基于微生物組擴增子ITS的茯磚茶發(fā)花特征真菌菌群演替規(guī)律分析

姚衡斌，馬敬宜，馮瀚瀚，趙仁亮

（河南農(nóng)業(yè)大學園藝學院茶學系 鄭州 450046）

茯磚茶屬于后發(fā)酵茶，微生物大量參與茯磚茶的后發(fā)酵過程[1]。茯磚茶的后發(fā)酵工藝與其它黑茶稍有不同，主要分為2 個階段： 一是黑毛茶階段，剛采摘的鮮葉通過一系列工藝制成黑毛茶。渥堆是該階段的主要工藝，是濕熱作用、微生物及酶共同作用[2]。二是發(fā)花階段，黑毛茶經(jīng)過氣蒸、壓制成型、發(fā)花等工藝步驟形成茯磚茶。發(fā)花也是一個微生物發(fā)酵過程，研究表明，發(fā)花階段多種微生物迅速繁殖，茶磚中物質分解，代謝產(chǎn)物積累，微環(huán)境變化，菌群的不斷演替，最終由散囊菌屬（Eurotium）的1 種或幾種成為優(yōu)勢菌種，也就是“金花菌”，“金花”即是這些“金花菌”的閉囊殼。

“菌花香”是優(yōu)質茯磚茶的特征香氣，是評價茯磚茶優(yōu)劣的重要標準。 實踐發(fā)現(xiàn)有“菌花”的茯磚茶不一定有“菌花香”。 金友蘭等[3]分析發(fā)花白茶、發(fā)花紅茶、茯磚茶的香氣成分，結果發(fā)現(xiàn)不同茶類發(fā)花的香氣物質存在顯著差異。有研究表明[4]不同產(chǎn)地的茯磚茶“菌花香”也不相同。 推測可能由于不同的茶樹品種和生長環(huán)境導致原料內(nèi)涵物質的不同，意味著原料香氣前體物質的種類及含量不同，且供后發(fā)酵微生物生長的碳源、氮源及多種微量元素的種類及含量不同，因此不同地區(qū)的茯磚茶發(fā)花微生物菌群差異顯著[5]，提示微生物可能是產(chǎn)生茯磚茶“菌花香”的關鍵因素。劉石泉等[6-7]使用DGGE 技術揭示優(yōu)勢微生物是隨著發(fā)花過程而動態(tài)改變，表明“菌花香”可能并不只是冠突散囊菌（Eurotium_cristatum）作用的結果，有其它微生物或微生物菌群進行代謝或提供胞外酶，多種微生物交替發(fā)酵共同形成“菌花香”。因此，對發(fā)花過程微生物的解析較為關鍵。

由于技術限制，過去對發(fā)花微生物的研究以優(yōu)勢菌株的分離，并通過形態(tài)學鑒定為主[8]，而微生物種類繁多，目前成功分離培養(yǎng)的微生物僅占全部的0.1%～1.0%[9]。后來發(fā)展出利用變性梯度凝膠電泳使不同的堿基排列的DNA 片段在凝膠上分離獲得微生物多樣性的PCR-DGGE 方法[10]。 研究人員使用DGGE 技術研究茯磚茶微生物的群落結構，鑒定出多種酵母菌屬、曲霉屬、及數(shù)種不可培養(yǎng)微生物[11]。 DGGE 技術的缺點是通量較低，不能完整反映復雜的環(huán)境微生物群落。 宏基因組學技術[12]利用二代測序技術[13]通量高的特點，將環(huán)境中的微生物全部DNA 提取分箱[14]，能夠獲得較為完整的環(huán)境微生物的基因組信息[15]。 然而，宏基因組數(shù)據(jù)量大，分析較為困難，可以僅擴增微生物的特殊片段[16]以達到獲得環(huán)境微生物多樣性及豐度的目的，這就是微生物組擴增子技術[17]。

白茶經(jīng)鮮葉萎凋干燥而成[18]，在常溫下可以長期保存[19]，和茯磚茶一樣有緊壓茶產(chǎn)品。 由于低級白茶所用原料與茯磚茶原料嫩度一致，因此選用白茶磚作為對照與黑茶一起發(fā)花制成發(fā)花白茶與茯磚茶。

本研究采用微生物組擴增子ITS，對信陽羅山同一茶葉原料制成的黑茶與白茶進行發(fā)花試驗。其中，白茶作為對照，圍繞發(fā)花過程中的特征菌群演替規(guī)律，運用多種分析方法，通過兩種茶類發(fā)花的對比分析，揭示茯磚茶發(fā)花特征真菌菌群演替規(guī)律，為闡明“菌花香”與微生物菌群的關系，合理控制發(fā)花過程，為我國茯磚茶發(fā)花工藝改進提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

