油菜(Brassica napus)β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因 BnIRX14克隆、序列分析及亞細(xì)胞定位

董 云，吳旺澤，靳豐蔚，方 彥，劉婷婷，王 毅，徐一涌，楊曉明

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，蘭州 730070；2.西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，省部共建干旱生境作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferase，GTs)廣泛存在于原核生物、真核生物、古細(xì)菌及病毒中，具有催化蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、激素、黃酮等物質(zhì)進(jìn)行糖基化的功能。通過糖基化反應(yīng)能使特定的糖基集團(tuán)從一些供體轉(zhuǎn)移到靶受體形成糖苷等次生代謝物[1-3]。另外，糖基轉(zhuǎn)移酶還能催化各類糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N受體分子，改變受體分子的穩(wěn)定性，水溶性以及受體分子的生物活性和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而介導(dǎo)植物生長發(fā)育、次生物質(zhì)代謝、生物及非生物脅迫響應(yīng)[4-7]。在植物體內(nèi)，免疫相關(guān)復(fù)合物如水楊酸、酚類化合物、硫配糖體等三萜類化合物合成的最后修飾步驟就是糖基化過程[8]。通過全基因組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)真核生物基因組里大概有1%的基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶。

目前，根據(jù)GT序列的相似度以及催化底物的特異性和催化產(chǎn)物的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫CAZy(carbohydrate-active enzyme database)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)114個糖基轉(zhuǎn)移酶家族(GT1～GT114)，其中GT1家族包含最多的家族成員[9]。NDP-戊糖和NDP-己糖是糖基轉(zhuǎn)移酶GT1家族大多成員的反應(yīng)底物，其中UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是催化UDP-糖的糖基轉(zhuǎn)移酶。在模式植物擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)350多個糖基轉(zhuǎn)移酶基因[10]，在蕓薹屬物種甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)(Brassicaoleracea)和白菜(Brassicarapa)中已經(jīng)分別鑒定251、154、140個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因[11]，這些糖基轉(zhuǎn)移酶主要參與次生代謝物質(zhì)的合成、生物和非生物脅迫[12]。例如UGT73B3和UGT73B5在擬南芥中通過關(guān)聯(lián)茉莉酸和水楊酸來響應(yīng)假單胞菌侵染[13]，擬南芥UGT85U1/2和UGT85V1能通過改變吲哚衍生物參與鹽與活性氧脅迫抗性[14]。UGT84F1被發(fā)現(xiàn)在甘藍(lán)型油菜中通過抑制芥子酸來響應(yīng)非生物脅迫[15]。蔡明亮等[16]從貴州地方稻種平塘黑糯(O.sativassp.japonica)低溫轉(zhuǎn)錄組文庫中，篩選到一個響應(yīng)低溫的糖基轉(zhuǎn)移酶基因OsCUGT1，初步的表達(dá)分析認(rèn)為該基因能被低溫誘導(dǎo)，與日本晴(O.sativassp.nipponbare)栽培種相比，OsCUGT1序列具有豐富的SNP多態(tài)性。中藥材植物中，像黃酮類化合物、咖啡酸及其衍生物等次生代謝物，對藥性及藥材道地性極其重要，在這些次生代謝物的合成過程中，糖基轉(zhuǎn)移酶具有重要的作用[17]。例如在新疆紫草咖啡酸及其衍生物合成過程中，UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glycosyltransferases，UGTs)調(diào)節(jié)的苯丙烷途徑發(fā)揮了重要作用[18]。黃酮類化合物是三七重要的藥性成分，重組蛋白試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三七糖基轉(zhuǎn)移酶PnUGT82在體外能催化黃酮7-O糖苷化產(chǎn)物的合成[19]。這些證據(jù)充分證明，糖基轉(zhuǎn)移酶在植物生長發(fā)育，尤其是生物、非生物脅迫中具有重要功能。因此深入了解油菜中糖基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能，通過遺傳學(xué)和生物技術(shù)等手段提高油菜品質(zhì)和逆境抗性具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

