七清止瀉顆粒的制備及質(zhì)量控制

張 欣，侯佳琪，辛怡霖，李青云，唐 熙，潘康鎖，李引乾*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.陜西省農(nóng)業(yè)檢驗檢測中心，陜西西安 710016)

七清止瀉顆粒是在傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)驗方基礎上，結(jié)合中醫(yī)理論、文獻調(diào)研和長期臨床實踐等，對原散劑處方優(yōu)化改造而成。全方由黃芩、白頭翁、苦參、石榴皮、黃芪、藿香、山楂7味藥組成，具有清熱除濕、益腸止痢之功效，其中黃芩清熱解毒，對多種均有殺抑制作用，為君藥[1]；白頭翁和苦參在中獸藥性味與歸經(jīng)上和黃芩一致，具有清熱燥濕，涼血解毒，可增強黃芩的抗菌活性和抑菌效果，為臣藥[2-3]；石榴皮和黃芪性溫，提高雞的機體免疫能力，減少苦寒類藥物對幼禽的刺激，為佐藥[4-5]；藿香芳香化濕、山楂清香微甜，能刺激胃液分泌幫助消化，調(diào)和藥性，促進生長，為使藥[6-7]。7味中藥相互配合，相輔相成，增加抑菌效果，兼顧清熱除濕，扶正祛邪，補中益氣的效果。

傳統(tǒng)中藥散劑一般成分復雜，含量均勻度差，在雞育雛過程中，因給藥方式單一，不適用現(xiàn)代規(guī)模化養(yǎng)殖的需求，中藥顆粒劑具有改善適口性、用藥方便、可飲水給藥、便于儲藏及提高生物利用度等優(yōu)點[8-9]，基于質(zhì)量源于設計(quality by design，QbD)理念[10]，本研究對原散劑進行改造，優(yōu)化提取工藝及其顆粒劑成型工藝，制定質(zhì)量標準，為七清止瀉顆粒的質(zhì)量控制試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 黃芩、白頭翁、苦參、石榴皮、黃芪、藿香、山楂，購自楊陵華仁堂大藥房；黃芩苷對照品，批號201021，中檢計量生物有限公司產(chǎn)品，供含量測定用；高效硅膠G薄層板，青島海洋化工有限公司產(chǎn)品；糊精，批號T14A10Z95117，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；蔗糖，批號201229，西隴科學股份有限公司產(chǎn)品；水為高純水，其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 A60多功能分體煎藥煲，潮州市湖安區(qū)康雅順電器有限公司產(chǎn)品；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；UV-1200型，紫外分光光度儀，上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 七清止瀉顆粒干浸膏的制備

1.2.1.1 工藝方法 將藥材按處方稱重，黃芩15 g、白頭翁10 g、苦參10 g、石榴皮10 g、黃芪15 g、藿香10 g、山楂10 g，采用傳統(tǒng)水煎法，利用正交試驗設計，研究出藥物復方的最佳提取條件，其制法如下：按照處方稱取藥品，粉碎成小塊，加適量的水進行煎煮數(shù)次，煎煮完成后合并煎液，對煎液進行過濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的濃縮藥液進行減壓干燥制成干浸膏，浸膏研磨成粉，快速稱重，備用[11]。

1.2.1.2 正交試驗優(yōu)化提取工藝 利用正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化探索。本試驗根據(jù)前期文獻查閱[12]，選擇加水倍數(shù)(A)、提取次數(shù)(B)和提取時間(C)作為考察因素，以干浸膏得率為評價指標，各因素取3個水平，正交試驗因素水平設計見表1。

表1 七清止瀉顆粒的提取正交因素水平

1.2.1.3 驗證試驗 按照藥方稱取藥材，按上述篩選的工藝進行重復試驗，計算干膏得率，觀察該工藝可行性。

1.2.2 七清止瀉顆粒的制粒工藝

1.2.2.1 輔料種類的篩選 參考多種中藥顆粒劑的制粒方法，考慮經(jīng)濟性，選用加入適量的蔗糖和糊精作為輔料，以增加藥品顆粒的穩(wěn)定性和顆?？诟?，混勻，選用適量乙醇作為潤濕劑，制成顆粒，干燥，制成80 g，即得。

