山羊肺源腸外致病型大腸桿菌的分離鑒定、耐藥性測定和毒力基因檢測

徐海軍,李小紅,爨淑楠，張婭菲，賈 哲，王書明，張圣堯

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安 237012；2.安徽金豐源畜牧科技有限公司，安徽六安 237000)

大腸桿菌可分為共生型、腸內(nèi)致病型和腸外致病型(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli, ExPEC)3類菌群。共生型大腸桿菌是正常腸道菌群的重要組成部分，但致病型大腸桿菌可引起人和動(dòng)物的疾病。腸內(nèi)致病型大腸桿菌包括腸致病性大腸桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸聚集性大腸桿菌、彌散黏附性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌，可引起腹瀉、仔豬水腫病、畜禽敗血癥、人溶血尿毒綜合癥[1]。ExPEC不引起宿主腸道感染，但可以侵襲、定植于腸外組織，導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)感染、新生兒腦膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥等[2-4]。動(dòng)物源的ExPEC也可以通過污染的食品傳染給人，對人類健康構(gòu)成威脅[5-6]。

隨著養(yǎng)羊業(yè)的規(guī)模化、集約化發(fā)展，由腸內(nèi)致病型大腸桿菌引起的山羊大腸桿菌病已成為一種常見病和多發(fā)病，主要表現(xiàn)為羔羊腹瀉。近年來，羊感染ExPEC的報(bào)道也日漸增多[7-8]。由于ExPEC感染引起的癥狀和病變?nèi)狈μ禺愋?，給基層準(zhǔn)確診斷本病造成了一定困難。

2020年11月，安徽金豐源畜牧科技有限公司動(dòng)物疾病診斷實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病山羊肺臟分離得到1株細(xì)菌，通過分離純化、16S rRNA基因序列分析，結(jié)合菌體形態(tài)特征和選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征，鑒定為大腸桿菌。對該菌開展溶血試驗(yàn)、系統(tǒng)進(jìn)化群分析、致病性測定、進(jìn)化樹構(gòu)建、毒力基因檢測、耐藥性檢測，并選擇敏感藥物對患病山羊進(jìn)行治療。期望研究結(jié)果能為進(jìn)一步研究該菌的生物學(xué)特性和致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為山羊ExPEC性肺炎的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑藥品 胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptic soybean peptone agar, TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂、麥康凱瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無菌脫纖綿羊血購自南京亞松生物科技有限公司；Taq酶、dNTP Mix、DNA Marker等購自TaKaRa公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；革蘭氏染色液、藥敏紙片(呋喃唑酮、復(fù)方新諾明、萬古霉素)購自杭州濱和微生物試劑有限公司；藥敏紙片(卡那霉素、新霉素、頭孢曲松、多粘菌素B、慶大霉素、阿米卡星、恩諾沙星、阿莫西林、氟苯尼考、紅霉素)購自常德比克曼生物科技有限公司；頭孢噻呋鈉粉針劑購自內(nèi)蒙古聯(lián)邦動(dòng)保藥品有限公司；麻杏石甘散購自上海億源生物藥業(yè)有限公司。

1.1.2 主要儀器 AE124型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；HGPN-II-270型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；GI54DP型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(廈門致微儀器有限公司)；DHG-9035A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；XS-208B型生物顯微鏡(濟(jì)南德勝光電儀器有限公司)；HC-2518R型冷凍高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；DYCP-31DN型DNA 電泳槽、DYY-5型穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器廠)；2720型PCR儀(Applied Biosystems)；FR980型凝膠成像儀(上海復(fù)日科技儀器有限公司)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明種雄性SPF級小鼠10只，體質(zhì)量(20±2)g，購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 病史調(diào)查、臨床癥狀與病理剖檢觀察 2020年11月下旬，六安市金安區(qū)某山羊養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的2月齡小山羊陸續(xù)出現(xiàn)零星發(fā)病，癥狀為精神不振，氣喘，發(fā)病較突然，有的在外面放牧?xí)r發(fā)病，體溫38～40.5 ℃。發(fā)病半個(gè)月以來累計(jì)死亡6只小山羊，大山羊和母山羊未發(fā)病。2020年12月1日，又有1只小山羊發(fā)病，送來就診。該羊較瘦，極度虛弱，精神高度沉郁，耳根發(fā)涼，但氣喘不明顯，也未見咳嗽。該羊送達(dá)后不久死亡，對其進(jìn)行了病理剖檢觀察。

