LncRNA MEG3在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)變化及其相關(guān)功能

張珂珂，張振，郭庚寅，陳金言，何東

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，濟(jì)南 250012；2 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)外科

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外胚層發(fā)育的膠質(zhì)細(xì)胞來源的腫瘤，具有浸潤性生長、易復(fù)發(fā)、致殘率和病死率高等特點(diǎn)［1-2］。盡管顯微外科技術(shù)的進(jìn)步和切除精細(xì)化的提升已能夠達(dá)到滿意切除［3］，但由于膠質(zhì)瘤浸潤生長的特性，其術(shù)后復(fù)發(fā)率仍近100%［4］。盡管替莫唑胺為代表的化療方案對(duì)改善患者預(yù)后有效，但隨之也帶來了低級(jí)別膠質(zhì)瘤向高級(jí)別膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)化的超突變問題［5］、耐藥性問題［6］和假性進(jìn)展問題［7］。尋找有效的治療靶點(diǎn)和更加深入探討膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制非常必要［8］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）最初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄組中的無用成分，后期研究發(fā)現(xiàn)由于其長鏈特性伴隨著復(fù)雜的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能參與更為多樣的生物學(xué)活動(dòng)，包括調(diào)節(jié)染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)、基因表達(dá)、生長分化和發(fā)育過程［9-12］。LncRNA 母體表達(dá)基因3（MEG3）是一種位于染色體14q32上的新型腫瘤抑制基因。MEG3 通過多種信號(hào)通路抑制包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生發(fā)展［13］。然而，MEG3 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征和可能涉及的通路仍未完全闡明。本研究基于生物信息學(xué)方法研究和探討了MEG3 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)模式、預(yù)后預(yù)測價(jià)值及可能涉及的功能等，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源 人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）數(shù)據(jù)集（www. proteinatlas. org）中來自95 例人體標(biāo)本的27個(gè)不同組織的RNA 測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)；TCGA 數(shù)據(jù)庫中高級(jí)別膠質(zhì)瘤（GBM）、低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）臨床特征資料；LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫研究MEG3 所可能涉及的功能；TIMER 數(shù)據(jù)庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）研究癌癥免疫治療和宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用；TCGA-GBMLGG 數(shù)據(jù)集中的RNA測序（RNA-seq）信息。

1.2 分析方法 使用人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）數(shù)據(jù)集（www.proteinatlas.org）［14］中來自95例人體標(biāo)本的27 個(gè)不同組織的RNA 測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)用以分析MEG3 的組織特異性。使用TCGA 數(shù)據(jù)庫中高級(jí)別膠質(zhì)瘤（GBM）、低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）數(shù)據(jù)集進(jìn)行表達(dá)模式分析，根據(jù)其中的臨床特征資料進(jìn)行相關(guān)性分析，使用24種經(jīng)典免疫細(xì)胞生物標(biāo)志物作為參照［15］。使用單樣本基因富集分析（ssGSEA）算法對(duì)GBM/LGG基因集的每個(gè)樣本計(jì)算對(duì)對(duì)應(yīng)的得分，推斷每個(gè)樣本的免疫細(xì)胞浸潤情況。用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫［16］對(duì)MEG3 所可能涉及的功能進(jìn)行分析，分別從基因本體論（GO）的三個(gè)層次進(jìn)行分析。該數(shù)據(jù)庫對(duì)單基因的GO 分析基于過表達(dá)分析（ORA）算法。使用其內(nèi)建的GESA 算法富集通路用于解釋相關(guān)基因參與的功能。用TIMER 數(shù)據(jù)庫（https：//cistrome. shinyapps. io/timer/）研究癌癥免疫治療和宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用，預(yù)先計(jì)算32 種TCGA癌癥類型的10 897 個(gè)腫瘤的6 種腫瘤浸潤性免疫亞群的水平，評(píng)價(jià)MEG3 與6 種免疫浸潤亞群的關(guān)系，并可給出基于純度矯正后的相關(guān)系數(shù)。

將TCGA-GBMLGG 數(shù)據(jù)集中的RNA 測序（RNA-seq）信息按照MEG3表達(dá)狀態(tài)劃分為兩組，高表達(dá)組和低表達(dá)組，并將兩組差異表達(dá)的情況獲取與該分子有關(guān)的差異表達(dá)列表，并通過該列表進(jìn)行GESA 分析。差異基因分析采用R 軟件及其DESeq2軟件包。

