梨果黑斑病菌鈣調磷酸酶基因生物信息學分析及其對侵染結構分化的調控作用

楊陽陽，毛仁燕，李永才，畢 陽，蔣倩倩，謝鵬東，袁 晶

(甘肅農業(yè)大學 食品科學與工程學院，蘭州 730070)

梨果黑斑病菌互隔交鏈孢(Alternariaalternata)是一種典型的潛伏侵染菌，當其孢子接觸到梨果表面，感知表皮信號如疏水、蠟質等的刺激后，孢子萌發(fā)并進一步分化形成侵染結構，進而啟動侵染[1-2]。研究發(fā)現胞內G蛋白介導的信號級聯途徑、cAMP-PKA途徑、MAPK信號途徑和Ca2+信號途徑等主要信號通路對病原物感知外界信號進而啟動侵染具有重要的調控作用[3-4]。其中，Ca2+信號途徑是真核生物重要的細胞傳導途徑之一，Ca2+被認為是許多生物細胞生長和發(fā)育必不可少的陽離子，真菌通過鈣泵或Ca2+通道來控制細胞質中的Ca2+濃度[5]。

鈣調磷酸酶CaN作為Ca2+信號轉導途徑中的重要元件，是一種絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白磷酸酶[6]，被激活后的CaN會使其下游的一些轉錄因子發(fā)生去磷酸化，從而在真菌生物學過程中起到調控作[7]。另外，CaN是目前所知唯一的一個活性受Ca2+和CaM調控的蛋白磷酸酶，由一個催化亞基CNA和調節(jié)亞基CNB以等量比例聚合而成的異源二聚體[7]。在鈣調磷酸酶級聯反應中，CaM和CaN的調節(jié)亞基CNB充當Ca2+信號的傳感器，細胞質中游離的Ca2+會與CaM形成Ca2+/CaM復合物，該復合物與鈣調磷酸酶的催化亞基CNA和調節(jié)亞基CNB特異性結合，形成Ca2+/CaM-CaN復合物，產生功能性磷酸酶活性[8]。CsA是鈣調磷酸酶特異性抑制劑，其可通過與免疫親和蛋白CyP結合抑制CaN兩個亞基活性，從而抑制鈣信號級聯反應[9]。已有大量研究表明CaN參與到多種真菌的生長發(fā)育、孢子形成以及細胞壁合成[8]。張世偉[10]研究發(fā)現在球孢白僵菌Beauveriabassiana中催化亞基CNA會影響該菌菌落形態(tài)、分生孢子產生以及對殺菌劑咯菌氰的敏感性。李志勇等[11]利用CaN抑制劑環(huán)孢素A處理發(fā)現CaN參與調控粟彎孢霉葉斑病菌Curvularialunata分生孢子的萌發(fā)。除此以外，在釀酒酵母[12]Saccharomycescerevisiae、大麥黑粉菌[13]Ustilagohordei、玉米黑粉菌[14]Ustilagomaydis、尖孢鐮刀菌[15]Fusariumoxysporum等真菌中發(fā)現CaN還參與真菌對逆境脅迫的響應，可見CaN在真菌中的調控作用因病原物而異，存在多樣性和復雜性，且其在梨果黑斑病菌A.alternata中調控作用仍需進一步研究。

甘肅農業(yè)大學采后生物學與技術團隊已通過遺傳學和藥理學研究發(fā)現Ca2+信號途徑中關鍵成分磷脂酶C(phospholipase C)參與了梨果黑斑病菌營養(yǎng)生長、孢子萌發(fā)以及致病力調控過程[16]。同時有研究發(fā)現CaN是柑橘褐斑病菌A.alternata發(fā)育和致病所必須的[17]。為進一步探究梨果黑斑病菌CaN基因的結構和生物功能，本研究在對梨果黑斑病菌A.alternata中CaN的催化亞基CNA和調節(jié)亞基CNB基因克隆的基礎上，對其進行生物信息學分析，通過RT-qPCR進一步分析CaN在疏水及果蠟誘導A.alternata孢子萌發(fā)、附著胞形成等過程中的表達情況。同時用CaN抑制劑CsA處理A.alternata，分析在疏水、蠟質等的誘導下CaN對A.alternata侵染結構形成的調控，并通過體內試驗研究其對該病菌致病性的影響，以期進一步揭示Ca2+信號途徑中關鍵成分CaN在疏水及蠟質誘導A.alternata侵染結構分化及致病性中具體的調控機理。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 梨黑斑病病菌A.alternata菌株(KY397985.1)，由甘肅農業(yè)大學采后生物學與技術實驗室保存的菌種，經活化3代后使用。