本研究供試材料為申林茶業(yè)開發(fā)有限公司的藪北茶樹品種[20]。 2020年6月18日采摘茶樹鮮葉，采摘標準為1 芽5～6 葉。鮮葉采摘后分別使用黑茶及白茶初制工藝制成相應毛茶。 2020年12月13日將兩種毛茶均潮水至含水量28%，然后汽蒸10 s，壓制成磚茶。 立即隨機取3 個平行樣本，其中黑茶磚D1.1、D1.2、D1.3，白茶磚W1.1、W1.2、W1.3，將剩余茶磚置入全新的烘房，烘房溫度28℃，濕度80%，分別在發(fā)花的第6 天取樣（D6.1，D6.2，D6.3，W6.1，W6.2，W6.3），第9 天取樣（D9.1，D9.2，D9.3，W9.1，W9.2，W9.3），第12 天取樣（D12.1，D12.2，D12.3，W12.1，W12.2，W12.3），第22 天取樣（D22.1，D22.2，D22.3，W22.1，W22.2，W22.3），取樣后立即置于-80 ℃條件保存。

1.2 主要儀器與試劑

DYY-8C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Tanon 3500 凝膠成像系統(tǒng)，上海天能生命科學有限公司。

高保真PCR 預混緩沖液和高效高保真酶，New England Biolabs 公司； 膠回收試劑盒，QIAGEN 公司； 建庫試劑盒、NovaSeq6000 測序平臺，Illumina 公司。

1.3 方法

1.3.1 真菌鑒定 提取全部樣品DNA，檢測DNA的純度和濃度。 將DNA 樣本于離心管中稀釋至1 ng/μL。 以稀釋后的基因組DNA 為模板，使用帶Barcode 的真菌ITS1 區(qū)標準特異引物ITS5-1737F（5′ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3′ ） 及ITS2-2043R （5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），進行PCR 擴增。 PCR 產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，合格的PCR 產(chǎn)物進行磁珠純化，采用PCR-ELISA 定量，根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等量混樣，混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，對目的條帶使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用建庫試劑盒進行文庫構建。構建好的文庫經(jīng)Qubit 和Q-PCR 定量，文庫合格后測序。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析 從下機數(shù)據(jù)中拆分各樣本數(shù)據(jù)并去除Barcode 和引物序列，然后使用FLASH（v1.2.7）[21]對各樣本的reads 拼接，得到的拼接序列為Raw Tags，使用Qiime 軟件（v1.9.1）將Raw Tags中連續(xù)低質量（質量閾值≤19）堿基數(shù)達到3 的低質量部分截去，并進一步過濾掉其中連續(xù)高質量堿基長度小于Tags 長度75%的Tags。過濾掉含低質量堿基較多的序列[22]，得到高質量的Clean Tags。 Clean Tags 序列使用VSEARCH（v2.17.1）去除嵌合體序列[23]，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。

使用R 軟件（v 2.15.3）制作稀釋曲線，并確定抽平數(shù)，使用Uparse 算法[24]（Uparse v7.0.1001）對抽平（Subsample）后的Effective Tags 進行97%一致性聚類聚類，共聚為566 個OTUs，將OTUs 序列數(shù)據(jù)上傳至國家微生物科學數(shù)據(jù)中心（https：//www.nmdc.cn/），登錄號為NMDCX0000111。

篩選出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs 的代表序列，使用Qiime 軟件（v 1.9.1）比對Unit（v8.2）[25]數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，使用MUSCLE（v3.8.31）[26]比對序列，得到OTUs 序列的系統(tǒng)發(fā)生關系。 最后以樣本數(shù)量最少的為標準進行均一化處理，以便后續(xù)分析。

使用Qiime 軟件 （v1.9.1） 計算Chao1、Shannon、Simpson、PD_whole_tree、Goods_coverage 等 指數(shù)，計算Unifrac 距離、構建UPGMA 聚類樹，使用SPSS 軟件（v22）進行組間差異分析，使用R 軟件的pheatmap 包（v1.0.12）繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 茯磚茶與白茶磚發(fā)花情況

兩種類型的茶磚發(fā)花情況見圖1。 茯磚茶D9已有零星“金花菌”出現(xiàn)，D12 出現(xiàn)大量“金花菌”，D22 的“金花菌”茂盛。 白茶磚中W12 有零星“金花菌”，W22 的“金花菌”較為茂盛。

