基于miR-34a-5p/SIRT1通路探討壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸治療偏頭痛模型大鼠的作用機(jī)制

范小婷 ，沈小淞 ，施學(xué)麗 ，劉姣 ，梁弘 ，趙明陽 ，林辰

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001

偏頭痛是一種以頭部疼痛為主癥，伴發(fā)惡心、嘔吐等自主神經(jīng)功能障礙的慢性神經(jīng)血管性疾病[1]。有文獻(xiàn)報道，按失能所致生命年損失計算，偏頭痛為我國第5位致殘性疾病，其高發(fā)病率及致殘率對患者生活質(zhì)量造成巨大影響[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療偏頭痛多以緩解疼痛為主，但所用藥物對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等有一定不良反應(yīng)[3]。壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸具有降低炎癥、提高機(jī)體免疫功能作用[4-5]，對偏頭痛防治有獨(dú)特優(yōu)勢[6]。三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)（TGVS）激活引起的神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)是偏頭痛發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]，miR-34a與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，其高表達(dá)可促進(jìn)炎癥發(fā)展[8]。沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT）1是組蛋白修飾的去乙?；福ㄟ^去乙?；艘蜃樱∟F）-κB發(fā)揮抗炎作用[9]，是miR-34a的靶基因[10]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p/SIRT1通路介導(dǎo)偏頭痛發(fā)病過程，調(diào)控miR-34a-5p/SIRT1通路，抑制乙?；疦F-κB p65（Ac-NF-κB p65）表達(dá)可緩解大鼠偏頭痛[11]。壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸能調(diào)控SIRT1/NF-κB通路[12]。本研究以硝酸甘油誘導(dǎo)偏頭痛模型大鼠為研究對象，觀察壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸對腦組織miR-34a-5p/SIRT1信號通路的影響，揭示其治療偏頭痛的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±25）g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0014。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心清潔級動物房，室溫（23±2）℃，濕度50%～65%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。本實(shí)驗相關(guān)操作均按照《關(guān)于善待實(shí)驗動物的指導(dǎo)性意見》有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，并通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物福利倫理委員會審批（DW20211224-222）。

1.2 主要試劑與儀器

硝酸甘油注射液（山西康寶生物制品股份有限公司，批號200707L2641），SIRT1抑制劑EX-527（美國Selleck，批號S1541），降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、NF-κB、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA Kit（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號均為20220410），RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號20220310），SIRT1抗體（北京索萊寶科技有限公司，批號20220413），Ac-NF-κB p65抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號AF3795），NF-κB p65抗體、TNF-α抗體（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號20211210、20210910），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量mix（武漢莫納生物科技有限公司，批號140609、140450），TUNEL試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號MPC2103014）。酶標(biāo)分析儀（南京德鐵，型號HBS-1096A），低溫離心機(jī)（德國Eppendorf，型號5418R），多功能酶標(biāo)儀（美國MD，型號FilterMax F3），蛋白轉(zhuǎn)印模塊（美國Bio-Rad，型號Mini Trans-Blot Cell），凝膠成像系統(tǒng)（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，型號EI600C），熒光定量PCR儀（瑞士Roche，型號Light Cycler?96），病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016），石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號JB-P5），顯微鏡、成像系統(tǒng)（日本尼康，型號E100、DS-U3）。

1.3 分組及造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、點(diǎn)灸組、點(diǎn)灸+EX-527組和點(diǎn)灸+生理鹽水組，每組8只。參考文獻(xiàn)[13-14]建立偏頭痛大鼠模型，分別于第1、5、9、13、14日頸部皮下注射硝酸甘油注射液10 mg/kg，空白對照組注射0.9%氯化鈉注射液10 mg/kg，共5次。大鼠注射后出現(xiàn)前肢頻繁撓頭、雙耳發(fā)紅、咬尾、爬籠次數(shù)增多、往返運(yùn)動增多、煩躁不安等行為提示造模成功[15-16]。

1.4 干預(yù)

