AECOPD 患者誘導(dǎo)痰和血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75表達(dá)水平及其臨床意義

馬青松，趙芝煥，馬麗容，李瑋璟，劉 凌

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)二科，云南 昆明 650032）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種致殘率和致死率較高的慢性氣道炎癥性疾病。近年來通過分析各種生物標(biāo)志物與相關(guān)臨床參數(shù)、評分量表相關(guān)性，以期提出COPD 新的病情評估指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。關(guān)于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、可溶性腫瘤壞死因子受體（soluble tumor necrosis factor receptor，sTNFR）水平在COPD 中的研究并不少見，但大都以COPD 穩(wěn)定期患者為研究對象，且僅單一在血清或者誘導(dǎo)痰中檢測TNF-α、sTNFR 水平，不同研究納入的臨床參數(shù)不同。本研究在急性加重的COPD（acute exacerbation of COPD，AECOPD）患者中同時檢測誘導(dǎo)痰和血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平，比較治療前后、戒煙后上述炎癥介質(zhì)的水平變化，探討炎癥介質(zhì)與肺功能、急性生理學(xué)及慢性健康狀況評分-II（acute physiology and chronic health evaluation score-II，APACHE-II 評分）的相關(guān)性，進(jìn)行氣道炎癥與全身炎癥的相關(guān)性分析，以期為AECOPD 患者提出新的療效及病情評估生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料

1.1.1 研究對象選擇昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院于2019 年1 月至2020 年12 月住院的40 例AECOPD 患者入組，其中男性38 例，女性2 例，年齡57～87 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2018 年GOLD 指南C 組和D 組診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]：肺功能檢查示吸入支氣管擴(kuò)張劑后第1 s 用力呼氣容積比用力肺活量（forced expiratory volume in one second/forced vital capacity，F(xiàn)EV1/FVC）＜ 70%，過去1 a中重度急性加重史（≥ 2 或≥ 1 次導(dǎo)致住院）；（2）處于急性加重期[2]；（3）既往至少有20 a 以上吸煙史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核等慢性呼吸系統(tǒng)疾病；（2）合并嚴(yán)重心、肝、腎疾病，2 型糖尿病，過敏性疾病，惡性腫瘤；（3）需要機(jī)械通氣，需全身激素治療，合并肺炎，治療1 周病情無明顯緩解；（4）不能配合肺功能檢查，不能順利完成誘導(dǎo)痰及痰標(biāo)本不合格；（5）已戒煙，但戒煙時間不足1 a 者。

1.1.2 分組分為治療前（Ⅰ組）：入院當(dāng)天，輸液治療前；治療后（Ⅱ組）：入院治療第8 天且臨床表現(xiàn)有明顯好轉(zhuǎn)；根據(jù)目前是否戒煙（要求至少完全戒煙1 a 及以上），分為戒煙組（Ⅲ組）、吸煙組（Ⅳ組）。

1.1.3 治療和知情同意氧療、抗感染、平喘、抗炎、祛痰治療。簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 誘導(dǎo)痰操作及采集入組患者治療前后吸入沙丁胺醇400 μg，15 min 后再次測定肺功能，若第1 秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比（percentage of predicted FEV1value，F(xiàn)EV1%pred）≥ 60%以濃度3%高滲鹽水霧化，而FEV1%pred ＜ 60%以0.9%生理鹽水霧化，參照文獻(xiàn)[3-4]的方法進(jìn)行誘導(dǎo)操作。用無菌鑷子夾取痰栓于離心管中，稱重（≥ 0.2 g），加入4 倍體積0.1%二硫蘇糖醇（DTT）37 ℃溫浴10 min，振蕩搖勻，用300 目尼龍濾網(wǎng)過濾后，濾液于3 600 r/min 離心5 min，離心后上清液置于凍存管中-80 ℃冰箱中保存待測。

1.2.2 采血空腹外周靜脈血3 mL，離心（2 500 r/min，10 min）后取上清液置于凍存管中-80 ℃冰箱中保存待測。

1.2.3 TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 的測定誘導(dǎo)痰上清和血清均應(yīng)用江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司人類TNF-α/TNFR 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒，采用ELISA 法測定TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 肺功能、動脈血?dú)夥治鋈虢M患者在治療前后均進(jìn)行肺功能和動脈血?dú)鈾z測，包括FEV1、FEV1%pred、FEV1/FVC。

1.2.5 APACHE-II 評分收集入組患者年齡、合并癥，結(jié)合治療前和治療后生命體征、血常規(guī)、血生化、動脈血?dú)夥治?、尿量進(jìn)行APACHE-II評分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料服從正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；同組治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)，不同組別比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。偏態(tài)分布用M（P25，P75）描述，2 組間比較采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析，服從正態(tài)分布采用Pearson 相關(guān)分析，不服從正態(tài)則用Spearman 相關(guān)分析。P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AECOPD 受試者基線資料

