陜西楊凌某雞場雞艾美耳球蟲的分離鑒定

田格如，崔 博，宋軍科

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程分院，陜西楊凌 712100；2.北京市東城區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，北京 100027；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美耳屬(Eimeria)多種球蟲寄生于雞的腸黏膜上皮細(xì)胞引起的寄生原蟲病，對養(yǎng)雞業(yè)危害很大。雞球蟲的主要致病作用是破壞腸黏膜上皮細(xì)胞，導(dǎo)致出血性腸炎、腸黏膜上皮細(xì)胞脫落和營養(yǎng)物質(zhì)吸收不良，對宿主的腸道造成很大的傷害，可增加其發(fā)病率和病死率[1]。雞球蟲病對養(yǎng)禽業(yè)造成的生產(chǎn)損失已成為一種全球性挑戰(zhàn)，每年可達(dá)約30 億美元的經(jīng)濟(jì)損失，使得控制疾病的預(yù)防措施成為根本[2-3]。目前，我國發(fā)現(xiàn)9種雞艾美耳球蟲種類，普遍存在的有7種[4-5]，其中致病力最強(qiáng)的是柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)，可引起雞的盲腸腫脹和腸腔中充滿血液；其次是毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)，導(dǎo)致腸壁腫脹或壞死；其余依次是堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、和緩艾美耳球蟲(E.mitis)以及早熟艾美耳球蟲(E.praecox)。

目前，基于雞球蟲卵囊形態(tài)、寄生部位的特異性以及病理變化特征的常規(guī)檢查易出現(xiàn)漏檢情況[6]。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)具有很高的特異性和敏感性，基于PCR的艾美球蟲屬的鑒定更具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，因此，被廣泛用于球蟲物種的鑒定上[7]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers，ITS)位于真核細(xì)胞中的核糖體RNA上，盡管種內(nèi)存在一定的保守性，但物種間具有很大的差異性，可用作DNA標(biāo)記，以幫助識別各種疾病，包括艾美耳球蟲的感染[8-9]。據(jù)報(bào)道用ITS引物基于PCR技術(shù)已成功鑒定了7種雞艾美耳球蟲，在物種鑒定方面取得了重大進(jìn)展[10]。

準(zhǔn)確有效地鑒定病原體對于球蟲病的診斷和控制、生物學(xué)和流行病學(xué)研究、新型免疫原的生產(chǎn)以及抗球蟲藥物的篩選都具有重大意義[11]。因此，本文對楊凌地區(qū)某雞場疑似雞球蟲進(jìn)行分離純化、形態(tài)學(xué)和PCR鑒定，并對其致病性和生物特性進(jìn)行初步研究，可為雞艾美耳球蟲優(yōu)勢種的疫苗研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 2日齡健康海蘭雛雞，購自楊凌某種雞場，經(jīng)檢測未感染球蟲。

1.1.2 試驗(yàn)用樣本 陜西楊凌某雞場疑似患球蟲病的病雞糞便。

1.1.3 主要試劑 糞便DNA試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；rTaq聚合酶(5 U/mL)、dNTP(2.5 mmol/L)、MgCl2(25 mmol/L)、10×rTaqbuffer、溴化乙錠(ethidium bromide，EB)、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，均為TaKaRa公司產(chǎn)品；重鉻酸鉀( K2CrO4) 、生理鹽水、蒸餾水(dH2O)、氯化鈉(NaCl)，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器 光學(xué)顯微鏡(CH20)，Olympus公司產(chǎn)品；常溫離心機(jī)(5702)、PCR擴(kuò)增儀(Mastercycler X50),均為Eppendorf公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS)、電泳儀(CFX384 Touch),均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；超凈工作臺(LHG-3-G-F8)，青島翌宏儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(DF811C)，Yamato公司產(chǎn)品；電子天平(XS105DU)，Mettler Toledo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雞球蟲采集與分離 采集具有雞球蟲病典型臨床癥狀的雞只糞便，放于清潔干燥的燒杯中，添加適量蒸餾水用玻璃棒攪拌均勻后，用200目網(wǎng)篩進(jìn)行過濾。濾液于3 000 r/min離心5 min，倒掉上清液；加一定體積的飽和食鹽水溶液混勻，2 000 r/min離心5 min；吸取上清液放于清潔干燥的燒杯中，加蒸餾水(6倍體積的上清液)進(jìn)行稀釋，2 000 r/min離心5 min；倒掉上清液，加適量蒸餾水混勻，2 000 r/min離心5 min；反復(fù)用蒸餾水清洗3遍后進(jìn)行重懸，在顯微鏡下鏡檢。

