軟棗獼猴桃發(fā)酵酒酶解工藝優(yōu)化及指標(biāo)分析

劉宇欣，王夢澤，溫福田，關(guān)秀玲，N.V.斯克里普琴科，丁玉萍*，劉德江*

（1.佳木斯大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.中-烏農(nóng)林技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用國際合作聯(lián)合實驗室，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯市檢驗檢測中心，黑龍江 佳木斯 154004；4.烏克蘭國家科學(xué)院M.M.格里什科國家植物園，烏克蘭 基輔 01014）

軟棗獼猴桃 [Actinidia arguta（Sieb.&Zucc）Planch.exMiq.]也被稱為軟棗子，是屬于獼猴桃科、獼猴桃屬的一類藤本植物。軟棗獼猴桃含有維生素C、維生素B8、類胡蘿卜素，賴氨酸、異亮氨酸等人體必需8種氨基酸[1-4]。此外，軟棗獼猴桃還含有黃酮類、多糖、多酚、萜類、皂苷、生物堿等活性成分[5-9]。但軟棗獼猴桃果膠含量較多[10]、出汁較少，因此，在制作果酒時，需要添加果膠酶進(jìn)行酶解，以提高出酒率。由于維生素C是一種對光、熱極其敏感的一種水溶性維生素[11]，酶解過程中酶解溫度及酶解時間會影響軟棗獼猴桃酒中維生素C的含量。本試驗通過對軟棗獼猴桃酒酶解工藝的優(yōu)化，探究其對出酒率及理化指標(biāo)的影響，以提高軟棗獼猴桃出汁率，降低維生素C損失。本文可為軟棗獼猴桃果酒釀造工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃：佳木斯大學(xué)農(nóng)林試驗實習(xí)基地；白砂糖：市售；漿果果膠酶（≥21 000 μ/mL）：滄州夏盛生物技術(shù)有限公司；帝伯仕酵母：煙臺帝伯仕酵母有限公司；拉曼德酵母：法國拉曼德公司；葡萄糖、酒石酸鉀鈉：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；3，5-二硝基水楊酸：湖州市菱湖望菱試劑廠；NaOH、磷酸：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；亞硫酸鈉：遼寧永強醫(yī)藥器械化玻有限公司；苯酚、草酸、堿性品紅：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；高錳酸鉀：沈陽市華東試劑廠；硫酸：天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；鹽酸：哈爾濱新春化工有限公司；試驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子天平：諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司；YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌鍋、101-1A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-250B-Z型恒溫培養(yǎng)箱：黑龍江東拓儀器制造有限公司；UV-8000紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；VS-840標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；YL288-0-100酒精計：沈陽市衛(wèi)工玻璃計器廠；2W阿貝折光儀：上海光學(xué)儀器有限公司；Y91S榨汁機：九陽股份有限公司。

1.3 工藝流程

1.4 操作要點

1.4.1 選果及處理

挑選無霉變、破損的軟棗獼猴桃果實，清洗、控干、破碎。

1.4.2 果膠酶酶解

軟棗獼猴桃與純凈水按1∶1（g/mL）混合均勻，加入果膠酶，保溫酶解。

1.4.3 調(diào)整糖分

酶解后的果漿中加入一定量的白砂糖，使可溶固形物濃度為200 g/L。

1.4.4 發(fā)酵

每升發(fā)酵液接入0.03%酵母，于25℃發(fā)酵至恒重。

1.4.5 離心過濾

將發(fā)酵完畢的酒于4 000 r/min、離心10 min后過濾得軟棗獼猴桃發(fā)酵原酒。

1.5 單因素試驗

1.5.1 果膠酶添加量

將果膠酶添加量作為單一變量，分別添加果膠酶濃度 0%、0.005%、0.010%、0.015%、0.020%，于 50℃酶解2 h，接入酵母發(fā)酵至恒重，進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.5.2 酶解溫度

固定果膠酶添加量為0.010%、酶解時間為2 h，設(shè)定酶解溫度分別為室溫[（24±1）℃]、40、50、60、70℃，其余步驟同1.5.1。

1.5.3 酶解時間

固定果膠酶添加量為0.010%、酶解溫度為50℃，酶解時間為 0、1、2、3、4 h，其余步驟同 1.5.1。

1.6 正交試驗

以果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度為因素，進(jìn)行L9（33）三因素三水平正交試驗。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.7 指標(biāo)測定