1.2.2 細(xì)菌分離純化、革蘭氏染色鏡檢及溶血試驗(yàn) 無菌操作采集病死羊病變肺組織，涂擦接種于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)18 h。用接種環(huán)挑取長出的菌落用劃線接種法分別轉(zhuǎn)接于TSA平板、伊紅美蘭平板和麥康凱平板，37 ℃培養(yǎng)18 h后，觀察菌落形態(tài)，挑取TSA平板上的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。將純化的分離菌接種于含5%無菌脫纖綿羊血的TSA平板，37 ℃培養(yǎng)18 h后，觀察有無溶血。

1.2.3 分離菌16S rRNA基因測序、進(jìn)化樹構(gòu)建 將分離菌純化培養(yǎng)3次的TSA平板純培養(yǎng)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rRNA基因測序。將獲得的基因序列在NCBI網(wǎng)站利用BLAST程序進(jìn)行相似性比對，根據(jù)比對結(jié)果，結(jié)合分離菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征確定分離菌株的生物種屬。選取相似性高的序列，運(yùn)用 MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建該菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化群鑒定 參照文獻(xiàn)[9]合成擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)化群分群基因(chuA、yjaA和TspE4.C2.)的特異性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列、退火溫度及擴(kuò)增片段預(yù)期大小見表1。用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離菌基因組DNA，并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(不同引物的退火溫度見表1)，72 ℃ 90 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。切下凝膠中的目的條帶，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并與GenBank中的參考序列進(jìn)行相似性比對。

表1 研究中使用的引物序列

1.2.5 致病性試驗(yàn) 將10只小鼠隨機(jī)分為攻毒組和對照組，每組5只。將分離菌菌種接種于胰大豆蛋白胨肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18 h，4 ℃、5 000 r/min離心 5 min 收集菌體，用滅菌生理鹽水懸浮菌體，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)菌濃度調(diào)整至108CFU/mL，攻毒組小鼠按每只0.5 mL劑量腹腔注射菌液，對照組小鼠腹腔注射等體積滅菌生理鹽水，注射后連續(xù)7 d觀察記錄小鼠狀態(tài)和死亡情況。對死亡小鼠進(jìn)行剖檢，觀察病變情況并從肝臟中分離細(xì)菌。

1.2.6 毒力基因檢測 根據(jù)文獻(xiàn)[8-11]設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增ExPEC毒力基因papA、sfaS、focG、iutA、hlyD、afa、fyuA、ireA、vaT、irp2、irp1、tsh、ler、iss、papC、kpsMTII、focD、iroN、ompA、ompT、fimH、hylA、gafD、cnf1、bmaE、cvaC、ibeA、iucD、traT、iha、nfaE和malX的引物，序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以細(xì)菌基因組為模板對32種毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并與GenBank中的參考序列進(jìn)行相似性比對。

1.2.7 藥敏試驗(yàn) 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2017推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，先將分離菌用涂布棒均勻涂布接種在TSA平板上，再將9類13種藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)18 h后，測量抑菌圈直徑，判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果。以E.coliATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.8 防治措施 依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選用敏感抗菌藥對患病山羊進(jìn)行治療，對全群山羊進(jìn)行給藥預(yù)防。加強(qiáng)飼養(yǎng)環(huán)境消毒，保持良好衛(wèi)生條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢

該病羊剖檢病變?yōu)橐粋?cè)肺臟上半部分散在不規(guī)則形紅色肝變病灶(圖1)、心肌較軟，其余未見明顯異常。

圖1 患病山羊一側(cè)肺臟上半部散在不規(guī)則形紅色肝變病灶

2.2 細(xì)菌分離純化、革蘭氏染色鏡檢及溶血試驗(yàn)