第1日造模成功30 min后開始干預(yù)，點(diǎn)灸組、點(diǎn)灸+EX-527組和點(diǎn)灸+生理鹽水組選取大鼠“合谷”（雙）、“太沖”（雙）和“臍環(huán)穴”[17-19]，臍環(huán)穴3穴、6穴、9穴、12穴分別位于肚臍正左方、正下方、正右方和正上方（旁開2.5 mm）。將大鼠固定于特制鼠板，剃除穴位處毛發(fā)，將壯醫(yī)藥線（直徑0.7 mm）點(diǎn)燃，待火候形成珠火，立刻用輕手法施灸于穴位上，火滅即起為1壯，每穴點(diǎn)灸2壯，每日1次，連續(xù)14 d；點(diǎn)灸+EX-527組于點(diǎn)灸后腹腔注射EX-527（5 mg/kg）[20]；點(diǎn)灸+生理鹽水組于點(diǎn)灸后腹腔注射生理鹽水（5 mg/kg）?？瞻讓φ战M和模型對照組僅固定，不干預(yù)。

1.5 取材

第14日對大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分后，2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，快速腹主動脈采血5 mL，3 000 r/min離心10 min，收集血清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒋笫髷囝^處死，冰上分離中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)，沿矢狀位平均分成2部分：一部分于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot、qPCR檢測；另一部分用4%多聚甲醛固定后，制作石蠟切片，用于HE染色和TUNEL染色。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 行為學(xué)評分

第14日干預(yù)后對大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分[21]。記錄各組大鼠撓頭、咬尾、爬籠、往返運(yùn)動次數(shù)，每個行為出現(xiàn)1次計1分。

1.6.2 ELISA檢測

根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定各組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量。

1.6.3 qPCR檢測

取中腦組織20 mg加入1 mL Trizol，低溫研磨機(jī)研磨，加入氯仿200 μL漩渦震蕩30 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，沉淀、干燥RNA后，DEPC水溶解，酶標(biāo)儀測定濃度和純度。配制反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用cDNA作為擴(kuò)增模板，配制20 μL PCR體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6.4 Western blot檢測

取中腦組織剪碎，每20 mg組織加入200 μL裂解液，低溫高速組織研磨儀研磨，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度?？焖倌z制備試劑盒制膠，加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜放入快速封閉液中封閉30 min，分別置于SIRT1一抗（1∶1 000）、Ac-NF-κB p65一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶2 000）、TNF-α一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶2 000）中，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，將膜放入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶10 000）中，37 ℃搖床孵育1 h。TBST洗膜，ECL超敏化學(xué)發(fā)光液浸泡，凝膠成像系統(tǒng)顯色，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6.5 HE染色

石蠟切片65 ℃烤片2 h，脫蠟至水，滴加蘇木素染液染色5 min，自來水浸泡，分化，返藍(lán)，水洗，滴加伊紅染液染色5 min，無水乙醇脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察中腦組織病理變化。

1.6.6 TUNEL染色

根據(jù)凋亡試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡下采集圖像，細(xì)胞核棕黃色代表凋亡細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取5個不重疊視野，用CMIAS圖像分析系統(tǒng)計算凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸對模型大鼠行為學(xué)評分的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠行為學(xué)評分明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，點(diǎn)灸組、點(diǎn)灸+EX-527組和點(diǎn)灸+生理鹽水組大鼠行為學(xué)評分明顯降低（P＜0.05）；與點(diǎn)灸組比較，點(diǎn)灸+EX-527組大鼠行為學(xué)評分明顯升高（P＜0.05）；與點(diǎn)灸+EX-527組比較，點(diǎn)灸組+生理鹽水組大鼠行為學(xué)評分明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠行為學(xué)評分比較（，分）

表2 各組大鼠行為學(xué)評分比較（，分）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05；與點(diǎn)灸組比較，△P＜0.05；與點(diǎn)灸+EX-527組比較，&P＜0.05

評分組別 只數(shù)12.13±1.64 43.88±4.19**27.63±2.39#33.25±3.28#△27.50±3.38#&空白對照組模型對照組點(diǎn)灸組點(diǎn)灸+EX-527組點(diǎn)灸+生理鹽水組8 8 8 8 8

2.2 壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸對模型大鼠血清降鈣素基因相關(guān)肽、核因子-κB、腫瘤壞死因子α含量的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量明顯增加（P＜0.01）；與模型對照組比較，點(diǎn)灸組、點(diǎn)灸+EX-527組和點(diǎn)灸+生理鹽水組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量明顯減少（P＜0.05）；與點(diǎn)灸組比較，點(diǎn)灸+EX-527組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量明顯增加（P＜0.05）；與點(diǎn)灸+EX-527組比較，點(diǎn)灸組+生理鹽水組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α 含量明顯減少（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量比較（）