圖1 兩種類型茶磚發(fā)花過程Fig.1 The flowering process of two types of tea bricks

2.2 擴增子測序結果

兩類茶磚發(fā)花過程樣本測序結果見表1。 經(jīng)質控所得Effective Tags 在Raw PE 中所占比例在59.43%～67.24%之間。 各樣本Effective Tags 經(jīng)97%聚類注釋后，獲得OTUs 數(shù)量在109～247 之間，單個樣本的ITS1 序列數(shù)均超過60 712 條，因每個樣品獲得的ITS1 序列數(shù)不同，故對數(shù)據(jù)進行抽平。 從各樣本中隨機抽取一定測序量的數(shù)據(jù)（10，6 922，13 834，20 746，27 658，34 570，41 482條序列），統(tǒng)計所代表的OTUs 的數(shù)目，繪制稀疏曲線（圖2）。當測序序列數(shù)達41 482 條時，各樣本曲線趨于平緩，表示測序深度充足且合理，因此按41 482 對數(shù)據(jù)進行抽平。

圖2 各樣本物種稀疏曲線Fig.2 Rarefaction Curve of samples

表1 所有樣本測序及質控結果Table 1 Sequencing and quality control results of all samples

各樣品非加權UPGMA 聚類分析見圖3。茯磚茶D12 與D22 聚為一類，白茶磚W12 與W22 聚為一類，表明在發(fā)花最后10 d 兩類茶磚真菌菌群多樣性存在差異。 由非加權Unifrac 距離及物種多樣性堆積圖可知，各樣本在不同發(fā)花時期真菌多樣性差異不大。

圖3 基于非加權Unifrac 距離的UMGMA 聚類樹Fig.3 Unweighted Unifrac distance-based UMGMA cluster tree

再對各樣品進行加權UPGMA 聚類分析，同時分析在門水平上的物種相對多樣性及豐度。 如圖4 所示，D1 與W1 聚為一類，D6 與W6 聚為一類，D22 與W22 聚為一類，表明發(fā)花前期及后期真菌群落豐度在茯磚茶及白茶磚間無顯著差異，而發(fā)花中期（第9 天，第12 天）存在差異。 由圖4堆積圖所示，伴隨發(fā)花過程，子囊菌門相對豐度持續(xù)升高，至22 d 發(fā)花結束，子囊菌門豐度占比在兩類茶中均超過90%，表明發(fā)花過程與子囊菌門真菌的相對豐度上升有關。

圖4 基于加權Unifrac 距離的UPGMA 聚類樹Fig.4 Weighted Unifrac distance-based UPGMA cluster tree

（續(xù)表1）

2.3 真菌群落多樣性和豐度指數(shù)

對兩類茶磚在發(fā)花過程各樣品OTUs 進行Shannon、Simpson、Chao1、PD_whole_tree 等指數(shù)的統(tǒng)計分析，結果顯示：兩茶類Shannon、Simpson 指數(shù)均下降，茯磚茶中Chao1 指數(shù)和PD_whole_tree下降，而白茶磚中無顯著變化，Goods_coverage 顯示測序覆蓋度均在99.9%以上（表2）。

表2 兩茶類發(fā)花過程中的真菌群落多樣性和豐度指數(shù)Table 2 Fungi community diversity and abundance index in the flowering process of the two tea types

2.4 總體真菌群落多樣性和豐度

從微生物組擴增子（ITS）中共檢測566 個OTUs，分屬5 門、19 綱、45 目、99 科、160 屬、214 個菌株，其中有131 個菌株鑒定至種水平。門水平上豐度依次是子囊菌門（Ascomycota）（60.4%）、擔子菌門 （Basidiomycota）（35.7%）、 球囊菌門（Glomeromycota）（1.3%），壺菌門（Chytridiomycota）及毛霉門（Mucoromycota）豐度低于1%。 以可檢測到的最小真菌分類水平為基準，按豐度由高到低將總豐度前100 的真菌排序見表3。Top10 的真菌占總豐度的93.77%，Top50 的真菌占總豐度的97.20%，Top100 的真菌占總豐度的97.35%，其它真菌總豐度小于0.001%，未檢出分類的OTUs 占比2.6144%，可見豐度Top10、Top50、Top100 均超過90%，可以較好地代表總體樣本。

表3 豐度前100 的真菌鑒定最小分類水平排序Table 3 The top 100 fungi in abundance were identified by sorting at the minimum taxonomic level