將存在差異的56 494 個(gè)基因的基因名和log2Foldchange 數(shù)值輸入新數(shù)據(jù)表，使用MSigDB 數(shù)據(jù) 庫（https：//www. gsea-msigdb. org/gsea/msigdb/index.jsp）中的Hallmark 注釋基因集進(jìn)行分析，并計(jì)算富集得分（ES）和校正后歸一化的富集得分（NES）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖使用R軟件，其余使用SPSS24.0 和GraphPad Prism 6.0 軟件。數(shù)據(jù)來自于UCSC Xena 中預(yù)處理后的TCGA 數(shù)據(jù)，應(yīng)用算法為R 軟件包對(duì)應(yīng)的處理算法，數(shù)據(jù)處理方式見https：//cran.r-project.org/web/packages/。

2 結(jié)果

2.1 MEG3 在不同組織中的表達(dá) MEG3 在腎上腺、大腦、胎盤組織中表達(dá)豐富，見圖1。除膽管癌（CHOL）、睪丸生殖細(xì)胞腫瘤（TGCT）、胸腺瘤（THYM）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）、肉瘤（SARC）外，其他腫瘤組織中MEG3 表達(dá)均較正常組織低；除頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）外，其他腫瘤組織中MEG3表達(dá)與正常組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見圖2。在泛膠質(zhì)瘤（GBMLGG）組織中MEG3 表達(dá)低于正常腦組織（P均＜0.05），見圖3。MEG3 的表達(dá)同泛膠質(zhì)瘤的WHO 分級(jí)、IDH 的突變狀態(tài)無關(guān)，與1p/19q共缺少關(guān)系密切，見圖3。

圖1 MEG3在各正常組織中的表達(dá)

圖2 MEG3在各腫瘤組織中的表達(dá)

圖3 MEG3在TCGA-GBMLGG中的表達(dá)及其與典型分子分型的關(guān)系

2.2 MEG3 對(duì)膠質(zhì)瘤診斷及預(yù)后評(píng)估的價(jià)值 納入GTEx 數(shù)據(jù)庫中1 157 例正常腦組織以及鑒別GBMLGG 數(shù)據(jù)集中689例腫瘤組織。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，MEG3 診斷腫瘤的曲線下面積為0.944，95% CI為0.934～0.954。其最佳截?cái)嘀禐?.24，靈敏度為0.926，特異度為0.860。

基 于TCGA-LGGGBM 中 臨 床 數(shù) 據(jù)［17］，按 照MEG3 表達(dá)截?cái)嘀担ń財(cái)嘀担?0%）分組，將泛膠質(zhì)瘤患者（LGGGBM）患者劃分為高表達(dá)組（High）和低表達(dá)組（Low），標(biāo)準(zhǔn)化MEG3 表達(dá)量后繪制生存曲線，在GBMLGG 患者中高表達(dá)組有更好的預(yù)后（HR=0.84），單獨(dú)比較GBM 患者中也得到同樣結(jié)論（HR=0.73），而且高表達(dá)組擁有更好的無病生存預(yù)后（HR=0.79）。

2.3 MEG3 的功能 基因本體論（GO）分析結(jié)果：生物學(xué)過程（BP）部分MEG3主要與突觸傳導(dǎo)信號(hào)通路、細(xì)胞膜電位調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)正相關(guān)，與免疫相關(guān)的通路如抗原呈遞提呈、DNA 損傷反應(yīng)、白細(xì)胞黏附等負(fù)相關(guān)；細(xì)胞組分（CC）部分主要與突觸膜、轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體等正相關(guān)，與染色體、囊泡腔和細(xì)胞基質(zhì)連接負(fù)相關(guān)；分子功能（MF）部分主要與主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、單價(jià)無機(jī)陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、鳥苷酸交換因子活動(dòng)正相關(guān)，與蛋白酶體結(jié)合、電子轉(zhuǎn)運(yùn)、未折疊蛋白結(jié)合、核苷酸轉(zhuǎn)移酶活動(dòng)、細(xì)胞因子結(jié)合、核糖核蛋白復(fù)合體負(fù)相關(guān)。

通路富集分析結(jié)果：神經(jīng)元系統(tǒng)、心臟傳導(dǎo)和胺配體結(jié)合受體為正相關(guān)通路、白細(xì)胞介素10 信號(hào)、下游TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、小RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、G2/M檢查點(diǎn)、抗原加工-交叉呈遞、中性粒細(xì)胞脫顆粒、干擾素刺激基因的抗病毒機(jī)制為負(fù)相關(guān)通路。