1.2.2 球蟲卵囊的孢子化培養(yǎng) 在上述分離到的球蟲卵囊混懸液中加入3倍體積的25 mg/mL K2CrO4溶液，用移液槍反復(fù)吹打混勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，于28 ℃培養(yǎng)箱中孵育。在孵育過程中每隔2 h用移液槍輕輕吹打，48 h后鏡檢，如孢子化率達(dá)90%以上即可轉(zhuǎn)移至離心管中停止培養(yǎng)。

1.2.3 雞球蟲的擴(kuò)繁

1.2.3.1 接種孢子化卵囊 將保存在K2CrO4溶液中的孢子化野毒株用蒸餾水進(jìn)行稀釋，3 000 r/min離心5 min，倒掉上清。加一定體積的蒸餾水混勻后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算蟲卵密度，稀釋至約10 000個(gè)/mL。選取15日齡健康無球蟲海藍(lán)雛雞10只，停飼2 h后每只雞經(jīng)口灌服0.1 mL約1 000個(gè)卵囊。

1.2.3.2 排卵囊規(guī)律檢測 從感染后第1天開始分別在上午8:00和晚上20:00收集雞只糞便，計(jì)算每克糞便的卵囊數(shù)(OPG)。當(dāng)OPG降低時(shí)剖殺雞只并取其消化道內(nèi)容物，通過臨床癥狀、病理變化、卵囊大小、卵囊形態(tài)特征對分離到的卵囊進(jìn)行初步鑒定。

1.2.4 雞球蟲PCR鑒定 收集的卵囊用糞便DNA試劑盒提取DNA。本研究根據(jù)ITS基因設(shè)計(jì)出4種艾美耳球蟲的特異性引物[12]，引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系：10×rTaqbuffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，5 U/mL rTaq聚合酶0.125 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 16.375 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min，16 ℃結(jié)束反應(yīng)。取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含有EB的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳中檢測。

表1 雞艾美耳球蟲的特異性引物

1.2.5 測序及序列分析 PCR陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司雙向測序，應(yīng)用Clustal X 1.83軟件對所測的序列進(jìn)行比對，然后將拼接的序列在Blast上進(jìn)行同源性檢索，分析序列的同源性。

2 結(jié)果

2.1 雞球蟲分離及其孢子化

采用飽和鹽水溶液漂浮法對雞球蟲卵囊進(jìn)行分離，鏡檢發(fā)現(xiàn)分離物中存在大小約為22 μm×19 μm，囊壁光滑未孢子化的卵圓形卵囊(圖1)。將獲得的球蟲卵囊放于25 mg/mL K2CrO4溶液中于28 ℃孵育48 h，進(jìn)行孢子化，鏡檢發(fā)現(xiàn)孢子化的卵囊具有分化明顯的4個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊含2個(gè)子孢子，有斯氏體，無卵囊殘?bào)w(圖2)。計(jì)數(shù)50個(gè)卵囊，其中孢子化成熟的卵囊有46個(gè)，孢子化率為92%。

2.2 雞艾美耳球蟲的排卵囊規(guī)律

感染球蟲卵囊后第4天有個(gè)別雞狀態(tài)不佳，第5天部分雛雞表現(xiàn)食欲不佳、精神不振、翅膀下垂等臨床癥狀，第6天出現(xiàn)腹瀉以及血便現(xiàn)象。檢測雞只的糞便，在第5天首次發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，最短潛隱期在118 h～120 h之間；第7天出現(xiàn)排卵囊高峰(圖3)。第8天處死雞只，剖檢可見盲腸和小腸有充血和出血現(xiàn)象。

圖1 未孢子化球蟲卵囊(400×)

圖2 孢子化球蟲卵囊(400×)

2.3 雞艾美耳球蟲ITS基因PCR擴(kuò)增及鑒定

提取收集到的球蟲卵囊的DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示只有毒害艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲出現(xiàn)了約450 bp和300 bp的目的條帶(圖4)。