（續(xù)表3）

（續(xù)表3）

2.5 發(fā)花過程真菌豐度動態(tài)變化

茯磚茶與白茶磚在發(fā)花過程中真菌豐度變化如圖5 所示。 熱圖將Top50 的真菌聚為3 類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。Ⅰ類真菌在兩類茶中起始豐度較低，在發(fā)花各階段分別有豐度峰，白茶磚中散囊菌屬、假灰綠曲霉、海洋嗜殺酵母、卡利比克邁耶氏酵母等的豐度峰出現(xiàn)在6～9 d，而在茯磚茶中豐度峰出現(xiàn)在9～12 d，22 d 的散囊菌屬豐度最高，最終成為優(yōu)勢菌種。 Ⅱ類真菌在白茶磚中的豐度明顯高于茯磚茶，且在發(fā)花初期及中期豐度較高，茯磚茶的第2個豐度峰在9 d，而白茶的第2 個峰在12 d，在22 d 豐度降至最低。 Ⅲ類真菌在茯磚茶中的豐度顯然高于白茶，且茯磚茶豐度峰集中在6 d，白茶磚中沒有明顯豐度峰。 交叉散尾鬼筆、傘菌目、粉側擔菌在白茶中1～6 d 比茯磚茶的豐度稍低，黑曲霉在茯磚茶中前1～12 d 維持較高豐度，而在白茶磚中豐度維持較低水平。

圖5 Top50 真菌的豐度動態(tài)熱圖Fig.5 Heatmap of the abundance of Top50 fungi

2.6 Top10 的真菌動態(tài)變化

豐度Top10 的真菌占總體樣本豐度的93.77%，分別以堆積圖（圖6）及熱圖（圖7）表示豐度動態(tài)變化。 圖6 所示，在發(fā)花初期，散囊菌屬與假灰綠曲霉在發(fā)花初期豐度較低（3%～6%），D9 與W6 中散囊菌屬大量繁殖，而D12 與W9 中散囊菌屬豐度下降，假灰綠曲霉大量繁殖，22 d 散囊菌屬豐度再度上升，在整個發(fā)花過程中，此兩真菌交替成為優(yōu)勢菌種。 粉側擔菌豐度較高（59.2%，49.2%），在茯磚茶中不斷下降，在白茶磚中12 d 有所回升，22 d 豐度降至較低水平（2%左右）；而同為擔子菌的交叉散尾鬼筆豐度變化與粉側擔菌保持同步，且豐度平均為粉側擔菌的35%（標準偏差0.12）。黑曲霉在茯磚茶中D1～D12 相對豐度由5.2%緩慢降至3.8%，在D22 驟降至0.08%，而在白茶中由W1 的0.15%緩慢降至W22 的0.07%，是Top10真菌中兩類茶差別較大的菌種。 圖7 所示熱圖將Top10 真菌聚為兩組，一組為散囊菌屬、假灰綠曲霉、黑曲霉3 種菌豐度變化各不相同；另一組7 種真菌在兩類茶內(nèi)豐度變化相似，在茯磚茶中D1 至D9 豐度較高，且呈下降趨勢，D12 至D22 豐度驟降至較低水平，白茶磚中W1 至W9 豐度下降，W12 豐度有所上升，W22 驟降至較低水平。

圖6 Top10 真菌的相對豐度動態(tài)堆積圖Fig.6 Dynamic accumulation relative abundance dynamics of Top10 fungi

圖7 Top10 真菌的相對豐度動態(tài)熱圖Fig.7 Dynamic heatmap of relative abundance of Top10 fungi

3 結論與討論

本研究中，兩類茶在22d 均發(fā)花成功，且測序結果表明不同茶類的發(fā)花真菌多樣性沒有顯著差異。有研究表明不同地區(qū)原料、不同環(huán)境的發(fā)花微生物有所不同[27-28]。 本試驗控制原料相同，發(fā)花環(huán)境一致，證明毛茶加工工藝不同并不導致發(fā)花真菌多樣性的顯著差異，而茯磚茶與白茶磚 “菌花香” 的不同可能是由微生物菌群豐度動態(tài)變化不同所致。

由于散囊菌屬ITS 一區(qū)不能鑒定到種水平，因此將“金花菌”鑒定到屬水平（散囊菌屬）。 有研究表明“金花菌”應歸為散囊菌屬[29]，相關研究較為明晰。本研究認為鑒定出的散囊菌屬真菌即“金花菌”的1 種或幾種。