1.2.2.2 輔料用量的篩選 按照《中華人民共和國獸藥典》2020版二部附錄0106顆粒劑的要求，以及參考其他收錄顆粒劑的制法[3]，由1.2.1方法得干浸膏粉，加入含不同配比糊精和蔗糖的輔料，混勻，對混合藥粉進行制成顆粒，干燥，制成80 g，觀察其形狀，對產(chǎn)物顆粒的成型性、休止角、溶化性和吸濕性進行評分，4個指標各占比25%，對其結(jié)果進行綜合評價。

1.2.2.3 潤濕劑濃度的篩選 將1.2.1方法得干浸膏粉，按照上述篩選的最佳輔料比例混勻，分別加入濃度為500、750、950 mL/L的乙醇作為潤濕劑進行制粒，以成型率為評價指標，優(yōu)選最佳乙醇濃度。

1.2.3 七清止瀉顆粒試制的質(zhì)量控制 按照1.2.1和1.2.2的最佳提取和制粒工藝試制，制備210405、210406、210407、210408共4個批次進行質(zhì)量控制。

1.2.3.1 質(zhì)量檢查 按照《中華人民共和國獸藥典》2020版二部附錄0106顆粒劑要求分別對4個批次七清止瀉顆粒進行性狀、粒度、水分和溶化性等考察[3]。

1.2.3.2 黃芩的薄層色譜鑒別 對七清止瀉顆粒君藥黃芩主要有效成分黃芩苷進行薄層色譜鑒別，取本品210405、210406、210407、210408共4個批次各15 g，分別各加甲醇50 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣，分別各加甲醇2 mL使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。另取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照《中華人民共和國獸藥典》2020版二部附錄0502薄層色譜法進行試驗[3]。吸取上述5種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，黃芩苷對照品溶液點2次，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(10∶3∶1∶2)為展開劑，置展開缸內(nèi)預飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以10 mg/mL的氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

1.2.3.3 黃芩苷的含量測定

(1)對照品溶液的配制:準確稱取黃芩苷標準品10 mg，于適量甲醇中溶解，經(jīng)超聲處理30 min，使黃芩苷完全溶解，再加入甲醇至刻度，搖勻，定容于50 mL棕色容量瓶中，即得對照品溶液(濃度200 μg/mL)。

(2)供試品溶液的制備:準確稱取本品0.5 g，適量甲醇中溶解，經(jīng)超聲處理30 min，使其完全溶解置50 mL量瓶中定容，再精密量取1 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，即得供試品溶液(濃度200 μg/mL)。

(3)測定波長的選擇:黃芩苷最大吸收波長的選擇用可見紫外分光光度法分度計對黃芩苷標準液進行全波段掃描，以其最大吸收波長作為黃芩苷的吸收波長。取0.5 mL黃芩苷對照品溶液，再加入甲醇于10 mL容量瓶定容，得到10 μg/mL黃芩苷溶液，在230 nm～350 nm范圍內(nèi)將對照品與供試品溶液進行全波長掃描。

(4)黃芩苷標準曲線的制作和精密度試驗:分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL黃芩苷對照品溶液，分別加入甲醇于10 mL容量瓶定容，得到2、4、6、8、10 μg/mL的黃芩苷溶液，以甲醇為空白試劑，用紫外-可見分光光度計在其最大吸收波長處測定吸光度值OD，重復3次，取平均值，以黃芩苷標準品的濃度C為橫坐標，測出的吸光度值OD為縱坐標繪制標準曲線。

(5)重復性試驗:按照供試品溶液的制備方法，分別準確稱取批號為210405顆粒6份，在最大吸收波長處測定吸光度，依次進樣分析，計算吸光度的RSD。

(6)加樣回收試驗:分別準確稱取批號為210405顆粒0.25 g，6份，分別精確加入10 mg黃芩苷對照品溶液，按供試品溶液的制備方法，在最大吸收波長處測定吸光度，依次進樣分析，計算吸光度回收率和RSD。