油菜是中國重要的油料作物之一，同時也是發(fā)展生物能源的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)作物[20]。油菜生長發(fā)育過程中經(jīng)常受到高溫、干旱、凍害、病害、蟲害等逆境的影響，造成油菜產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降[21-22]。鑒定，挖掘抗逆相關(guān)的基因和QTL(quantitative trait locus，QTL),是分子標(biāo)記輔助選育高抗油菜新品種的先決條件。但與傳統(tǒng)模式植物擬南芥和水稻等相比，在油菜中與品質(zhì)和抗逆相關(guān)的基因功能研究相對落后。本研究利用 5′RACE和3′RACE技術(shù)從甘藍(lán)型油菜(BrasssicanapusL.)中擴(kuò)增了β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因IRX14(IrregularX-ylem14)的5′端和3′端序列，拼接后獲得該基因的全長cDNA序列(NCBI登記號KP100641，命名為BnIRX14)，對其全序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過構(gòu)建融合表達(dá)載體pCAMBIA-1300-IRX14-GFP，利用煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行BiFC亞細(xì)胞定位，為將來進(jìn)一步研究β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因BnIRX14在油菜次生物質(zhì)代謝及逆境響應(yīng)中的生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 參試油菜為甘藍(lán)型(BrassicanapusL.)栽培品種‘Westar’，煙草為本氏煙草(Nicotianabenthamiana)。

1.1.2 菌株和載體 農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞DH5α、植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GFP、克隆載體pMD18-T Cloning Vector購自陜西博瑞德生物科技公司。

1.1.3 酶、試劑盒和主要的化學(xué)試劑 PCR聚合酶KOD FX Neo、膠回收試劑盒(OMEGA)、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ、XbaⅠ,T4DNA Ligase購自陜西博瑞德生物科技公司; 5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0試劑盒和Trizol均購自Invitrogen公司；SMARTerRMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒購自Clontech公司。

1.2 方 法

1.2.1 油菜總RNA的提取 油菜總RNA采用Trizol法提取，提取方法參考其說明書。

1.2.2 油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因BnIRX14克隆 根據(jù)NCBI中已登記的甘藍(lán)型油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因保守區(qū)序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AJ971041.1)，設(shè)計(jì) 5′RACE和3′RACE引物，引物由上海生物工程公司合成，相關(guān)引物序列見表1。以總RNA為模板，使用5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0試劑盒和SMARTer′ RACE cDNA Amplification Kit試劑盒分別進(jìn)行5′端序列和3′端序列擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄及RACE擴(kuò)增均參照試劑盒說明進(jìn)行。將5′RACE和3′RACE第2輪PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳，對目的片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化[23]，挑取陽性克隆送上海生物工程公司測序。利用VectorNTI軟件拼接5′RACE和3′RACE擴(kuò)增獲得的5′端、3′端片段序列和原來的保守區(qū)序列。

表1 5′ RACE和3′ RACE引物序列

1.2.3 油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因BnIRX14生物信息學(xué)分析 利用ExPASy Proteomics Sever(http://expasy.org/)預(yù)測 BnIRX14氨基酸序列分子量和等電點(diǎn)[24]。利用NCBI中的Concserved Domain,NetNGlyc 1.0 Server,NetPhos 3.1 Server,SignalP-5.0 Server,TMHMM Server v.2.0,SWISS-MODEL,STRING分別進(jìn)行BnIRX14蛋白保守性、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、蛋白信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)和互作蛋白的預(yù)測；利用DNAMAN軟件同源比對蕓薹屬物種IRX14氨基酸序列。

1.2.4 油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因BnIRX14融合表達(dá)載體構(gòu)建 通過Vector NTI軟件查找拼接后基因全長的開放閱讀框，在起始密碼子和終止密碼子附近設(shè)計(jì)開放閱讀框的上下游引物P485F、P485R。因克隆的基因序列較長，為保證克隆的片段無突變，在序列中間設(shè)計(jì)引物P485MR、P485MF，分別與上下游引物配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表2。PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 1 μL，KOD FX Neo(1U/μL)1 μL，2× PCR Buffer for KOD FX Neo 25 μL，5′ primer(10 μmol/L)2 μL，3′ primer(10 μmol/L)2 μL，dNTP(2 mmol/L)10 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min；循環(huán)為98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min 30 s，共30個循環(huán)；68 ℃延伸5 min。參照膠回收試劑盒(OMEGA)、克隆載體pMD18-T的使用說明書回收目的片段，并分別與pMD18-T載體連接。按照董云等[25]的方法進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提，使用KpnⅠ和HindⅢ，HindⅢ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切體系：10×BamHⅠ Buffer 4 μL，質(zhì)粒DNA 2 μL，KpnⅠ或XbaⅠ(10 U/μL)1 μL，HindⅢ(10 U/μL)1 μL，ddH2O 12 μL。分別用KpnⅠ和HindⅢ，HindⅢ和XbaⅠ，KpnⅠ和XbaⅠ將鑒定正確的重組質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行膠回收及純化(方法同前)。對膠回收的目的基因兩個片段及載體pCAMBIA1300-GFP大片段進(jìn)行體外連接(圖1)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含Kan的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；再將轉(zhuǎn)化出來的單菌落通過搖菌后用485MF/485R進(jìn)行菌液PCR鑒定，PCR鑒定正確的菌液送測序并保存菌液。