1.1.2 供試果實 早酥梨Pyrusbretchneidericv.Zaosu采自甘肅省條山農場，挑選符合試驗要求的早酥梨，于當天運至實驗室，置于冷庫貯藏，待用。

1.2 方 法

1.2.1 梨果黑斑病菌A.alternata基因組DNA及RNA的提取 用液氮將新鮮菌絲研磨成粉末狀，使用DNA提取試劑盒進行DNA提取，用TRNzol試劑提取RNA。將部分提取的RNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRaCode.RR047B)試劑盒進行cDNA合成。

1.2.2 梨果黑斑病菌AaCNA和AaCNB基因克隆 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載A.alternata的鈣調磷酸酶CNA和CNB的基因序列，利用DNAMAN 6.0設計AaCNA和AaCNB的擴增引物(表1)，以A.alternata的cDNA為模板進行目的基因擴增。

表1 擴增目的基因引物序列

1.2.3AaCNA和AaCNB基因序列和編碼蛋白的生物信息學分析 利用在線網址進行目的基因及其編碼產物的生物信息學分析，預測網址如表2所示。

表2 在線預測網址

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 稱取0.1 g果蠟溶至10 mL氯仿，將疏水Gelbond膜(接觸角為74.63°±1.24°)剪切至蓋玻片大小(5 cm× 2 cm)，一部分疏水膜不作處理，在另一部分疏水膜上涂上40 μL果蠟(接觸角為101°)，室溫放置4 h，使氯仿充分揮發(fā)。將上述兩種疏水膜放置在載玻片上，然后在其上滴加20 μL濃度為5×105mL-1孢子懸浮液，在黑暗條件下培養(yǎng)，分別在 2 h、4 h、6 h、8 h取樣。用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法檢測A.alternata中AaCNA和AaCNB基因在不同侵染結構形成的4個時間(2、4、6、8 h)中mRNA轉錄水平。以磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)為內參基因。擴增各片段所需引物見表3。

稱取0.1 g果蠟溶至10 mL氯仿，將疏水Gelbond膜(接觸角為74.63°±1.24°)剪切至蓋玻片大小(5 cm×2 cm)，一部分疏水膜不作處理，在另一部分疏水膜上涂上40 μL果蠟(接觸角為101°)，室溫放置4 h，使氯仿充分揮發(fā)。將上述兩種疏水膜放置在載玻片上，然后在其上滴加20 μL濃度為5×105mL-1孢子懸浮液，在黑暗條件下培養(yǎng)，分別在2 h、4 h、6 h、8 h取樣。用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法檢測A.alternata中AaCNA和AaCNB基因在不同侵染結構形成的4個時間(2、4、6、8 h)中mRNA轉錄水平。以磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)為內參基因。擴增各片段所需引物見表3。

表3 基因定量引物序列

1.2.5 CaN在疏水、蠟質條件下對A.alternata侵染結構形成的影響 將A.alternata孢子懸浮液離心棄去上清液，然后向沉淀物中加入2 mL 濃度為0.1 μmol/L CsA溶液，以加入2 mL無菌水作為對照，震蕩懸浮菌體。將處理好的孢子懸浮液(20 μL)分別滴在有、無蠟質處理的疏水性Gelbond膜面上，分別在2 h、4 h、6 h和8 h計數孢子萌發(fā)率和附著胞的形成率。

1.2.6 CaN對A.alternata致病力的影響 選擇大小均勻、無病無損傷的早酥梨果實，用2%的NaClO溶液進行消毒2 min，之后用蒸餾水沖洗，晾干，再用75%的酒精對果實表皮進行擦拭消毒，然后用直徑3 mm的打孔鐵釘均勻的在果實赤道部位打3個孔，每孔中接種上濃度為1×106mL-1的A.alternata孢子懸浮液20 μL，在接種2 h后，處理組向每個孔中接入20 μL的濃度為10 μmol/L CsA溶液，無菌水作為對照。在室溫下晾干，用規(guī)格為30 cm×45 cm，厚0.02 mm的市售保鮮袋包裝，室溫條件下，以十字交叉法每 2 d 1次，測果實的病斑直徑，每個處理用果實9個，每個處理分別重復3次。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2010計算平均值和標準偏差并作圖，用SPSS 20.0進行Duncan’s多重差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 AaCNA和AaCNB基因克隆

