢測 采用流式細(xì)胞儀以檢測Tregs 細(xì)胞類似步驟檢測小鼠脾臟CD4+CD25-效應(yīng)T 細(xì)胞（即Teff 細(xì)胞）。TRIzol 試劑盒提取Teff 細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測Teff 細(xì)胞IL-2 mRNA 表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次反應(yīng)均做空白對照（不加模板的反應(yīng)系統(tǒng)）以排除污染。同樣方法提取Tregs 細(xì)胞的總RNA，檢測Tregs細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布用± s表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血小板計(jì)數(shù) 對照組、模型組、強(qiáng)的松組、膠囊組小鼠外周血小板計(jì)數(shù)分別為（600.35 ± 145.39）、（123.33 ± 16.24）、（327.66 ± 73.20）、（577.35 ± 76.94）×109/L。與對照組比較，模型組、膠囊組、強(qiáng)的松組小鼠外周血小板計(jì)數(shù)均有不同程度下降（P 均＜0.05）；與模型組比較，膠囊組、強(qiáng)的松組小鼠外周血小板水平升高（P 均＜0.05）；膠囊組與強(qiáng)的松組比較，外周血小板水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組小鼠骨髓涂片產(chǎn)板巨核細(xì)胞計(jì)數(shù) 對照組、模型組、強(qiáng)的松組、膠囊組小鼠骨髓產(chǎn)板巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為（55.05 ± 5.83）、（26.90 ± 2.49）、（66.27 ± 3.58）、（63.45 ± 3.44）個(gè)，與對照組比較，模型組小鼠骨髓產(chǎn)板巨核細(xì)胞數(shù)下降（P＜0.05）；與模型組比較，膠囊組、強(qiáng)的松組ITP 小鼠骨髓產(chǎn)板巨核細(xì)胞數(shù)增加（P均＜0.05）。膠囊組、強(qiáng)的松組小鼠骨髓產(chǎn)板巨核細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠脾臟Tregs 細(xì)胞構(gòu)成及Tregs/CD4值 與對照組比較，模型組小鼠Tregs細(xì)胞構(gòu)成比及Tregs/CD4 值下調(diào)（P均＜0.05）；與模型組比較，膠囊組、強(qiáng)的松組小鼠Tresg 細(xì)胞構(gòu)成比及Tregs/CD4 值上調(diào)（P均＜0.05）。膠囊組、強(qiáng)的松組小鼠Tregs 細(xì)胞構(gòu)成及Tregs/CD4 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠Tregs細(xì)胞構(gòu)成比及Tregs/CD4比較（%± s）

表1 各組小鼠Tregs細(xì)胞構(gòu)成比及Tregs/CD4比較（%± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

images/BZ_44_234_1544_1193_1603.png

2.4 各組小鼠脾臟T細(xì)胞IL-2 mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá) 與對照組比較，模型組Teff 細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，膠囊組、強(qiáng)的松組Teff 細(xì)胞IL-2 mRNA 表達(dá)量下調(diào)（P均＜0.05）。與對照組比較，模型組Tregs 細(xì)胞Foxp3 mRNA 表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，膠囊組、強(qiáng)的松組Tregs 細(xì)胞Foxp3 mRNA 表達(dá)量升高（P均＜0.05）。膠囊組、強(qiáng)的松組T 細(xì)胞IL-2 mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠T細(xì)胞Foxp3 mRNA、IL-2 mRNA表達(dá)比較（± s）