表3 各組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量比較（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05；與點(diǎn)灸組比較，△P＜0.05；與點(diǎn)灸+EX-527組比較，&P＜0.05

組別TNF-α/（pg/mL）只數(shù)CGRP/（pg/mL）NF-κB/（μmol/L）空白對照組模型對照組點(diǎn)灸組點(diǎn)灸+EX-527組點(diǎn)灸+生理鹽水組54.01± 9.01 151.14±21.58**85.06± 9.09#104.15±17.26#△89.21± 8.25#&8 8 8 8 8 104.87±12.45 248.02±22.84**151.65±12.81#194.69±28.75#△149.69±18.68#&32.54± 4.55 93.66±11.30**51.69± 6.53#66.29± 8.40#△47.83± 4.96#&

2.3 壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸對模型大鼠中腦組織miR-34a-5p、沉默信息調(diào)節(jié)因子1、核因子-κB p65 mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠中腦組織miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表達(dá)升高（P＜0.01），SIRT1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，點(diǎn)灸組、點(diǎn)灸+EX-527組和點(diǎn)灸+生理鹽水組大鼠中腦組織miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），SIRT1 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）；與點(diǎn)灸組比較，點(diǎn)灸+EX-527組大鼠中腦組織miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05），SIRT1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）；與點(diǎn)灸+EX-527組比較，點(diǎn)灸組+生理鹽水組大鼠中腦組織miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），SIRT1 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠中腦組織miR-34a-5p、SIRT1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較（）

表4 各組大鼠中腦組織miR-34a-5p、SIRT1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05；與點(diǎn)灸組比較，△P＜0.05；與點(diǎn)灸+EX-527組比較，&P＜0.05

組別空白對照組模型對照組點(diǎn)灸組點(diǎn)灸+EX-527組點(diǎn)灸+生理鹽水組NF-κB p65 1.01±0.16 2.11±0.23**1.25±0.13#1.55±0.16#△1.30±0.14#&只數(shù)8 8 8 8 8 miR-34a-5p 1.01±0.11 1.89±0.24**1.32±0.15#1.63±0.17#△1.33±0.12#&SIRT1 1.01±0.14 0.37±0.05**0.76±0.12#0.62±0.08#△0.74±0.10#&

2.4 壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸對模型大鼠中腦組織沉默信息調(diào)節(jié)因子1、乙?；?核因子-κB p65、核因子-κB p65、腫瘤壞死因子α蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠中腦組織SIRT1蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，點(diǎn)灸組、點(diǎn)灸+EX-527組和點(diǎn)灸+生理鹽水組大鼠中腦組織SIRT1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與點(diǎn)灸組比較，點(diǎn)灸+EX-527組大鼠中腦組織SIRT1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與點(diǎn)灸+EX-527組比較，點(diǎn)灸+生理鹽水組大鼠中腦組織SIRT1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和 TNF-α 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖1、表5。

圖1 各組大鼠中腦組織SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠中腦組織SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α蛋白表達(dá)比較（）

表5 各組大鼠中腦組織SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α蛋白表達(dá)比較（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05；與點(diǎn)灸組比較，△P＜0.05；與點(diǎn)灸+EX-527組比較，&P＜0.05

組別空白對照組模型對照組點(diǎn)灸組點(diǎn)灸+EX-527組點(diǎn)灸+生理鹽水組0.46±0.06 0.92±0.11**0.59±0.07#0.75±0.09#△0.60±0.09#&8 8 8 8 8 1.10±0.11 0.49±0.07**0.84±0.10#0.67±0.07#△0.85±0.10#&0.38±0.07 0.86±0.09**0.57±0.07#0.71±0.08#△0.54±0.06#&0.46±0.06 1.15±0.13**0.65±0.09#0.86±0.10#△0.64±0.08#&TNF-α只數(shù)SIRT1Ac-NF-κB p65NF-κB p65