從患病山羊病變肺臟組織分離到40個(gè)灰白色菌落，經(jīng)純化培養(yǎng)后，分離菌在TSA平板上的菌落呈圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、灰白色、隆起(圖2)；在伊紅美藍(lán)平板上的菌落呈圓形、邊緣整齊、表面光滑、深紫黑色、帶有金屬光澤(圖3)；在麥康凱平板上的菌落呈圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、紅色(圖4)。挑取TSA平板上單菌落制成細(xì)菌涂片，革蘭氏染色鏡檢結(jié)果表明該菌為短桿狀的革蘭氏陰性菌(圖5)。溶血試驗(yàn)表明該菌無溶血現(xiàn)象(圖6)。

圖2 分離菌在TSA平板上的菌落形態(tài)

圖3 分離菌在伊紅美蘭平板上的菌落形態(tài)

圖4 分離菌在麥康凱平板上的菌落形態(tài)

圖5 分離菌的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

圖6 分離菌的溶血試驗(yàn)結(jié)果

2.3 分離菌16S rRNA基因鑒定結(jié)果及進(jìn)化樹的構(gòu)建

將測序獲得的分離菌16S rRNA基因(1 481 bp)序列在NCBI上利用BLASTn檢索程序進(jìn)行序列相似性比對，結(jié)果顯示分離菌的16S rRNA基因序列與E.colistrain RHB08-C16(CP057959.1)、E.colistrain RHB18-C23(CP057660.1)、E.colistrain RHB08-C20(CP055971.1)、E.colistrain RIVM C018249(CP068802.1)、E.colistrain EC931(CP049118.1)的16S rRNA基因序列相似度均為99.66%。值得注意的是，分離菌的16S rRNA基因序列與Salmonellasp.S13(CP047094.1)和Shigellaboydiistrain FBD007(EU009178.1)的相似度達(dá)到99.73%。但綜合分離菌的形態(tài)特征、選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特點(diǎn)和16S rRNA 基因序列的比對結(jié)果，將該分離菌最終鑒定為埃希氏菌屬的大腸桿菌，將其命名為E.coli-LA-goat。

選取與分離菌相似性高的大腸桿菌16S rDNA序列，運(yùn)用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示分離菌株的16S rRNA 基因序列與大腸桿菌E.coliRH808-C16(CP057959.1)株、E.coliRHB18-C23(CP057660.1)株的相應(yīng)序列聚為一支，置信度為100%(圖7)，說明三者在進(jìn)化上親緣關(guān)系非常近。

圖7 分離菌基于16S rRNA基因序列的發(fā)育進(jìn)化樹

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化群鑒定結(jié)果

系統(tǒng)進(jìn)化群分群基因(chuA、yjaA和TspE4.C2.)檢測結(jié)果(圖8)顯示該菌TspE4.C2.呈陽性，chuA和yjaA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性。因此，參照大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化性組別檢索表[12](表2)，確定該菌屬于B1群。

表2 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化性組別檢索表

1～4分別為chuA、yjaA、 TspE4.C2.基因和陰性對照(蒸餾水)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。 TspE4.C2.基因擴(kuò)增結(jié)果呈陽性，大小為150 bp

2.5 分離菌致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠注射完菌液后24 h內(nèi)，均出現(xiàn)萎靡不振、雙目緊閉、被毛粗亂、食欲下降或廢絕，并伴有嚴(yán)重的腹瀉，瀕死小鼠表現(xiàn)為全身顫抖、呈腹式呼吸。試驗(yàn)組攻毒后第2天小鼠死亡3只，第3天1只小鼠發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，1只小鼠精神好轉(zhuǎn)、被毛恢復(fù)光澤，第4天無小鼠死亡，第5天腹瀉小鼠死亡，第6天后無死亡小鼠。對照組無小鼠死亡。因此，該分離菌對小鼠的致死率為80%(4/5)(表3)。

表3 分離菌對小鼠致病性測定結(jié)果

剖檢攻毒死亡小鼠發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟腫大，呈黑紅色，肺臟有白斑樣病灶，胃、腸道內(nèi)有黃褐色積液，并伴有惡臭味。無菌采集小鼠肝臟組織涂擦接種到麥康凱平板、TSA平板均分離到與攻毒菌菌落形態(tài)一致的細(xì)菌菌落；將TSA平板上的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果呈革蘭氏陰性，且形態(tài)特征與大腸桿菌一致。說明山羊肺臟分離菌能夠致死小鼠，具有很強(qiáng)的致病性。