(7)樣品中黃芩苷含量測定:按供試品溶液的制備方法，分別準確稱取本品批號為210405、210406、210407、210408各0.5 g，制得供試品溶液，在最大吸收波長處測定吸光度，由回歸方程式計算出對應濃度，計算樣品中黃芩苷含量。

2 結(jié)果

2.1 七清止瀉顆粒干浸膏的制備結(jié)果

2.1.1 提取正交試驗結(jié)果 選用L9(34)正交表對七清止瀉顆粒的制粒工藝進行考察，以干膏得率作為評價指標，七清止瀉顆粒的提取正交試驗結(jié)果見表2。

表2 七清止瀉顆粒的提取正交試驗結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，以干膏得率為考察指標，由表中極差大小顯示，各影響因素影響次序依次為C(提取次數(shù))>B(提取時間)>A(加水量)。分析極差最佳的提取工藝為A2B3C2，但提取次數(shù)過多會損失藥效，另從節(jié)約能源的角度，確定最終提取工藝為加10倍量水、提取2次、每次1.5 h。

2.1.2 提取工藝驗證試驗結(jié)果 稱取處方藥品，按照1.2.1篩選的最佳工藝重復提取試驗2次，稱量產(chǎn)物干膏質(zhì)量，計算干膏率。

按照正交試驗最佳提取工藝重復5次，RSD為2.74%(表3)，表明該提取工藝穩(wěn)定可行，重復性良好，為下一步制粒配方提供了依據(jù)。

2.2 七清止瀉顆粒的制粒工藝結(jié)果

2.2.1 輔料用量的篩選結(jié)果 將提取的干膏粉和含不同配比糊精和蔗糖的輔料混合制粒，綜合評價產(chǎn)物(表4)。直觀分析表明，當加入糊精和蔗糖質(zhì)量比為7∶3的輔料，混合制成的顆粒容易制粒，穩(wěn)定性良好，不易吸濕，易于溶化，且流動性好，有助于制成顆粒后分裝和貯存。

2.2.2 潤濕劑濃度的篩選 對不同濃度的乙醇作為潤濕劑制粒的成型率進行試驗，由試驗可得，顆粒劑的成型率隨乙醇濃度的增加而增加；當乙醇濃度為950 mL/L時，成型率最高，故確定950 mL/L的乙醇作為潤濕劑。

2.3 七清止瀉顆粒試制的質(zhì)量控制結(jié)果

2.3.1 試制顆粒的質(zhì)量檢查 試驗可得，4個批次均為棕色至棕褐色、干燥、大小形態(tài)均勻、色澤一致的顆粒劑，無吸潮、軟化、結(jié)塊等現(xiàn)象，粒度、水分、溶化性均符合《中華人民共和國獸藥典》相關規(guī)定。

表3 提取工藝驗證試驗結(jié)果

表4 七清止瀉顆粒輔料用量試驗表

2.3.2 黃芩苷的薄層色譜鑒別 由結(jié)果可以看出，4個批次顆粒色譜中，在與黃芩苷對照品色譜相應的位置上，供試品色譜顯示相同顏色的斑點(圖1)。

L表示4個批次顆粒，依次為210405、210406、210407、210408 4個批次，S表示黃芩苷標準品對照品

2.3.3 黃芩苷的含量測定

(1)測定波長的選擇:經(jīng)試驗，黃芩苷在278 nm 處有最大吸收，故選擇278 nm波長為測定波長。

(2)標準曲線繪制和精密度試驗:按1.2.3.3試驗測定吸光度，各濃度吸光度(OD)的RSD≤0.72%，表明儀器精密度良好。進行回歸分析得回歸方y(tǒng)=0.073x-0.025 5,R2=0.997，表明黃芩苷在2 μg/mL～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好(圖2)。

圖2 黃芩苷吸收度線性關系圖

(3)重復性試驗:重復6次試驗，以吸光度(OD)代入回歸方程，計算可得批號為210405的七清止瀉顆粒中黃芩苷平均含量為4.00%，RSD值為1.25%，表明本方法的重復性良好。