入組 40 例 AECOPD 患者平均年齡（72.43±8.51）歲，吸煙指數(shù)（548.00±280.42）。GOLD Ⅱ級（50%～79%）14 例、Ⅲ級（30%～49%）18 例、Ⅳ級（＜ 30%）8 例。戒煙組（Ⅲ組）25 例，目前吸煙組（Ⅳ組）15 例。

與Ⅰ組相比、Ⅱ組患者PaO2、APACHE-II 評分、肺功能指標(biāo)明顯改善。Ⅳ組肺功能較Ⅲ組差（P＜ 0.05）；而年齡、BMI、吸煙指 數(shù)、PaO2、PaCO2、APACHE-II 評分在不同組別之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見表1。

表1 各組一般情況比較（）Tab.1 The general situation of each group is compared（）

表1 各組一般情況比較（）Tab.1 The general situation of each group is compared（）

*P ＜ 0.05。

2.2 治療后TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 的變化

治療后血清中TNF-α 水平明顯下降（t=2.348，P=0.024），sTNFR-55、sTNFR-75 水平增加（P＞ 0.05）；治療后誘導(dǎo)痰中TNF-α 水平下降（t=2.191，P=0.035），而sTNFR-55（P＜ 0.05）和sTNFR-75（P＞ 0.05）水平均升高，見表2。

表2 治療后TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平的變化[（），pg/mL]Tab.2 Changes of TNF-α，sTNFR-55 and sTNFR-75 levels after treatment [（），pg/mL]

表2 治療后TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平的變化[（），pg/mL]Tab.2 Changes of TNF-α，sTNFR-55 and sTNFR-75 levels after treatment [（），pg/mL]

*P ＜ 0.05。

2.3 戒煙后TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平的變化

Ⅲ組誘導(dǎo)痰中TNF-α 水平低于Ⅳ組（Z=-2.626，P=0.008），而sTNFR-55、sTNFR-75 水平高于Ⅳ組（t=2.716，P=0.01；Z=-2.696，P=0.006）。血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75水平在2 組患者之間無明顯差異（P＞ 0.05），見表3。

表3 戒煙后誘導(dǎo)痰和血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 的變化[/M（P25，P75）]Tab.3 The changes of TNF-α，sTNFR-55 and sTNFR-75 in sputum and serum were induced after smoking cessation[/M（P25，P75）]

表3 戒煙后誘導(dǎo)痰和血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 的變化[/M（P25，P75）]Tab.3 The changes of TNF-α，sTNFR-55 and sTNFR-75 in sputum and serum were induced after smoking cessation[/M（P25，P75）]

*P ＜ 0.05。

2.4 TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 與肺功能、APACHE-II 評分的相關(guān)性分析

誘導(dǎo)痰中，TNF-α 水平與FEV1、FEV1%pred、FEV1/FVC 呈負(fù)相關(guān)（r分別-0.827、-0.865、-0.868，P＜ 0.001），sTNFR-55 水平與FEV1、FEV1%pred、FEV1/FVC 呈正相關(guān)（rs分 別0.415、0.330、0.305，P＜ 0.05），sTNFR-75 水平與FEV1、FEV1%pred、FEV1/FVC 呈正相關(guān)（rs分 別0.903、0.969、0.965，P＜ 0.001），TNF-α 水平與APACHE-II 評分呈正相關(guān)（r=0.374，P=0.001），sTFR-55、sTNFR-75 水平與APACHE-II 評分呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.227、-0.341，P＜0.05）；而血清中，TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平與肺功能指標(biāo)、APACHE-II 評分均不存在相關(guān)性（P＞0.05），見表4。

表4 TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平與肺功能、APACHE-II 評分的相關(guān)性分析（r/rs）Tab.4 Correlation analysis of TNF-α，sTNFR-55，sTNFR-75 levels with lung function and APACHE-II score（r/rS）

2.5 誘導(dǎo)痰 和血清中 TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平的相關(guān)性分析

誘導(dǎo)痰與血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平之間均不存在相關(guān)性（P＞ 0.05），見表5。

表5 誘導(dǎo)痰與血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis between induced sputum and serum levels of TNF-α，sTNFR-55 and sTNFR-75

3 討論

TNF-α 是一種強(qiáng)大的促炎介質(zhì)，在AECOPD炎癥驅(qū)動中發(fā)揮重要作用[5]。sTNFR 是循環(huán)和氣道中的潛在抗炎介質(zhì)，可阻斷炎癥反應(yīng)，高濃度時緩解TNF-α 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，低濃度時則可以作為炎癥狀態(tài)標(biāo)志物[6]。COPD 患者血清、誘導(dǎo)痰中均檢測到TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平升高[7]。