2.6 分離菌毒力基因檢測結(jié)果

對ExPEC的32種毒力基因進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示該菌株攜帶的毒力基因有iutA(314 bp)、afa(594 bp)、tsh(581 bp)、ompA(718 bp)、fimH(484 bp)、gafD(855 bp)、iucD(710 bp)、traT(283 bp)，未檢測到其他毒力基因(圖9)。毒力基因的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank參考序列的相似性大于99%。

1～35分別為各毒力基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中18、27和35為蒸餾水陰性對照。毒力基因iutA(4)、afa(6)、tsh(12)、ompA(20)、fimH(22)、gafD(24)、iucD(30)、traT(31)擴(kuò)增結(jié)果呈陽性；其他毒力基因擴(kuò)增結(jié)果呈陰性

2.7 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見圖10和表4，可見分離菌對頭孢曲松、氟苯尼考、恩諾沙星和阿米卡星中度敏感，對卡那霉素、新霉素、阿莫西林、慶大霉素、多粘菌素B、呋喃唑酮、復(fù)方新諾明、萬古霉素、紅霉素等9種抗菌藥耐藥。

表4 分離菌耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

1.新霉素；2.阿米卡星；3.阿莫西林；4.慶大霉素；5.頭孢曲松；6.紅霉素；7.氟苯尼考；8.恩諾沙星；9.萬古霉素；10.呋喃唑酮；11.多粘菌素B；12.復(fù)方新諾明；13.卡那霉素

2.8 防治措施及效果

就診當(dāng)天，讓養(yǎng)殖戶回去后將患病山羊隔離，用牛羊鹿流感咳喘注射液(成分為林可霉素和鏈霉素)肌注治療，次日根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果改用頭孢噻呋鈉肌注治療，按體質(zhì)量每公斤10 mg，1次/d，連續(xù)5 d。對其余未發(fā)病山羊用頭孢噻呋鈉肌注預(yù)防，1次/d，連續(xù)2 d；同時(shí)全群山羊用麻杏石甘散(成分為麻黃30 g、苦杏仁30 g、石膏150 g、甘草30 g)拌料，每只羊30～60 g，連喂5 d。每天清掃、消毒1次羊圈和運(yùn)動(dòng)場，連續(xù)消毒5 d。2021年12月10日下午回訪得知羊群未再發(fā)病，病羊已治愈。

3 討 論

目前，羊的呼吸系統(tǒng)疾病已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的一類疾病，其病原組成復(fù)雜，可由細(xì)菌、病毒、真菌、支原體、寄生蟲等的一種或幾種引起[13]。本研究從病羊肺臟組織中分離的細(xì)菌經(jīng)純化培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、16S rRNA基因序列比對、致病性測定和ExPEC標(biāo)記基因檢測，可以確定該菌為腸外致病型大腸桿菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株有較嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，耐藥譜較廣，只對頭孢曲松、恩諾沙星、阿米卡星和氟苯尼考表現(xiàn)中度敏感。建議臨床上在使用抗菌藥之前盡可能對病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，然后選擇敏感藥物進(jìn)行治療，以提高治療效果。

大腸桿菌是條件性致病菌，飼養(yǎng)管理措施不當(dāng)(如環(huán)境條件差、轉(zhuǎn)群應(yīng)激、斷奶應(yīng)激、突然變換飼料、氣候突變等原因)容易誘發(fā)大腸桿菌病的發(fā)生。本次發(fā)病可能與冬季氣溫低、未做好保溫工作有關(guān)。