2.5 壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸對模型大鼠中腦組織病理變化的影響

空白對照組大鼠中腦組織染色均勻，神經(jīng)細(xì)胞排列緊密、整齊，邊緣清晰，未見明顯細(xì)胞腫脹、壞死等病理改變及炎癥細(xì)胞浸潤；模型對照組大鼠中腦組織未見明顯細(xì)胞腫脹、壞死等病理改變和炎癥細(xì)胞浸潤；點(diǎn)灸組、點(diǎn)灸+EX-527組和點(diǎn)灸+生理鹽水組大鼠中腦組織均未出現(xiàn)明顯變化。總體上，各組大鼠中腦組織HE染色均未發(fā)現(xiàn)明顯器質(zhì)性病變，未見明顯水腫、壞死等。見圖2。

圖2 各組大鼠中腦組織形態(tài)（HE染色，×400）

2.6 壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸對模型大鼠中腦組織細(xì)胞凋亡的影響

各組大鼠中腦組織神經(jīng)細(xì)胞均未見胞體縮小及胞核固縮，無明顯細(xì)胞凋亡，胞核染色均勻，形態(tài)正常。見圖3。

圖3 各組大鼠中腦組織細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)（TUNEL染色，×400）

3 討論

壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸是國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，具有祛毒通絡(luò)、調(diào)氣止痛等功效，且無不良反應(yīng)。臨床應(yīng)用壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸治療偏頭痛效果滿意[22]。壯醫(yī)學(xué)認(rèn)為，偏頭痛發(fā)病主要與外來毒邪或內(nèi)生毒邪阻滯“巧塢”（大腦）之龍路、火路，致機(jī)體三道兩路不暢，氣血失衡，天、地、人三氣不能同步運(yùn)行，終致“巧塢”道路網(wǎng)絡(luò)不通或失養(yǎng)相關(guān)[23]。因此，治療以通路止痛、均衡氣血，復(fù)歸天、地、人三氣同步運(yùn)行為要。壯醫(yī)將肚臍比作“命蒂”，不僅能溝通五臟六腑與先天、后天，還與人整體相通應(yīng)。且臍部位于人體中央，聚集天、地、人三部之精華，可承上啟下，是氣血運(yùn)行之樞紐，與人體天氣之下降、地氣之上升、人氣之調(diào)和密切相關(guān)。壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸臍環(huán)穴（3穴、6穴、9穴、12穴）不僅能暢通道路，調(diào)整機(jī)體氣機(jī)，還可溝通先天與后天，鼓舞正氣，祛邪外出，從而恢復(fù)機(jī)體氣血均衡、三氣同步的自然狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)靜安神止痛。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度分析，刺激臍環(huán)穴可能通過神經(jīng)、體液而調(diào)節(jié)神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)，從而改善各組織器官的功能活動[19]。合谷可行氣通降，開竅鎮(zhèn)靜止痛以安神；太沖善于理氣止痛，調(diào)和氣血以安神。文獻(xiàn)報道，針灸合谷、太沖可調(diào)控NF-κB信號通路，改善大腦動脈血流速度及偏頭痛癥狀[24]。

硝酸甘油制備偏頭痛模型已得到認(rèn)可[25]，其在體內(nèi)產(chǎn)生一氧化氮同時作用于血管和神經(jīng)元，一方面通過強(qiáng)烈的擴(kuò)血管作用，在血管周圍產(chǎn)生無菌性炎癥；另一方面通過激活TGVS，激活神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)產(chǎn)生CGRP等，進(jìn)一步引發(fā)偏頭痛[26]。而CGRP釋放入血是TGVS激活的重要環(huán)節(jié)，是引發(fā)偏頭痛的重要因子[27]。本研究中，大鼠造模后出現(xiàn)行為學(xué)改變，與空白對照組比較，模型對照組大鼠行為學(xué)評分升高，且血清炎癥因子TNF-α、NF-κB含量和舒血管神經(jīng)肽CGRP含量增加，提示偏頭痛模型造模成功。TNF-α、NF-κB、CGRP均參與偏頭痛發(fā)生，TGVS被激活，處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)。干預(yù)后，點(diǎn)灸組、點(diǎn)灸+EX-527組和點(diǎn)灸+生理鹽水組大鼠行為學(xué)評分均顯著降低，血清TNF-α、NF-κB、CGRP含量減少，提示壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸治療可以抑制炎癥因子NF-κB、TNF-α分泌，減少舒血管神經(jīng)肽CGRP釋放，有效調(diào)控偏頭痛模型大鼠神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)血管擴(kuò)張。有文獻(xiàn)指出，TGVS存在炎癥因子-CGRP-血管舒縮異常正反饋環(huán)路，進(jìn)一步加強(qiáng)炎癥反應(yīng)和血管擴(kuò)張，維持偏頭痛持續(xù)狀態(tài)[28]。由此，本研究中模型大鼠血清CGRP含量增加可能與炎癥因子TNF-α含量增加相關(guān)，TGVS中炎癥因子-CGRP-血管舒縮異常正反饋環(huán)路被激活，炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)CGRP釋放，且存在惡性循環(huán)，而壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸可以調(diào)控炎癥因子-CGRP-血管舒縮異常環(huán)路，抑制炎癥因子TNF-α合成與表達(dá)，從而拮抗CGRP。