以梨果黑斑病菌A.alternata的cDNA為模板，利用特異性引物AaCNA-F/R和AaCNB-F/R對其進行PCR擴增(表1)，得到大小分別為 1 660 bp左右的AaCNA和528 bp左右的AaCNB(圖1)。

M.2 000 Marker；1～4.AaCNA PCR結果；5～6.AaCNB PCR結果

2.2 AaCNA和AaCNB蛋白的生物信息學分析

2.2.1AaCNA和AaCNB基因結構 基因結構及序列信息分析表明，AaCNA基因全長為 1 900 bp，包含4個內含子和5個外顯子，內含子長度分別為100、46、45、49 bp，其CDS區(qū)長度為 1 660 bp，共編碼551個氨基酸；AaCNB基因全長為715 bp，包含3個內含子和4個外顯子，內含子長度分別為76、54、57 bp，其CDS區(qū)長度為528 bp，共編碼174個氨基酸(圖2)。

圖2 AaCNA和AaCNB基因結構

2.2.2AaCNA和AaCNB基因編碼產物理化性質 對AaCNA和AaCNB編碼蛋白理化性質預測表明，AaCNA分子質量為63 310.97 u，化學式為C2823H4361N763O839S28，理論等電點為 5.61，負電荷殘基數(78)均大于正電荷殘基數(63)，屬于酸性蛋白，AaCNA總平均親水性(-0.467)小于0，脂肪系數(76.66)低于100，不穩(wěn)定系數(46.87)大于40，表明AaCNA屬于親水性不穩(wěn)定蛋白；AaCNB分子質量為19 751.17 u，化學式為C859H1 359N233O282S9，其等電點為4.47，負電荷殘基數(33)大于正電荷殘基數(21)，屬于酸性蛋白，AaCNB總平均親水性(-0.478)小于0，脂肪系數(77.30)低于100，不穩(wěn)定系數(33.39)小于40，表明AaCNB屬于親水性穩(wěn)定蛋白。

2.2.3 AaCNA和AaCNB結構域分析 通過SMART網站在線分析AaCNA和AaCNB氨基酸序列的結構域，并通過IBS 1.0軟件繪制AaCNA和AaCNB蛋白結構域，結果顯示，鈣調磷酸酶催化亞基CNA從N端到C端依次是催化結構域(Catalytic domian，CD)，B亞基結合螺旋(B subunit binding helix，BBH)，CaM結合結構域(CaM binding domain，CBD)，自抑制結構域(Autoinhibitiory，AID)，其中后面3個區(qū)域共同調節(jié)催化亞基的功能。CNB是一個由174個氨基酸組成的多肽,屬于EF-hand Ca2+結合蛋白家族，4個Ca2+離子結合位點填充4個Ca2+(圖3)。

圖3 AaCNA和AaCNB的結構域分析

2.2.4AaCNA和AaCNB系統(tǒng)進化樹 利用NCBI下載了部分真菌的CNA與CNB的同源物，通過鄰近法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，Bootstrap值為1 000，其余參數設置為默認值。結果表明，AaCNA和AaCNB分別與Mytilinidionresinicola和Alternariaburnsii基因聚于同一分支，親緣關系最近，同源性分別高達80.61%和99.05%(圖4)。

圖4 AaCNA和AaCNB的系統(tǒng)進化樹

2.2.5 AaCNA和AaCNB跨膜結構域和親/疏水性分析 利用TMHMM Serverv.2.0預測AaCNA和AaCNB蛋白的跨膜區(qū)域，結果顯示，AaCNA和AaCNB蛋白均無跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白(圖5-A、圖5-B)。利用ProtScale預測AaCNA和AaCNB蛋白的親疏水性，圖中正值區(qū)域表示疏水區(qū)域，而負值區(qū)域是親水區(qū)域，發(fā)現AaCNA和AaCNB整體親水性氨基酸平均分值大于疏水性氨基酸，初步推測AaCNA和AaCNB蛋白均為親水性蛋白(圖5-C、圖5-D)。