通過圖5 將Top50 的真菌聚為3 類，同時對比茯磚茶與白茶磚菌群演替的差異，獲得茯磚茶發(fā)花特征真菌菌群演替規(guī)律，即： 茯磚茶發(fā)花前期，第Ⅲ類真菌中的黑曲霉、局限曲霉、薩氏曲霉、岐皺青霉、西蘭花青霉、漢遜德巴利酵母在D6 出現(xiàn)豐度峰；之后D9 散囊菌屬、卡利比克邁耶氏酵母、海洋嗜殺酵母出現(xiàn)豐度峰，黑曲霉、漢遜德巴利酵母、局限曲霉維持豐度；D12 假灰綠曲霉出現(xiàn)豐度峰，黑曲霉繼續(xù)維持豐度，D22 散囊菌屬最終成為優(yōu)勢菌種。由于茯磚茶的原料是黑毛茶，其獨特的工藝“渥堆”過程中黑曲霉、酵母菌、青霉、根霉是主要的微生物[30]，研究表明曲霉屬在渥堆過程中能產(chǎn)生單寧酶、糖苷酶、漆酶等胞外酶[31]，與本研究茯磚茶中Ⅲ類真菌D1 時期豐度高于白茶磚結果一致，表明茯磚茶發(fā)花特征真菌有一部分是渥堆大量繁殖的真菌，并在發(fā)花前期進行代謝與繁殖維持一定的豐度。 圖5 的第Ⅱ類真菌在茯磚茶中的豐度明顯低于白茶磚，可能是由于茯磚茶經(jīng)過渥堆，某些微生物生長改變了微生物菌群結構[32]，消耗了部分營養(yǎng)物質；渥堆產(chǎn)生的較高溫度使得不適的微生物豐度下降，Ⅱ類真菌豐度因此下降，并在發(fā)花過程中豐度持續(xù)下降，在D9 有小幅度回升，至D12 豐度降至極低水平，Ⅱ類真菌在先前發(fā)花真菌研究中鮮有報道，而在茶葉內(nèi)生真菌研究中有所報道[33]。 對比白茶磚中的豐度可知，Ⅱ類真菌可能在發(fā)花過程中是負貢獻微生物，該結論指導白茶磚發(fā)花生產(chǎn)前處理應比茯磚茶增加滅菌步驟。 Ⅰ類真菌是茯磚茶與白茶磚共有的發(fā)花真菌，大多在先前的研究中有報道，如散囊菌屬是“金花菌”的集合，假灰綠曲霉是匍匐散囊菌的無性型，赤曲霉則是赤散囊菌的無性型[29]，這3種金花菌在發(fā)花過程中交替成為優(yōu)勢菌種，見圖5。 首先是散囊菌屬（D9、W6），假灰綠曲霉與赤曲霉豐度峰同時出現(xiàn)（D12、W9～W12），最終散囊菌屬成為優(yōu)勢菌種（D22、W22）。 有研究表明假灰綠曲霉與赤曲霉聚在一個進化枝[34]，表明二者遺傳距離較近，有較相似的演替規(guī)律。發(fā)花過程中酵母菌的研究鮮有報道。 本研究中Ⅰ類真菌中卡氏酵母與海洋嗜殺酵母同時出現(xiàn)豐度峰 （D9、W6），熱帶假絲酵母與隱球酵母屬在茯磚茶發(fā)花過程的前10 d 為優(yōu)勢菌[6]，而本研究中茯磚茶中的豐度較低，在白茶磚中、后期（W9～W22）的豐度較高，表明它們也可能不是茯磚茶發(fā)花的優(yōu)勢真菌。 通過對比Ⅰ類真菌在發(fā)花過程中豐度峰出現(xiàn)的時間，發(fā)現(xiàn)白茶磚中多數(shù)真菌豐度峰比茯磚茶中的豐度峰提前3 d 左右出現(xiàn)，這可能是茯磚茶發(fā)花過程中菌群演替規(guī)律，可能是茯磚茶渥堆改變了Ⅲ類菌群的豐度，同時消耗了茶磚的營養(yǎng)物質，這仍需進一步研究。

研究茯磚茶發(fā)花過程中特征真菌菌落演替是解析茶葉發(fā)花過程至關重要的一步，微生物組學的應用，能夠將大多數(shù)微生物鑒定到種一級，能夠深刻認知發(fā)花過程，對于后續(xù)分析各種微生物在發(fā)花過程中的作用奠定基礎，對揭開真菌與茯磚茶品質風味形成的關系有重要意義。