酒精度采用蒸餾酒精度計法測定；總酸/揮發(fā)酸含量采用酸堿滴定法[12]測定；甲醇含量采用品紅亞硫酸比色法[13]測定；還原糖含量采用3，5-二硝基水楊酸法[14]測定；總浸出物含量采用阿貝折光儀測定；維生素C含量采用紫外分光光度法[15-19]測定；總酯含量采用酸堿滴定法[20]測定；出酒率按以下公式計算。

按1.4.2進(jìn)行酶解、離心，上清液即為軟棗獼猴桃汁，出汁率按以下公式計算。

感官評價[21-23]：選出10名品鑒員（5男5女），分別對酒樣的口感、澄清度、風(fēng)味進(jìn)行綜合評分。取其平均值作為評分結(jié)果（滿分100），感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 軟棗獼猴桃發(fā)酵酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring standard for Actinidia arguta fermented wine

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，每個試驗樣做3次平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶添加量對軟棗獼猴桃發(fā)酵酒指標(biāo)的影響

2.1.1 果膠酶添加量對出汁率、出酒率及維生素C含量的影響

不同果膠酶添加量對出汁率、出酒率、軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC及軟棗獼猴桃汁中VC含量的影響見圖1。

圖1 果膠酶添加量對出汁率、出酒率及維生素C含量的影響Fig.1 Effects of pectinase addition on juice yield，wine yield and vitamin C content

由圖1可知，果膠酶添加量在0%～0.020%時，出汁率隨果膠酶添加量增加而升高，果膠酶添加量0%，出汁率最低，為45.45%；果膠酶添加量0.020%，出汁率最高，為49.83%；最高值與最低值相差4.38%；當(dāng)果膠酶添加量＞0.010%，出汁率增加不明顯。出酒率隨果膠酶增加先上升后降低；果膠酶添加量0%，出酒率最低，為37.00%；果膠酶添加量為0.010%時，出酒率最高，為42.67%；最高值與最低值相差5.67%。

果膠酶添加量對軟棗獼猴桃汁及發(fā)酵酒中維生素C含量影響較小，軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量均低于軟棗獼猴桃汁中維生素C含量。當(dāng)果膠酶添加量在0%～0.010%時，軟棗獼猴猴桃汁中維生素C含量略有上升；當(dāng)果膠酶添加量在0.010%～0.020%時，維生素C含量稍有下降；果膠酶添加量0.010%，軟棗獼猴桃汁中維生素C含量最高，為430 mg/L；軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量在果膠酶添加量0.005%～0.015%時，逐漸上升，果膠酶添加量為0.020%，維生素C含量下降；果膠酶添加量為0.005%，軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量最低，為246.69 mg/L，果膠酶添加量為0.015%，軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量最高，為311.49 mg/L，最高值與最低值相差64.80 mg/L。綜合考慮出酒率及維生素C含量，選定果膠酶添加量為0.010%。

2.1.2 果膠酶添加量對軟棗獼猴桃酒指標(biāo)的影響

果膠酶添加量對軟棗獼猴桃酒酒精度、還原糖、總酯含量等指標(biāo)的影響如表3所示。

表3 果膠酶添加量對軟棗獼猴桃發(fā)酵酒理化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of pectinase addition on physical and chemical indexes of Actinidia arguta fermented wine

由表3可知，酒精度隨果膠酶添加量增加逐漸增加。果膠酶添加量為0.020%，酒精度最高，為7.60%vol，比最低值高0.8%vol?？偨鑫锖侩S果膠酶添加量增加而增加，果膠酶添加量0.020%，總浸出物含量最高，為3.43 g/L。總酸含量隨果膠酶添加量增加先升高后降低，果膠酶添加量在0%～0.010%時，總酸含量逐漸上升。果膠酶添加量0.010%，總酸含量最高，為7.17g/L。當(dāng)果膠酶添加量＞0.010%，總酸含量逐漸下降，果膠酶添加量在0.020%，總酸含量最低，為6.64 g/L。甲醇含量隨著果膠酶添加量增加逐漸升高，5組酒樣中，果膠酶添加量0%，甲醇含量最低，為110.79 mg/L；果膠酶添加量0.020%，甲醇含量最高，為218.98mg/L；GB5009.266—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測定》規(guī)定：果酒甲醇≤400mg/L，因此，5組酒樣均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。隨著果膠酶添加量增加，甲醇升高的原因是果膠酶添加量越大，果膠質(zhì)分解越多，發(fā)酵生成甲醇量越多?？傰ズ侩S果膠酶添加量增加先升高后降低。果膠酶添加量0.02%時，總酯含量最低，為0.50 g/L；最高值和最低值相差0.45 g/L。感官評分隨果膠酶添加量增加先升高后降低。果膠酶添加量0%時，感官評分最低，為75.00。果膠酶添加量為0.010%時，感官評分最高，為89.00。不添加果膠酶時，酒口感厚重黏稠，感官評分最低，果膠酶添加量為0.010%時，酒口感清爽適口，感官評分最高；添加果膠酶過多會給酒帶入異雜味，影響口感。