圖5 AaCNA和AaCNB蛋白的跨膜結構域(A、B)和親疏水性(C、D)預測

2.2.6 AaCNA和AaCNB二、三級結構預測 通過對蛋白的二級結構預測分析可知AaCNA二級結構含有47.37% α-螺旋(藍色)、13.07% 延伸鏈(紅色)、5.63% β-轉角(綠色)和33.94%無規(guī)卷曲(紫色)。AaCNB二級結構含有 52.30% α-螺旋、7.47%延伸鏈、7.47% β-轉角和32.76% 無規(guī)卷曲(圖6-A)。利用在線工具SWISS-MODEL對AaCNA和AaCNB蛋白進行同源建模得到三級結構圖(圖6-B)。

圖6 AaCNA和AaCNB的二(A)、三級(B)結構

2.2.7 AaCNA和AaCNB亞細胞定位與AaCNA和AaCNB磷酸化位點分析 利用PSORT預測結果表明，AaCNA和AaCNB均主要定位于細胞核上(表4)。利用NetPhos 3.1 Server在線分析工具預測AaCNA和AaCNB中的磷酸化位點，結果發(fā)現，AaCNA蛋白存在29個絲氨酸磷酸化位點，19個蘇氨酸磷酸化位點和19個酪氨酸磷酸化位點。AaCNB蛋白存在10個絲氨酸磷酸化位點，3個蘇氨酸磷酸化位點和1個酪氨酸磷酸化位點(圖7)。

表4 AaCNA和AaCNB亞細胞定位預測

圖7 AaCNA和AaCNB蛋白的磷酸位點分析

2.3 AaCNA和AaCNB在疏水及果蠟涂膜表面誘導侵染分化中的表達分析

qRT-PCR結果顯示，AaCNA和AaCNB基因在疏水、蠟質涂膜表面均顯著上調，但誘導水平各不相同(圖8)。以A.alternata萌發(fā)初級階段(2 h)作為對照，AaCNA表達量在侵染結構形成階段均有所上調，在侵染菌絲形成階段(8 h)的表達量最高，其表達量在疏水和蠟質表面分別上調了5.45倍和7.49倍。AaCNB表達量在侵染結構形成階段呈現出先上升后降低的趨勢，在附著胞形成階段(6 h)的表達量達到峰值，其表達量在疏水和蠟質表面分別上調了7.87倍和8.53倍。

豎線表示標準誤(± SE)。不同字母代表顯著性差異(P<0.05)，下同

2.4 CaN對侵染結構分化的調控

2.4.1 CaN在疏水、蠟質條件下對A.alternata侵染結構形成的調控 CaN抑制劑CsA處理顯著降低A.alternata孢子萌發(fā)率和附著胞形成率，但相較于疏水表面，在蠟質表面A.alternata孢子萌發(fā)率和附著胞形成率較高。與對照組相比，使用CsA處理8 h時，在疏水表面A.alternata孢子萌發(fā)率降低47.1%，附著胞形成率降低68.1%，而在蠟質表面A.alternata孢子萌發(fā)率降低41.4%，附著胞形成率降低39.0%(圖9)。