表2 各組小鼠T細(xì)胞Foxp3 mRNA、IL-2 mRNA表達(dá)比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

images/BZ_44_234_2720_1193_2779.png

3 討論

研究顯示，ITP 發(fā)病機(jī)制包括機(jī)體自身免疫失調(diào)導(dǎo)致的巨核細(xì)胞系成熟障礙、血小板生成減少、血小板破壞過多［2］。臨床上可以選用的ITP 治療藥物有糖皮質(zhì)激素、利妥昔單抗、血小板生成素受體激動(dòng)劑等［3］。但是以上臨床用藥多伴有各種不良反應(yīng)發(fā)生，且存在耐藥現(xiàn)象，可導(dǎo)致重要臟器出血及臨床療效的下降，因此迫切需要更加安全有效的治療方法。研究證實(shí)，ITP 患者中存在免疫系統(tǒng)功能紊亂，其中Tregs 細(xì)胞數(shù)量及功能降低可導(dǎo)致免疫監(jiān)視功能下調(diào)，單核巨噬細(xì)胞破壞血小板增多，是ITP 發(fā)生的一個(gè)重要病理機(jī)制［4］。因此上調(diào)Tregs 細(xì)胞，提高Tregs 細(xì)胞的數(shù)量與功能，恢復(fù)機(jī)體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)；同時(shí)抑制Teff 細(xì)胞增殖，減少B 細(xì)胞分泌產(chǎn)生血小板自身抗體［5］，將為ITP開拓新的治療靶點(diǎn)。

血小板膠囊是一種復(fù)方純中藥制劑。君藥是青黛，作用是清熱解毒、涼血消斑；臣藥是牡丹皮，功能是涼血散淤；佐藥為疏風(fēng)散結(jié)之連翹以及收斂止血的仙鶴草；應(yīng)用甘草調(diào)和諸藥，最終達(dá)到清熱解毒、涼血止血、散淤消斑之功。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，青黛除清熱解毒涼血、抗癌的作用外，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠胸腺及脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖，并且藥量與藥效呈現(xiàn)正量效關(guān)系，提示青黛能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能［6］。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，牡丹皮和連翹不僅能降低毛細(xì)血管通透性，還可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，并且不具有腎上腺皮質(zhì)激素樣的各種不良反應(yīng)。佐藥連翹還能阻斷T 淋巴細(xì)胞活化并抑制增殖［7］。本研究應(yīng)用升血小板膠囊治療ITP 模型小鼠，結(jié)果顯示治療后小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)增加，伴有Tregs細(xì)胞數(shù)量及其分泌Foxp3 水平提升，Teff 細(xì)胞及其分泌產(chǎn)生的IL-2水平降低。提示升血小板膠囊治療可以顯著提高Tregs 細(xì)胞比例及功能，改善機(jī)體的免疫監(jiān)視狀態(tài)，對ITP有較好的治療效果。

ITP 患者體內(nèi)的細(xì)胞因子處于失衡狀態(tài)［8］。Tregs 細(xì)胞本身不分泌IL-2［9］，但可以利用Teff 細(xì)胞分泌的IL-2并形成反饋回路來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。在本研究中經(jīng)升血小板膠囊治療后ITP 小鼠的Tregs 細(xì)胞數(shù)量增加、功能改善，能夠有效抑制Teff 細(xì)胞功能，使Teff 細(xì)胞分泌的IL-2 減少，從而恢復(fù)免疫耐受，減輕免疫性血小板減少患者癥狀［10-11］。本研究ITP 小鼠的Teff細(xì)胞IL-2 mRNA 表達(dá)高于對照組，提示ITP 小鼠免疫監(jiān)視的不足導(dǎo)致免疫逃逸狀態(tài)的存在。隨著升血小板膠囊治療后Tregs 細(xì)胞比例的升高，IL-2 mRNA 表達(dá)明顯降低，提示Teff 細(xì)胞的免疫逃逸被成功抑制，從而恢復(fù)Tregs細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能，促進(jìn)ITP病理狀態(tài)的恢復(fù)好轉(zhuǎn)。

綜上所述，升血小板膠囊通過提高Tregs細(xì)胞介導(dǎo)的免疫監(jiān)視，抑制Teff 細(xì)胞功能，減少IL-2 分泌，減輕由此引發(fā)的免疫病理異常導(dǎo)致的相關(guān)血小板損害，促進(jìn)免疫耐受，發(fā)揮升高血小板的治療作用，對ITP 小鼠有良好療效。