2.2 酶解溫度對軟棗獼猴桃發(fā)酵酒指標(biāo)的影響

2.2.1 酶解溫度對出汁率、出酒率及維生素C含量的影響

酶解溫度對出汁率、出酒率、軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC、軟棗獼猴桃汁中VC含量的影響見圖2。

圖2 酶解溫度對出汁率、出酒率及維生素C含量的影響Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on juice yield，wine yield and vitamin C content

由圖2可知，酶解溫度在室溫[（24±1）℃]～70℃內(nèi)，隨溫度上升，出汁率和出酒率均先升高后降低，酶解溫度在室溫～50℃時，出汁率、出酒率逐漸上升；酶解溫度＞50℃時，出汁率、出酒率均逐漸降低。室溫時，出汁率、出酒率最低，分別為37.34%、33.10%。酶解溫度為50℃時；出汁率、出酒率最高，分別為45.37%、42.07%。出汁率最高值與最低值相差8.03%，出酒率最高值與最低值相差8.97%。

軟棗獼猴猴桃汁及軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量在酶解溫度室溫～70℃內(nèi)，逐漸降低，但軟棗獼猴猴桃發(fā)酵酒中的維生素C含量均低于軟棗獼猴桃汁中VC的含量。室溫下，汁及軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量最高，分別為448.08、255.11 mg/L；70℃下，軟棗獼猴桃汁及發(fā)酵酒VC含量最低，分別為360.76、150.28 mg/L；軟棗獼猴桃汁中VC最高值與最低值相差87.32 mg/L，軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC最高值與最低值相差104.83 mg/L。綜合出酒率及維生素C含量選定酶解溫度為50℃。

2.2.2 酶解溫度對軟棗獼猴桃酒指標(biāo)的影響

酶解溫度對軟棗獼猴桃酒酒精度、還原糖、總酯含量等指標(biāo)的影響如表4所示。

表4 酶解溫度對軟棗獼猴桃發(fā)酵酒理化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on physical and chemical indexes of Actinidia arguta fermented wine

由表4可知，總浸出物含量隨酶解溫度升高先增加后降低，酶解溫度40℃時，總浸出物含量最高，為3.44g/L；酶解溫度70℃，總浸出物含量最低，為3.40g/L；最高值與最低值相差0.04g/L?？偹岷侩S酶解溫度升高，先增加后降低，酶解溫度50℃，總酸含量最高，為7.17g/L；酶解溫度70℃，總酸含量最低，為6.43g/L；最高值與最低值相差0.74g/L。甲醇含量隨酶解溫度上升先升高后降低，酶解溫度＜60℃，甲醇含量隨溫度升高而升高，60℃，甲醇含量最高，為200.97 mg/L，酶解溫度升高到70℃，甲醇含量降為197.32 mg/L。70℃時，酶解溫度高，果膠酶酶活受到影響，分解果膠能力減弱，因此，甲醇含量降低。感官評分隨酶解溫度升高，先增加后降低，室溫酶解時，酒口感、香氣較差，感官評分最低，為76.00；酶解溫度50℃，酒口感清爽柔和，感官評分最高，為88.00。

2.3 酶解時間對軟棗獼猴桃發(fā)酵酒指標(biāo)的影響

2.3.1 酶解時間對出酒率、出汁率及維生素C含量的影響

酶解時間對出汁率、出酒率、軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC、軟棗獼猴桃汁中VC含量的影響見圖3。

圖3 酶解時間對出汁率、出酒率及維生素C含量的影響Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis time on juice yield，wine yield and vitamin C content

由圖3可知，出汁率、出酒率隨酶解時間延長，呈先增加后降低的趨勢。酶解時間為0 h時，出汁率、出酒率最低，分別為38.64%、36.91%；酶解時間2 h，出汁率、出酒率最高，分別為53.42%、43.92%；出汁率最高值與最低值相差14.78%，出酒率最高值相較最低值差7.01%。酶解時間3 h～4 h，出酒率逐漸降低；酶解時間4 h，出酒率為38.61%，略高于空白組。