ExPEC感染難以通過病史調(diào)查、臨床癥狀觀察和病理剖檢進(jìn)行確診。病原分離鑒定是確診ExPEC感染的可靠方法。但也要注意，不能單純依賴細(xì)菌16S rRNA基因測序來進(jìn)行細(xì)菌鑒定，還要綜合考慮其他鑒定方法的鑒定結(jié)果，方能得出正確結(jié)論。例如，本病例中，分離菌的16S rRNA基因序列與沙門氏菌Salmonellasp.S13(CP047094.1)、志賀氏菌Shigellaboydiistrain FBD007(EU009178.1)的相似度為99.73%，高于與大腸桿菌的相似度(99.6%)，但綜合考慮在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特點(diǎn)，將該分離菌最終鑒定為大腸桿菌。需要指出的是，如果遇到用16S rRNA基因測序和選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)等常規(guī)方法均無法有效鑒別時(shí)，還可以考慮用PCR法擴(kuò)增相應(yīng)菌的特異性基因進(jìn)行鑒別。雖然本研究只進(jìn)行了細(xì)菌分離，未進(jìn)行支原體和病毒的檢測，但從采用頭孢噻呋鈉和麻杏石甘散治療就控制了本病的治療結(jié)果看，ExPEC可能是引起羊群本次發(fā)病的唯一病原。本病例中肺部病變區(qū)域與正常區(qū)域分界清晰，病變部位呈暗紅色肝變，面積較大，位于肺的上半部。這一病變特點(diǎn)與郭強(qiáng)強(qiáng)等[8]在綿羊上觀察到的ExPEC引起的肺炎病變十分相似，但后者在肝變區(qū)域還散在灰白色斑塊狀病灶。肺部的上述病變能否作為ExPEC性肺炎的特征病變還有待通過更多的病例觀察進(jìn)行判斷。

本次疫情中，發(fā)病山羊病程較短，大多發(fā)病 2～3 d后即死亡，這也說明本次疫情中引起發(fā)病的ExPEC具有很強(qiáng)的致病力。ExPEC通過其特有的毒力因子侵襲、定植于腸外組織并引起感染。已發(fā)現(xiàn)ExPEC具有多種不同功能的毒力基因，例如黏附素相關(guān)基因(fimH、sfaS、tsh、papA、papC、afa、focD、focG、iha、bmaE、nfaE和gafD)、游離鐵攝取相關(guān)基因(iutA、iron、iucD和ireA)、莢膜多糖相關(guān)基因(kpsMTⅡ)、外膜蛋白相關(guān)基因(ompA、ompT、traT和iss)、毒力島相關(guān)基因(irp1、fyuA、irp2、ler和malX)、毒素相關(guān)基因(hylA、hlyD、vat、cnf1、cvaC和ibeA)[14-16]。本研究對ExPEC 32個(gè)毒力基因檢測結(jié)果表明該菌株攜帶毒力基因iutA、afa、tsh、ompA、fimH、gafD、iucD、traT。

鐵是所有生物體正常代謝和生長的基本元素，細(xì)菌需要10-7～10-5mol/L濃度的鐵才能正常生長和分裂；然而，宿主系統(tǒng)的游離鐵濃度非常低，例如人類血清中游離鐵濃度估計(jì)為10-24mol/L。ExPEC主要通過兩種方式獲得宿主的鐵元素：一種方式是產(chǎn)生溶血素使紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白，然后直接奪取血紅素中的鐵元素；另一種方式是產(chǎn)生鐵載體，通過鐵載體與宿主轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白競爭攝取鐵元素。本研究分離的ExPEC沒有溶血作用，這與周磊[1]分離到的54株豬源ExPEC沒有溶血作用一致。另外，Zhu 等[17]分離的豬源ExPEC大部分(92.3%)不溶血，只有一小部分(7.7%)產(chǎn)生β溶血；Costa 等[18]分離的豬源ExPEC同樣只有一小部分(4.9%)分離株產(chǎn)生β溶血，絕大部分(95.1%)的分離株不溶血；但王顯峰等[19]從有呼吸困難、流鼻涕癥狀的病羊鼻腔拭子中分離到的ExPEC有β溶血作用。這些結(jié)果說明雖然溶血作用可產(chǎn)生充足的鐵離子供ExPEC生長，但溶血作用并不是ExPEC致病作用所必需的。有溶血作用的ExPEC致病性也不一定強(qiáng)于沒有溶血作用的ExPEC。沒有溶血作用的ExPEC可以通過產(chǎn)生鐵載體從宿主獲得生長所需的鐵。大腸桿菌的鐵載體包括氣桿菌素和腸桿菌素兩種類型。不同于腸桿菌素，氣桿菌素能循環(huán)利用，因此其運(yùn)載鐵的效率更高，這一特點(diǎn)有利于增強(qiáng)ExPEC的致病力，促進(jìn)ExPEC的持續(xù)感染和在深部組織中的感染[20]。氣桿菌素由5個(gè)基因編碼，其中4個(gè)基因(iucA、iucB、iucC和iucD)參與氣桿菌素的合成，1個(gè)基因(iutA)編碼膜受體，它們均受一個(gè)操縱子控制[21]。本研究分離到的ExPEC攜帶有iutA基因和iucD基因，說明該菌能表達(dá)氣桿菌素作為鐵載體從宿主獲取鐵，從而佐證了該菌具有較強(qiáng)的致病力。