miRNA是一類非編碼單鏈RNAs，具有調(diào)控靶基因表達(dá)作用。目前已發(fā)現(xiàn)一些miRNAs與炎癥反應(yīng)[29]、慢性疼痛[30]等相關(guān)，其中miR-34a-5p與偏頭痛發(fā)作相關(guān)[31]。靜息狀態(tài)下，NF-κB（p50、p65等亞單位）通常與其抑制因子以異源二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[32]，當(dāng)機(jī)體受到炎癥等信號刺激時，NF-κB被激活，快速移位進(jìn)入細(xì)胞核并大量轉(zhuǎn)錄，促使下游炎癥因子分泌[33]，從而參與炎癥反應(yīng)[34]。SIRT1是一種去乙酰化酶，也參與偏頭痛病理過程[35]。SIRT1可直接作用于NF-κB p65，通過去乙?；饔媒档虯c-NF-κB p65水平，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，調(diào)控下游炎癥因子轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而改善炎癥癥狀[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠中腦組織miR-34a-5p表達(dá)升高，SIRT1基因與蛋白表達(dá)降低，Ac-NF-κB p65、TNF-α蛋白及NF-κB p65基因和蛋白表達(dá)升高，提示miR-34a-5p能抑制SIRT1表達(dá)，導(dǎo)致SIRT1去乙?；芰档停琋F-κB p65乙?；?，誘發(fā)NF-κB核移位，激活其介導(dǎo)的炎癥信號通路，從而釋放大量炎癥因子。經(jīng)壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸干預(yù)后，miR-34a-5p表達(dá)降低，SIRT1基因和蛋白表達(dá)升高，Ac-NF-κB p65、TNF-α蛋白及NF-κB p65基因和蛋白表達(dá)降低，提示壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸可通過抑制miR-34a-5p表達(dá)，促進(jìn)SIRT1轉(zhuǎn)錄，提高其去乙?；芰Γ种芅F-κB激活，進(jìn)而抑制下游炎癥因子釋放。注射SIRT1抑制劑EX-527后，出現(xiàn)拮抗壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸的抗炎效應(yīng)，而點(diǎn)灸+生理鹽水組并未出現(xiàn)此種拮抗效果，進(jìn)一步提示壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸可通過上調(diào)SIRT1表達(dá)抑制炎癥信號通路。

在本研究中模型對照組大鼠雖處于炎癥狀態(tài)，而中腦未出現(xiàn)組織形態(tài)改變和細(xì)胞凋亡，推測可能是在炎癥早期，炎性細(xì)胞雖釋放炎癥因子，但炎癥反應(yīng)尚未達(dá)到引發(fā)炎性細(xì)胞浸潤的程度，因而HE染色未見組織形態(tài)改變。盡管炎癥會引發(fā)細(xì)胞凋亡，但與炎癥因子濃度有關(guān)，并呈濃度依賴性[37]。本研究中，模型組大鼠中腦組織無明顯細(xì)胞凋亡，推測低濃度的炎癥因子雖引發(fā)了神經(jīng)細(xì)胞功能障礙，但不足以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸臍環(huán)穴（3穴、6穴、9穴、12穴）、合谷、太沖可能通過調(diào)控miR-34a-5p/SIRT1信號通路，抑制miR-34a-5p表達(dá)，促進(jìn)SIRT1轉(zhuǎn)錄，降低Ac-NF-κB p65水平，從而抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)移，減少炎癥因子分泌及舒血管神經(jīng)肽CGRP釋放，發(fā)揮治療偏頭痛作用。