2.4 PCR產(chǎn)物序列分析

所測得的序列去除兩端不準(zhǔn)確序列后，毒害艾美耳球蟲序列為452 bp,柔嫩艾美耳球蟲序列為280 bp。將拼接后的兩條序列分別在Blast上檢索，結(jié)果顯示毒害艾美耳球蟲與E.necatrix(GenBank登錄號AF026385)同源性為98%，柔嫩艾美耳球蟲與E.tenella(GenBank登錄號JX853831)同源性為99%。

圖3 雞接種1 000個(gè)球蟲卵囊后的排卵囊規(guī)律

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4.分別為堆型艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

3 討論

雞球蟲是一種寄生于雞腸道內(nèi)的寄生性原蟲，主要侵害宿主腸道細(xì)胞，由其引起的雞球蟲病對雞的生長發(fā)育及生產(chǎn)性能造成嚴(yán)重的危害。據(jù)報(bào)道，全球工業(yè)化養(yǎng)雞場中，球蟲病的感染率是10%～90%，給家禽生產(chǎn)者帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失[13-14]。雞艾美耳屬球蟲因種和寄生部位不同而造成的危害程度各不相同。E.necatrix和E.tenella是7種雞艾美耳屬球蟲中致病性最強(qiáng)的2個(gè)種，可導(dǎo)致病雞的血樣腹瀉，并且是致命性的危害[15]。

雞球蟲傳統(tǒng)上主要依據(jù)卵囊的形態(tài)和大小、發(fā)病日齡、宿主特異性以及病理變化特征進(jìn)行種類鑒定[16-17]。但傳統(tǒng)的鑒定方法在鑒別不同球蟲蟲株時(shí)有很多相似之處，用肉眼難以辨別。利用PCR方法對雞球蟲種類的鑒定具有快速、簡便且準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于規(guī)?；B(yǎng)禽業(yè)的檢測。本試驗(yàn)通過飽和鹽水溶液漂浮法從雞糞便和消化道內(nèi)容物中成功分離出雞球蟲卵囊，并通過形態(tài)學(xué)特征以及動物感染試驗(yàn)初步鑒定為雞艾美耳屬球蟲，雞球蟲卵囊大小約為22 μm×19 μm，囊壁光滑未孢子化的球蟲卵囊。雞球蟲卵囊接種15日齡雛雞6 d后出現(xiàn)腹瀉和明顯血便，將雞只剖殺后從消化道內(nèi)容物中又分離到了球蟲卵囊。經(jīng)顯微鏡觀察從形態(tài)大小上排除了巨型艾美耳球蟲和和緩艾美耳球蟲，最短潛隱期超過了早熟艾美耳球蟲的潛隱期，又排除了早熟艾美耳球蟲。ITS基因序列具有種內(nèi)高保守性和種間特異性，常用于球蟲蟲株的分類鑒定。陳培培等[18]根據(jù) ITS序列利用PCR技術(shù)擴(kuò)增診斷為柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲的混合感染。謝永平等[19]根據(jù)ITS-1基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增診斷為柔嫩艾美耳球蟲。由于本試驗(yàn)在形態(tài)特征上已排除以上3種球蟲的感染，因此根據(jù)ITS序列分別設(shè)計(jì)其余4種特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，其中E.necatrix和E.tenella出現(xiàn)了目的條帶，表明該雞場為這2種球蟲的混合感染。

雞球蟲給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失和福利風(fēng)險(xiǎn)，尤其是富含高蛋白和快速繁殖的雞[20]。有研究表明感染雞球蟲的雞群其腸道功能難以完全康復(fù)，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)吸收不良、體重增加緩慢和生產(chǎn)性能下降，從而導(dǎo)致雞的的死亡率和繼發(fā)疾病的易感性增加[21]。因此，了解現(xiàn)有的艾美耳球蟲物種概況，有利于在養(yǎng)禽業(yè)實(shí)施有效的控制策略。本次分離鑒定結(jié)果可為楊凌地區(qū)防控雞球蟲病奠定基礎(chǔ)，但對于整個(gè)楊凌地區(qū)并未做全面的采樣及檢測，所以對目前雞艾美耳球蟲的流行病學(xué)還有待進(jìn)一步研究。