表2 克隆的相關(guān)引物序列

圖1 融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-IRX14-GFP構(gòu)建

1.2.5 油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶BnIRX14亞細(xì)胞定位

參照郝麗芬等[26]的方法，構(gòu)建的融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-IRX14-GFP導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，并瞬時轉(zhuǎn)染本氏煙草葉片，侵染2～3 d后切取侵染區(qū)域，在FV10-ASW激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS)觀察亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因 BnIRX14 克隆

根據(jù)NCBI中已登記的甘藍(lán)型油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因AJ971041.1保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)5′RACE引物和3′RACE引物，使用5′RACE和3′RACE試劑盒分別擴(kuò)增獲得223 bp和781 bp的β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因BnIRX145′端片段(圖2-A)和3′端片段(圖2-B)。對β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因BnIRX145′ 端和3′ 端的目的條帶分別進(jìn)行切膠回收、純化，純化后的PCR產(chǎn)物分別與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取陽性克隆測序，測序結(jié)果見圖2-C和2-D。測序正確后，利用 VectorNTI 軟件將克隆獲得的BnIRX14基因 5′ 端序列和3′ 端序列與保守區(qū)序列拼接，拼接后測序表明，油菜BnIRX14含有 1 566 bp 的完整開放閱讀框，編碼522個氨基酸，該基因命名為BnIRX14(NCBI登記號KP100641)。

A.5′端擴(kuò)增片段；B.3′端擴(kuò)增片段；C.5′端測序結(jié)果；D.3′端測序結(jié)果

2.2 油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因 IRX14生物信息學(xué)分析

利用測序氨基酸序列，同源比對蕓薹屬基因IRX14編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)與甘藍(lán)型油菜(BnaA07T0142000ZS)、白菜(Bra012145)、芥菜型油菜(BjuA011746)、甘藍(lán)(BolC07g023520.2J)和黑芥(BniB06g014750.2N)IRX14具有高度的相似性，相似性分別為 82.57%、81.78%、81.34%、72.25% 和 75.61%，與同科的擬南芥IRX14相似性為 74%。保守域結(jié)構(gòu)比對發(fā)現(xiàn)，油菜BnIRX14具有 GTs 家族保守的 DxD 保守結(jié)構(gòu)域(x表示除脯氨酸以外的任何氨基酸，或者沒有x)。BnIRX14還存在 UGT 糖基轉(zhuǎn)移酶一段由 44個 氨基酸組成的 PSPG(plant secondary product glycosyltransferase box)保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。在 ExPASy 預(yù)測，BnIRX14分子質(zhì)量約 58.92 ku，由 8 315 個原子組成，分子式為 C2631H4168N742O753S21。正電荷殘基總數(shù)(精氨酸,賴氨酸)為 68，負(fù)電荷殘基總數(shù)(天冬氨酸,谷氨酸)為 53。脂肪指數(shù)為 31.14，親水性為-0.360，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為53.98，因此推測該蛋白屬于不穩(wěn)定親水蛋白，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GT43家族成員(圖4-A)。