黏附是ExPEC感染的關(guān)鍵一步。ExPEC通過黏附素與組織上皮細(xì)胞結(jié)合，從而進(jìn)入腸外組織，并引起腸外組織感染。黏附素可以是菌毛，也可以是非菌毛。菌毛黏附素包括Ⅰ型菌毛(FimH)、S 菌毛(Sfa)等；非菌毛黏附素包括溫度敏感血凝素(tsh)、非菌毛黏附物質(zhì)(Afa)等[22-23]。afa基因編碼定植于上皮細(xì)胞(如尿道上皮和腸上皮細(xì)胞)的黏附蛋白，因此在引起尿道和腸道感染的致病性E.coli中廣泛存在。但在其他部位的ExPEC中afa基因表達(dá)并不普遍。例如，馬增軍等[24]從病豬肝、脾、肺、腎中分離到的8株ExPEC中均未檢出afa基因。郭強(qiáng)強(qiáng)等[25]從綿羊肺中分離的10株ExPEC中，僅有1株攜帶afa基因。本研究分離的ExPEC攜帶豐富的黏附相關(guān)基因，既包含I型菌毛基因(fimH)，也包含非菌毛黏附素基因(afa、tsh和gafD)。該菌攜帶如此多的黏附相關(guān)基因，可能與其定植在腸外組織發(fā)揮致病作用有密切關(guān)系。

該菌還表達(dá)外膜蛋白OmpA和TraT。OmpA普遍存在于革蘭氏陰性菌表面，發(fā)揮多種功能，如黏附、毒性、侵襲性和生物膜形成[26]。TraT是一種菌體外膜脂蛋白，與菌體的補(bǔ)體抗性和致病力關(guān)系密切[27]。該菌同時(shí)具有這兩種外膜蛋白，可能與其較強(qiáng)的致病力有一定關(guān)系。

本研究共檢測ExPEC 32種毒力基因，結(jié)果檢測到分離菌攜帶8種毒力基因(iutA、afa、tsh、ompA、fimH、gafD、iucD、traT)。Johnson等[28-29]認(rèn)為ExPEC中5個(gè)毒力標(biāo)記基因(PapA/Papc，sfa/foc，afa/dra，iutA和 kpsMTⅡ)中至少存在2個(gè)，即可認(rèn)定為ExPEC。因此，根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，本研究中分離到的大腸桿菌可被認(rèn)定為ExPEC。并且，該菌具有多種類型的毒力因子，致使其具有較強(qiáng)的致病性。

4 結(jié) 論

本研究從安徽金豐源畜牧科技有限公司動(dòng)物疾病診斷實(shí)驗(yàn)室接診的某山羊養(yǎng)殖場的病羊肺臟組織中分離并鑒定了1株ExPEC，該菌屬于B1群，沒有溶血作用，對小鼠的致死率為80%，攜帶8個(gè)毒力基因(iutA、afa、tsh、ompA、fimH、gafD、iucD、traT)。該菌對頭孢曲松、恩諾沙星、阿米卡星和氟苯尼考表現(xiàn)中度敏感，對其他9種抗菌藥耐藥。對發(fā)病山羊肌注頭孢噻呋鈉，同時(shí)使用麻杏石甘散拌料飼喂，用藥后病情得到有效控制。本研究結(jié)果可為臨床診斷和治療山羊ExPEC引起的肺炎提供參考。