軟棗獼猴桃汁及軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量隨酶解時間延長均逐漸下降，但軟棗獼猴桃汁中VC含量均高于軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量。酶解時間0 h，軟棗獼猴桃汁及軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量最高，分別為 447.26、256.31 mg/L；酶解時間 4 h，軟棗獼猴桃汁及軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量最低，分別為359.94、217.02 mg/L；軟棗獼猴桃汁中VC含量最高值比最低值高87.32 mg/L；軟棗獼猴桃發(fā)酵酒VC含量最高值比最低值高39.29 mg/L。綜合出酒率及維生素C含量選定最適酶解時間為2 h。

2.3.2 酶解時間對軟棗獼猴桃酒指標(biāo)的影響

酶解時間對軟棗獼猴桃酒酒精度、還原糖、總酯含量等指標(biāo)的影響如表5所示。

表5 酶解時間對軟棗獼猴桃發(fā)酵酒理化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of enzymatic hydrolysis time on physical and chemical indexes of Actinidia arguta fermented wine

由表5可知，酒精度隨酶解時間延長，先升高后降低，酶解時間2 h，酒精度最高，為8.00%vol，最高值比最低值高0.33%vol。總浸出物含量隨酶解時間延長逐漸增加，酶解時間4h，總浸出物含量最高，為3.51g/L；最高值比最低值高0.33 g/L。揮發(fā)酸含量隨酶解時間延長逐漸降低，但相差不大。甲醇含量隨酶解時間延長逐漸增加，酶解時間0 h，甲醇含量最低，為130.50 mg/L；酶解時間4 h，甲醇含量最高，為198.79 mg/L；最高值比最低值高68.29 mg/L。甲醇含量在0～2 h時，增加幅度較大，酶解時間超過2 h，甲醇含量上升幅度較小。感官評分隨酶解時間延長先升高后降低，酶解時間2h，酒香濃郁、口感清爽，感官評價最高，評分為89.00；酶解時間0 h，酒樣果香較濃，但口感較為黏稠，感官評價最低，評分為77.00。

2.4 正交試驗結(jié)果分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度為因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗，以出酒率作為考察指標(biāo)，正交試驗結(jié)果與分析見表6～表7。

表6 正交試驗結(jié)果Table 6 Results of orthogonal test

表7 基于出酒率的正交試驗結(jié)果方差分析Table 7 Analysis of variance of orthogonal test results based on wine yield

由極差分析可知，各因素對出酒率影響的主次為B＞A＞C，即，對出酒率的影響酶解溫度是主要影響因素，果膠酶添加量是次要影響因素，酶解時間影響最?。挥煞讲罘治隹芍?，果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間對軟棗獼猴桃果酒出酒率均有極顯著影響（P＜0.01）。R2=0.923，R2adj=0.917，分析 K 值得出酶解工藝優(yōu)化組合為A2B3C1；直接觀察9組試驗中出酒率最高的組合為A2B3C2。

2.5 對比試驗結(jié)果分析

將正交試驗結(jié)果得出最佳優(yōu)化組合及直接觀察最佳組合進(jìn)行對比試驗，結(jié)果為試驗組A2B3C2軟棗獼猴桃漿出酒率為48.46%，正交優(yōu)化組A2B3C1軟棗獼猴桃漿出酒率為49.38%，結(jié)果優(yōu)于試驗組。即軟棗獼猴桃酒最優(yōu)酶解工藝為果膠酶添加量0.010%、酶解溫度55℃、酶解1 h，此工藝下發(fā)酵的軟棗獼猴桃酒維生素C含量為297.27 mg/L、酒精度7.50%vol、還原糖含量2.09 g/L、總浸出物含量3.50 g/L、甲醇含量172.10 mg/L。

3 結(jié)論

通過單因素試驗探究果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度對軟棗獼猴桃發(fā)酵酒出酒率及維生素C含量的影響。果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度對出酒率和維生素C含量均有極顯著影響（P＜0.01）。出酒率隨著酶添加量增加、酶解時間延長、酶解溫度升高而增加，但酶解時間過長，酶解溫度過高，酶活降低，不利于提高出酒率。維生素C含量受酶解溫度和酶解時間影響較大，隨酶解溫度升高和酶解時間延長維生素C含量呈負(fù)增長。以出酒率為評價指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)化軟棗獼猴桃發(fā)酵酒最佳果膠酶酶解工藝：果膠酶添加量為0.010%、酶解溫度55℃、酶解時間1 h，發(fā)酵軟棗獼猴桃酒的出酒率49.38%、維生素C含量297.27 mg/L、酒精度 7.50%vol、還原糖含量 2.09 g/L、總浸出物含量3.50 g/L、甲醇含量172.10 mg/L，采用此酶解工藝釀制的軟棗獼猴桃酒口味清爽利口、色澤鮮亮、酸度適中、果香酒香協(xié)調(diào)、適口性好，出酒率高。