(4)加樣回收試驗:按照1.2.3.3試驗方法下操作，精密稱取批號為210405的七清止瀉顆粒0.25 g，共6份，精確加入黃芩苷對照品，按照樣品測定項下方法操作，結(jié)果見表5。試驗結(jié)果可得，樣品中的平均加樣回收率為98.18%，RSD值為1.66%，表明本方法的加樣回收率良好。

(5)含量測定結(jié)果:按照1.2.3.3試驗方法下操作，對4個批次七清止瀉顆粒進行含量測定，依照標準曲線法計算樣品中黃芩苷含量，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，4個批次樣品中，其樣品中黃芩苷的最低含量為4.003%。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果

表6 4個批次七清止瀉顆粒含量測定結(jié)果

3 討論

在提取工藝中，采用傳統(tǒng)水煎中藥提取方法，用正交試驗探究最佳提取工藝，3個因素增加都會提高干浸膏得率，但相對增加幅度較小，且提取次數(shù)過多會損失藥效，考慮時間和低碳理念，最終確定提取工藝為加10倍量水、煎煮2次、每次1.5 h，合并煎液，對煎液進行過濾，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和減壓真空干燥制成干浸膏，研磨成粉，備用。

在制粒工藝中，中藥浸膏通常具有較強的吸濕性，實驗室直接制粒有一定難度且穩(wěn)定性差，為降低其吸濕性，增加溶化率和流動性，便于制粒和儲存，需要探索合適的輔料[13]。前期試驗表明，七清止瀉顆粒中藥浸膏軟材黏度較大，無法直接制粒，直接加入輔料混合困難，制粒損耗也比較多，質(zhì)地較硬，顆粒不均勻，不符合顆粒劑的有關要求，后采用將浸膏干燥成藥粉和輔料混合，用適量的乙醇作為潤濕劑，噴淋混合藥粉，均勻攪拌，再制粒。對產(chǎn)物進行綜合評價，當加入糊精和蔗糖質(zhì)量比為7∶3的輔料，混合制成80 g顆粒劑，制備顆粒效果最佳，工藝穩(wěn)定可靠，均符合《中華人民共和國獸藥典》對中藥顆粒劑的要求。

由于實驗室條件的局限性，傳統(tǒng)濕法手工制粒耗能過大，以及相對生產(chǎn)周期和暴露時間過長，增加染菌的機會，下一步中試試驗要明確進行商業(yè)規(guī)模化的生產(chǎn)條件驗證，進一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝和工藝參數(shù)。

在質(zhì)量控制中,黃芩為處方中君藥，黃芩苷為黃芩主要活性成分之一，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗真菌及抗支原體作用[14]。中藥有效含量復雜，加上本藥由七味藥組成，已知化學物質(zhì)幾十種，因此選用藥物原料的時候應嚴格控制質(zhì)量，再根據(jù)中藥的檢驗標準特性，結(jié)合中藥質(zhì)量標志物的概念[15]，為了更有效控制七清止瀉顆粒的質(zhì)量，選擇君藥的有效成分黃芩苷進行定性和定量監(jiān)控[16]。結(jié)果表明，4個批次樣品中，其樣品中黃芩苷的最低含量比為4.00%，根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2020版二部規(guī)定，黃芩干燥品含黃芩苷不少于8%，結(jié)合處方，以每克樣品中各成分含量的85%作為七清止瀉顆粒含量測定的限度，因此將本品黃芩苷不少于3.40%作為后續(xù)中試試驗標準。

本研究對原散劑進行處方和劑型優(yōu)化改造，制備成七清止瀉顆粒劑，研究考察了七清止瀉顆粒的最佳提取工藝，加入輔料種類的比例用量以及潤濕劑等進行了優(yōu)化篩選，得到相應的最佳制備工藝，并對該工藝進行了重復驗證，建立了有關定性和定量的測定方法。該方法制得的七清止瀉顆粒成型性良好，穩(wěn)定不易吸濕，流動性好，溶解性佳，制備工藝穩(wěn)定可靠，建立的含量測定方法準確度高、專屬性強、重現(xiàn)性好，能夠作為七清止瀉顆粒的質(zhì)量控制標準，為后續(xù)藥理學研究和中試試驗奠定了基礎。