2.4 MEG3在免疫調(diào)節(jié)及免疫浸潤過程中的作用 基于差異基因算法獲取差異表達(dá)基因共56 494 個(gè)，其中符合log2Foldchange 絕對(duì)值＞1.5 且P＜0.05 的差異表達(dá)基因共256 個(gè)。MEG3 的差異表達(dá)基因主要富集居前三位的是免疫球蛋白生成、補(bǔ)體激活經(jīng)典通路及長時(shí)程增強(qiáng)。該結(jié)果與Linkedomics 分析的結(jié)果近似，都反應(yīng)出與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的特征以及與免疫活動(dòng)相關(guān)的重要特征?；诓町惐磉_(dá)基因的GESA 分析結(jié)果，負(fù)相關(guān)前四位主要是γ 干擾素反應(yīng)、α 干擾素反應(yīng)、Myc 靶點(diǎn)氧化磷酸化；正相關(guān)前四位主要是Hedgehog 信號(hào)通路、Kras 信號(hào)通路、胰腺β細(xì)胞和精子生成。

用單樣本基因富集分析（ssGSEA）算法對(duì)GBM/LGG 基因集的每一個(gè)樣本計(jì)算對(duì)對(duì)應(yīng)的得分，推斷每個(gè)樣本的免疫細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果顯示GBMLGG 融合隊(duì)列中與類漿細(xì)胞樹突狀細(xì)胞、CD56高表達(dá)自然殺傷細(xì)胞正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值＞0.2；與細(xì)胞毒性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值＞0.2。單獨(dú)比較LGG 數(shù)據(jù)隊(duì)列發(fā)現(xiàn)正相關(guān)情況同融合隊(duì)列，負(fù)相關(guān)中巨噬細(xì)胞絕對(duì)值＞0.2，且接近0.4，中性粒細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞、激活樹突狀細(xì)胞，Th17 細(xì)胞的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值均＞0.2。而GBM 數(shù)據(jù)隊(duì)列的結(jié)果中正相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值＞0.2 的細(xì)胞類型為Tcm、Tem細(xì)胞，負(fù)相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值＞0.2 的細(xì)胞為細(xì)胞毒性細(xì)胞、T 細(xì)胞。同時(shí)對(duì)富集得分和24 種免疫細(xì)胞類型按照MEG3 表達(dá)高低分組后進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞、類漿細(xì)胞樹突狀細(xì)胞、CD56 高強(qiáng)度自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、細(xì)胞毒細(xì)胞和激活樹突狀細(xì)胞的富集分?jǐn)?shù)在高M(jìn)EG3 組、低MEG3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。其中T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞、激活樹突狀細(xì)胞中MEG3低表達(dá)組的富集分?jǐn)?shù)更高，類漿細(xì)胞樹突狀細(xì)胞在MEG3高表達(dá)組中的富集分?jǐn)?shù)更高。

用TIMER 數(shù)據(jù)庫對(duì)基于純度矯正的免疫浸潤結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在GBM 中，MEG3的表達(dá)與CD8陽性T細(xì)胞（純度矯正相關(guān)系數(shù)0.206）、樹突狀細(xì)胞（純度矯正相關(guān)系數(shù)-0.18）浸潤相關(guān)性較強(qiáng)；在LGG中，MEG3的表達(dá)與B細(xì)胞（純度矯正相關(guān)系數(shù)-0.309）、CD8 陽性T 細(xì)胞（純度矯正相關(guān)系數(shù)-0.299）、CD4陽性T 細(xì)胞（純度矯正相關(guān)系數(shù)-0.243）、巨噬細(xì)胞（純度矯正相關(guān)系數(shù)-0.297）、中性粒細(xì)胞（純度矯正相關(guān)系數(shù)-0.22）、樹突狀細(xì)胞（純度矯正相關(guān)系數(shù)-0.326）浸潤相關(guān)性較強(qiáng)。

3 討論

LncRNA 被定義為轉(zhuǎn)錄本長度超過200 個(gè)核苷酸且不會(huì)被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA［18］。隨著研究的深入，這一概念盡管有不完備之處，但仍被廣泛接受。在鑒定LncRNA 的一般定義中人們會(huì)以保守性和非編碼性來驗(yàn)證其性質(zhì)。LncRNA 曾被認(rèn)為是RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)品，沒有生物學(xué)功能，但截至目前，已有大量LncRNA 已被證明可調(diào)節(jié)細(xì)胞過程，如染色體和基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活和干擾以及核轉(zhuǎn)運(yùn)等，這些LncRNA 的功能值得我們進(jìn)一步深入鑒定與研究?，F(xiàn)在認(rèn)為LncRNA 在正常的大腦發(fā)育以及包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生在內(nèi)的多種疾病過程中發(fā)揮著重要作用。有趣的是，某些LncRNA 與膠質(zhì)瘤的起始、分化、進(jìn)展、復(fù)發(fā)和干細(xì)胞樣特征密切相關(guān)，因此可用于亞分類、診斷和預(yù)后。LncRNA 還可以作為潛在的治療靶點(diǎn)以及治療膠質(zhì)瘤的新型生物標(biāo)志物［19］。