本研究結(jié)果與Zeng[8]和Vernooy 等[9]的研究相符，治療后誘導(dǎo)痰和血清中促炎介質(zhì)TNF-α水平下降，抗炎介質(zhì)sTNFR 水平上升，氣道炎癥與氣流受限密切相關(guān)，誘導(dǎo)痰TNF-α 水平越高，肺功能損傷程度越重。一項(xiàng)橫斷面研究[10]分析比較COPD 急性加重期及穩(wěn)定期、健康對照者3 組受試者血清TNF-α、sTNFR 水平差異，發(fā)現(xiàn)COPD 患者中TNF-α、sTNFR 水平較健康對照組均有升高，其中TNF-α 表達(dá)在急性加重期組升高，在穩(wěn)定期組降低；而sTNFR 表達(dá)在急性加重期組下降，在穩(wěn)定期組上升。表明在COPD 不同時期均存在氣道和全身促炎與抗炎介質(zhì)動態(tài)變化，治療后或疾病恢復(fù)后二者恢復(fù)平衡。不同的是，這項(xiàng)研究中血清TNF-α、sTNFR 水平與肺功能指標(biāo)存在相關(guān)性，可能與該研究納入的AECOPD患者肺功能更差、病情更重有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)APACHE-II 評分與誘導(dǎo)痰中TNF-α 水平呈正相關(guān)，與sTNFR-55、sTNFR-75 水平呈負(fù)相關(guān)，而與血清中3 種炎癥介質(zhì)水平不存在相關(guān)性，提示氣道炎癥能而非全身炎癥能一定程度反映AECOPD 病情嚴(yán)重程度。

本研究結(jié)果表明誘導(dǎo)痰和血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平之間不存在相關(guān)性，僅誘導(dǎo)痰中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平與肺功能指標(biāo)存在相關(guān)性，提示全身炎癥的存在可能并不是由于局部炎癥的溢出，氣道及全身炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制可能不同。Sapey 等[11]研究同樣指出血清和誘導(dǎo)痰中的TNF-α 無直接關(guān)聯(lián)，沒有證據(jù)支持任何一種細(xì)胞因子直接從肺部溢出至血液中。然而，一種細(xì)胞因子可能通過自分泌及旁分泌局部釋放，引起另一種細(xì)胞因子釋放至血液循環(huán)中從而引起全身炎癥，例如IL-6 釋放引起CRP 產(chǎn)生[12]。近年來研究[13]指出全身炎癥表型作為COPD 一個新的表型，并非所有患者均存在持續(xù)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，長期隨訪過程中炎癥反應(yīng)并不穩(wěn)定，而且不同COPD 研究中炎癥標(biāo)志物種類均不同，各種氣道和全身炎癥介質(zhì)的代謝途徑尚未完全清楚。COPD 全身炎癥與氣道炎癥之間的聯(lián)系尚不清楚，并不能通過簡單“溢出”原理來解釋，目前并未發(fā)現(xiàn)能解釋兩個部位炎癥聯(lián)系的標(biāo)志物及炎癥通路，可能存在特定的全身炎癥表型也尚不可知，有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明戒煙后誘導(dǎo)痰中TNF-α 水平降低，sTNFR-55、sTNFR-75 水平升高，而血清中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR 水平則不存在上述改變，與Vernooy 等[9]研究結(jié)果相符，提示COPD 患者戒煙后氣道炎癥并未減輕。Willemse等[14]一項(xiàng)前瞻性研究，觀察28 名COPD 吸煙者戒煙1 a 后氣道炎癥變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)支氣管活檢中氣道炎癥持續(xù)存在，痰液中中性粒細(xì)胞比例和IL-8 水平均增加，進(jìn)一步證實(shí)COPD 患者戒煙后氣道炎癥仍在進(jìn)行，可能與持續(xù)微生物刺激和自身免疫機(jī)制有關(guān)[15]。目前認(rèn)為戒煙是COPD 預(yù)防和治療的重要措施，既往研究[16]表明戒煙能減緩FEV1下降，改善呼吸系統(tǒng)癥狀和氣道高反應(yīng)性，關(guān)于戒煙對疾病影響的潛在機(jī)制尚不可知，可能與氣道炎癥及氣道重塑過程受到影響有關(guān)。

綜上，誘導(dǎo)痰中TNF-α、sTNFR-55、sTNFR-75 水平有望作為AECOPD 療效、病情嚴(yán)重程度評估的炎癥標(biāo)志物。COPD 全身與氣道炎癥可能存在不同的調(diào)節(jié)機(jī)制，二者之間的聯(lián)系尚不清楚，可能存在特定的全身炎癥表型。戒煙后COPD 患者氣道炎癥仍在進(jìn)展。