利用 Net NGlyc 1.0 Server 和 NetPhos 3.1 Server 預(yù)測油菜BnIRX14糖基化和磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，BnIRX14蛋白中存在3個糖基化位點(diǎn)(96、192和314)(圖4-B)，多個磷酸化位點(diǎn)，從多到少依次為絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸，也存在糖原合成酶激酶3(GSK3)、細(xì)胞分裂周期激酶2(CDC2)、蛋白激酶(PKC)、絡(luò)蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)、蛋白激酶A(PKA)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)等多種特異性蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)(圖4-C)，跨膜域預(yù)測表明，BnIRX14具有一個單次跨膜區(qū)，為膜蛋白(圖4-D)，不存在信號肽，屬非分泌性蛋白(圖4-E)。對 BnIRX14 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋結(jié)構(gòu)(α-Helix)占29.17%，β片層(β-strand)占 5.95%，無規(guī)則卷曲(Randomcoil)占46.45%，延伸鏈占 18.43%。蛋白三級結(jié)構(gòu)源建模使用的模板為人類 β-1,1-葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶，其同源性為 29.09%(圖5-A)。以白菜基蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫作為參考，預(yù)測分析 BnIRX14 蛋白與其他蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn) BnIRX14 與白菜 Bra019618.1(擬南芥GUT1同源基因，催化葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶)互作分?jǐn)?shù)最高為 0.997；其次與白菜Bra039502.1(蔗糖裂解酶，為各種代謝提供UDP-葡萄糖和果糖)互作，參與生物催化反應(yīng)；與 Bra037432.1,Bra036282.1 和 Bra006644.1等互作分?jǐn)?shù)都達(dá)到 0.875 以上。這些預(yù)測的互作蛋白都與各類糖合成和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。同源比對和互作分析初步表明 BnIRX14 可能參與木糖的合成代謝過程(圖5-B)。

2.3 油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因 BrIRX14融合表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)BnIRX14基因拼接序列設(shè)計(jì)的上下游引物P485F、P485R與序列中間設(shè)計(jì)的引物P485MR、P485MF分別配對，以油菜cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。P485F/P485MR和P485MF/P485RPCR產(chǎn)物分別為727 bp和853 bp(圖6-A)，膠回收PCR擴(kuò)增片段，分別與pMD18-T載體連接，經(jīng)菌液PCR檢測后選取陽性克隆，分別使用KpnⅠ和HindⅢ，HindⅢ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，切下的目的條帶分別為718 bp和845 bp(圖6-B)，送交測序驗(yàn)證。測序驗(yàn)證后用KpnⅠ和HindⅢ，HindⅢ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切測序質(zhì)粒載體，分別回收718 bp和845 bp的片段。同時用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒，膠回收、純化大片段，與回收的IRX14基因718 bp和845 bp的兩段雙酶切序列片段進(jìn)行體外連接，隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，用P485MF/P485R進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽性克隆測序驗(yàn)證正確(圖6-C)。

圖6 融合表達(dá)載體 pCAMBIA1300-IRX14-GFP構(gòu)建及陽性克隆PCR鑒定

2.4 油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶IRX14亞細(xì)胞 定位

將構(gòu)建的融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-IRX14-GFP和空載體pCAMBIA1300-GFP分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，將活化的農(nóng)桿菌注射煙草葉片，22 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)2 d后利用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的分布情況。由圖7可見，pCAMBIA1300-IRX14-GFP的熒光信號主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，而對照pCAMBIA1300-GFP在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均觀察到綠色熒光信號，BiFC結(jié)果表明β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶BnIRX14定位于細(xì)胞質(zhì)。

圖7 甘藍(lán)型油菜β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶BnIRX14亞細(xì)胞定位

3 討 論

干旱、鹽害、極端溫度、病蟲害等非生物和生物脅迫嚴(yán)重影響油菜生長發(fā)育和油菜品質(zhì)，提高油菜逆境抗性，保持穩(wěn)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)是當(dāng)前油菜生產(chǎn)亟待解決的問題。篩選、鑒定與油菜抗逆相關(guān)的基因和QTL，揭示其逆境響應(yīng)分子機(jī)制，對培育抗逆性油菜新品種具有重要的經(jīng)濟(jì)意義[27-28]。擬南芥IRX9(At2g37090)、I9H(At1g27600)、IRX14(At4g36890)、I14H(At5g67230)屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GT43家族成員，I9H和I14H在植物組織各器官均有表達(dá)，IRX9和IRX14主要在花序和莖中表達(dá)。IRX9和IRX14在擬南芥木糖合成中扮演著重要的角色，IRX9和IRX14功能缺失型突變體導(dǎo)致木糖含量降低，生長發(fā)育異常[29]。棉花中，GhGT43A1 和GhGT43C1 屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GT43家族蛋白，與擬南芥IRX9 和IRX14緊密相關(guān)，它們參與棉花纖維發(fā)育中木糖的合成，GhGT43A1主要在開花后15～20 d的棉纖維中高效表達(dá)，但是GhGT43C1卻在根莖葉等中廣譜表達(dá)[30]。這些結(jié)果表明，雖然糖基轉(zhuǎn)移酶GT43家族成員進(jìn)化高度保守，但也具有生物功能多樣性。糖基轉(zhuǎn)移酶不僅與植物逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)，同時還參與植物體內(nèi)防御復(fù)合物的糖基化修飾，改善其生物活性和溶解度來增強(qiáng)植物抗逆性，因此糖基轉(zhuǎn)移酶已成為近年的研究熱點(diǎn)。高世超等[31]、周佩娜等[32]分別從青花菜、霍山石斛中克隆得到β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因IRX9H、IRX9，生物信息學(xué)分析表明IRX9H、IRX9基因編碼蛋白均為無信號肽蛋白，并對β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因IRX9H研究表明在青花菜抗酸雨脅迫中發(fā)揮作用。