圖9 CsA處理在疏水、蠟質誘導A.alternata孢子萌發(fā)率和附著胞形成率

2.4.2 CaN對A.alternata致病力的調控 使用CaN抑制劑CsA處理可抑制損傷接種A.alternata梨果黑斑病的擴展(圖10)。在第7 天時，CsA處理相對于對照組病斑直徑減少 52.3%。

圖10 CsA處理對早酥梨黑斑病擴展的影響

3 討 論

本試驗從A.alternata中克隆得到CaN的催化亞基AaCNA和調節(jié)亞基AaCNB。通過生物信息學分析得出，這兩個基因雖都為親水性蛋白，但兩個蛋白的親水程度不一樣，而這與蛋白穩(wěn)定性有一定的關系，分析得出AaCNA為不穩(wěn)定蛋白，而AaCNB為穩(wěn)定蛋白。通常認為蛋白質分子是否穩(wěn)定是由α-螺旋和β-折疊結構決定，伸展結構和無規(guī)則卷曲則決定蛋白質的功能[18]。通過對兩基因蛋白的二級結構預測分析可知，AaCNA和AaCNB編碼的蛋白主要由α-螺旋和不規(guī)則卷曲構成，而β-轉角和延伸鏈則散布于整個蛋白質中。這一結果與劉艷梅等[19]報道的玉米大斑病菌CNB二級結構預測一致。磷酸化參與多種細胞生命活動，如信號傳導、細胞凋亡調節(jié)等[20]。潛在磷酸化位點越多，可能發(fā)揮更多的功能。通過對AaCNA和AaCNB進行磷酸化位點分析得出AaCNA磷酸化位點較AaCNB要多，說明AaCNA應用功能作用更大一些，這一結果與Heng等[21]得出的CaN酶活功能主要由催化亞基CAN決定的結論相對應。蛋白質需要處于細胞中特定的亞細胞才能發(fā)揮其功能，亞細胞定位也在一定程度上反映了其對應基因的功能。預測AaCNA和AaCNB在細胞中的可能分布位置，結果顯示AaCNA和AaCNB均定位在細胞核上，而劉艷梅等[19]報道玉米大斑病菌CNB亞細胞定位在細胞質，表明其定位因病原物而異。本研究進一步通過蛋白結構域分析表明，AaCNA包括一個N端催化結構域，CNB結合結構域，鈣調素CaM結合結構域和自抑制蛋白結構域，其中后面3個區(qū)域共同調節(jié)催化亞基的功能。這一結論與李志勇等[11]在粟彎孢霉葉斑病菌ClCna得出的關于結構域的分析一致，說明CNA基因在植物病原真菌進化過程存在保守性。有研究指出鈣調磷酸酶催化亞基CNA必須與CNB和CaM結合后才能行使催化功能，對其下游基因進行調控[22]。AaCNB在結構上與CaM相似，有4個Ca2+結合位點。這一結論與Juvvadi等[23]得出的關于CNB結構域的分析一致，表明其Ca2+結合區(qū)域具有高度保守性。

前期研究表明，A.alternata是重要的采后病原菌之一，具有明顯的潛伏侵染特性[24]，當孢子接觸到果實表面時，果實表面的一些物化信號會刺激孢子萌發(fā)、隨后形成芽管、芽管頂端膨大形成附著胞，而后分化形成侵染菌絲，從而引起果蔬發(fā)生病害。已證明寄主表面疏水性和蠟質等物理化學特性對真菌病原物的侵染具有一定的調控作用[25-26]。早期有研究報道疏水性這一信號可以誘導真菌產生附著胞[27]，除此以外，植物表皮蠟質和角質能誘導真菌病原物附著胞的分化[28]。RT-qPCR分析表明，在侵染結構形成過程中，以A.alternata萌發(fā)初級階段(2 h)作為對照，AaCNA和AaCNB基因無論在疏水還是果蠟提取物涂層表面上均顯著上調，但在疏水表面AaCNA和AaCNB基因的表達量均低于蠟質涂膜表面，進一步說明梨果皮蠟質在CaN對A.alternata侵染結構的形成中發(fā)揮了積極作用。根據AaCNA和AaCNB轉錄水平峰值出現的時間，推測在A.alternata中AaCNA可能主要作用于侵染菌絲的形成，而AaCNB則有助于附著胞的形成?？梢娫贑a2+信號途徑中AaCNA和AaCNB均參與了梨果黑斑病菌A.alternata侵染結構形成的調控。

藥理學結果表明，CsA處理可降低A.alternata孢子萌發(fā)和附著胞形成，但與疏水表面相比，蠟質表面孢子萌發(fā)率和附著胞形成率較高，說明蠟質可誘導真菌形成侵染結構，這與Reisige等[29]研究發(fā)現蠟質可誘導Pucciniagraminisf.sp.tritici.形成附著胞，也誘導50%芽管產生侵入釘的侵染結構這一結果一致。同樣，用免疫抑制劑CsA處理灰葡萄孢后，侵染結構的形成受到抑制[30]。在新型隱球酵母Cryptococcusneoformans中，CaN參與了對孢子產生過程的調控[31]。此外，研究發(fā)現柑橘A.alternata中CaN催化亞基突變體分生孢子的產生完全受到了抑制[17]?？梢?，CaN作為Ca2+信號通路下游的靶蛋白對病原真菌的生長發(fā)育具有重要的調控作用。本研究從A.alternata中克隆得到AaCNA和AaCNB基因，利用生物信息學分析進一步了解AaCAN，qRT-PCR分析和藥理學試驗結果均表明AaCAN參與了A.alternata在疏水、蠟質誘導下侵染結構形成的調控，但其調控的分子機制尚需進一步揭示。