LncRNA MEG3是母系表達(dá)的印記基因，位于染色體14q32.3，是一類核定位的LncRNA。該基因在許多正常組織中表達(dá)，但在不同組織來源的多種癌細(xì)胞系中表達(dá)缺失。已有大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并且其還與腫瘤抑制基因p53 相互作用，并調(diào)節(jié)p53 靶基因的表達(dá)［13］。多項(xiàng)研究表明該基因是一種腫瘤抑制基因，如：MEG3 通過調(diào)節(jié)miR-9-5p/QKI-5 軸 抑 制 前 列 腺 癌 的 進(jìn) 展［20］；MEG3 通過p53 信號(hào)通路抑制胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移［21］等。在膠質(zhì)瘤中，MEG3 被證實(shí)在基因毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中上調(diào)，同時(shí)與TUG1BC20 0MIR155HG 等LncRNA 有一定的協(xié)同現(xiàn)象［22］，已有研究證實(shí)MEG3過表達(dá)時(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖受到抑制、細(xì)胞凋亡增加［23］，這種抗增殖功能主要通過抑制MDM2 和激活p53 信號(hào)通路發(fā)揮作用［21，24］。MEG3敲除小鼠模型揭示了MEG3在調(diào)節(jié)大腦血管形成中的功能作用。在MEG3-null 胚胎的大腦中觀察到微血管形成的增加，以及參與VEGF 血管生成途徑的基因表達(dá)升高。此外，在大多數(shù)臨床無功能的垂體腺瘤中觀察到MEG3的表達(dá)缺失［25-26］，以上研究結(jié)果表明MEG3作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)具有相當(dāng)大的潛在意義。本研究首次系統(tǒng)總結(jié)了MEG3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況以及首次闡明了其與膠質(zhì)瘤免疫浸潤等密切相關(guān)。

本研究基于生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)，MEG3 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著降低，而且值得注意的是這種降低并沒有明顯的等級(jí)趨勢(shì)，即WHO 2～4 級(jí)中的MEG3 表達(dá)含量均顯著降低。而且MEG3 與1p/19q共缺失顯著相關(guān)。在臨床預(yù)后方面與其他相關(guān)研究所得出的結(jié)論一致，高表達(dá)MEG3 分組的患者整體臨床預(yù)后更佳。診斷效能方面MEG3可以作為鑒別膠質(zhì)瘤和正常腦組織的生物標(biāo)志物，提示MEG3 有望作為診斷性靶點(diǎn)協(xié)助膠質(zhì)瘤邊緣標(biāo)記或術(shù)中快速診斷使用。分別對(duì)MEG3相關(guān)表達(dá)基因集、MEG3分組數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，兩者的功能富集得到的結(jié)論近似，基于MEG3 相關(guān)表達(dá)基因集的功能富集顯示神經(jīng)元系統(tǒng)、心臟傳導(dǎo)和胺配體結(jié)合受體為正相關(guān)通路，白細(xì)胞介素10信號(hào)、下游TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、小RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、G2/M 檢查點(diǎn)、抗原加工-交叉呈遞、中性粒細(xì)胞脫顆粒、干擾素刺激基因的抗病毒機(jī)制為負(fù)相關(guān)通路，而使用MEG3 分組的差異基因富集功能顯示免疫球蛋白生成、補(bǔ)體激活經(jīng)典通路以及長時(shí)程增強(qiáng)為主要富集通路。以上兩方面提示，MEG3 可能與神經(jīng)系統(tǒng)的免疫功能密切相關(guān)。基于全部56 494 個(gè)基因的GESA 分析提示，干擾素可能參與了MEG3 相關(guān)的免疫功能調(diào)節(jié)。ssGESA 和TIMER 進(jìn)一步分析了其與免疫功能的關(guān)系，MEG3低表達(dá)的腫瘤組織可能存在細(xì)胞毒性細(xì)胞與巨噬細(xì)胞浸潤的差異，與既往研究中的膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)抑制性免疫微環(huán)境相關(guān)。另外，低級(jí)別膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)顯示了更為活躍的免疫浸潤性。

綜上所述，膠質(zhì)瘤患者的LncRNA MEG3 表達(dá)顯著降低，其表達(dá)降低有可能是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤免疫治療效果不理想的重要原因，這種表達(dá)模式可能與膠質(zhì)瘤獨(dú)特的免疫微環(huán)境相關(guān)，基于MEG3 表達(dá)調(diào)控相關(guān)的膠質(zhì)瘤研究有望成為免疫治療的重要目標(biāo)。