本研究通過同源搜索比較，利用RACE技術(shù)從甘藍(lán)型油菜中克隆到β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因BnIRX14(NCBI登記號KP100641)。BnIRX14基因具有1 566 bp的完整開放閱讀框，編碼522氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)無信號肽存在。保守域結(jié)構(gòu)預(yù)測，BnIRX14具有UGT糖基轉(zhuǎn)移酶PSPG保守結(jié)構(gòu)域，并具有GTs家族保守的DxD結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)含有GT-A折疊的GTs家族蛋白都存在DxD保守結(jié)構(gòu)域，是糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性的重要結(jié)構(gòu)域，二價陽離子可以與該結(jié)構(gòu)域配位，以穩(wěn)定結(jié)合核苷酸糖[33]。進(jìn)化樹統(tǒng)計(jì)分析，BnIRX14與十字花科蕓薹屬物種白菜、芥菜型油菜、甘藍(lán)和黑芥IRX14相似性達(dá)到72% 以上，說明本研究通過RACE技術(shù)克隆的甘藍(lán)型油菜BnIRX14屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GT43家族成員。擬南芥I9H(IRX9同源基因)和IR14H(IRX14同源基因)TMHMM預(yù)測具有單次跨膜結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建YFP標(biāo)簽的亞細(xì)胞準(zhǔn)確定位表明 I9H和IR14H定位在高爾基體中[29]；霍山石斛GT43家族成員IRX9 TMHMM預(yù)測也具有單次跨膜結(jié)構(gòu)域，PSORT的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)霍山石斛IRX9定位于微粒體分值最高[31]。BnIRX14 TMHMM預(yù)測也是單次跨膜蛋白，BnIRX14-GFP亞細(xì)胞定位表明，BnIRX14定位于細(xì)胞質(zhì)中，但目前的BiFC試驗(yàn)還不能準(zhǔn)確確定BnIRX14是否也定位于高爾基體中，后期需要通過細(xì)胞器特異熒光染料來確定BnIRX14的準(zhǔn)確定位。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測，BnIRX14具有單次跨膜結(jié)構(gòu)域，該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[33]。糖基化和磷酸化位點(diǎn)是糖基轉(zhuǎn)移酶生物學(xué)功能的重要催化活性位點(diǎn)，BnIRX14預(yù)測也發(fā)現(xiàn)多個糖基化和磷酸化位點(diǎn)，可能與其他催化葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的蛋白相互作用調(diào)控木糖的合成，從而來調(diào)節(jié)生長發(fā)育和逆境響應(yīng)。具體BnIRX14如何參與油菜的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)還需要深入的試驗(yàn)來證實(shí)。目前，通過RACE從油菜中克隆到情況BnIRX14，為深入研究BnIRX14的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，為將來通過生物技術(shù)手段培育高抗的油菜品種提供理論和技術(shù)支持。

4 結(jié) 論

本研究利用5′RACE與3′RACE方法從甘藍(lán)型油菜中擴(kuò)增獲得β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因BnIRX14，該基因cDNA全長1 566 bp，編碼522個氨基酸，具有多個糖基化和磷酸化位點(diǎn)。初步的BiFC結(jié)果表明BnIRX14定位在細(xì)胞質(zhì)中，BnIRX14具有GTs家族基因典型的DxD特征結(jié)構(gòu)域，屬于油菜GT43糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員。