黑菊芋低聚糖對(duì)高脂血癥小鼠的降血脂作用

姬妍茹，楊慶麗，張正海，董 艷，石 杰，李國(guó)巍，魏連會(huì)，潘 靜，高 媛

（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319）

高脂血癥是導(dǎo)致心腦血管疾病的元兇，全球每年因心腦血管疾病死亡的人數(shù)有1700萬(wàn)，約占總死亡人數(shù)的29%[1]，且有逐年上升的趨勢(shì)，2017年中國(guó)城市和農(nóng)村居民腦血管病死亡率分別為126.58/10萬(wàn)和157.48/10萬(wàn)，分別位居城市和農(nóng)村死因的第3位和第1位[2]。藥物治療是高血脂癥主要的治療手段，但是藥物治療存在副作用大，停藥后癥狀易反彈的缺點(diǎn)，尋求高效安全的功能食品來(lái)輔助高脂血癥的治療以預(yù)防心血管疾病的發(fā)生已經(jīng)成為保健食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。

菊芋（Jerusalem artichoke）是菊科向日葵屬草本植物，塊莖中富含菊粉，約占其干重的50%～75%[4]。菊粉是聚合度2～60的天然果聚糖混合物[5]，是一種水溶性膳食纖維，具有雙向調(diào)節(jié)血糖，控制血脂，促進(jìn)礦物質(zhì)吸收，改善腸道和防治便秘等功能[6]，2009年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品[7]。研究表明，短鏈菊粉可有效減少肥胖小鼠肝臟脂肪堆積，增加益生菌群占比，緩解小鼠肥胖[8]；菊粉低聚糖具有良好的抗氧化活性，可有效減輕高脂血癥引發(fā)的血管內(nèi)皮損傷，降低高脂血癥小鼠血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量，并上調(diào)高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平[9]。

黑菊芋是以菊芋為原料采用變溫熟成工藝加工而成的一種新型功能食品，與菊芋相比，水分含量更低，酸度和甜度較高，口感由脆硬變得酸甜軟彈[10]。其中菊粉分解為單糖、雙糖和低聚果糖等小分子糖類(lèi)[10]，低聚果糖具有“膳食纖維”和“益生元”的雙重屬性，具有抗氧化、降血脂、降糖、調(diào)節(jié)腸道菌群[11-13]、抑制體重增加和脂肪儲(chǔ)存等功效[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，飼喂低聚果糖可恢復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)所致脂質(zhì)代謝紊亂小鼠和高蔗糖飲食小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平，顯著調(diào)節(jié)肥胖小鼠血清中LDLC和HDL-C水平，有效減少肝臟脂滴量[18]。

眾多研究成果表明低聚果糖具有降血脂功效，但在降脂的指標(biāo)方面有所差異，而且降血脂機(jī)制尚不明晰。本研究以C57BL/6小鼠建立混合型高脂血癥動(dòng)物模型，研究黑菊芋低聚糖對(duì)小鼠不同血脂指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用，檢測(cè)SREBP-1c和PPAR-γ在小鼠肝臟組織中的表達(dá)量，初步揭示黑菊芋低聚糖的降血脂機(jī)制，為黑菊芋的保健功效提供理論依據(jù)，為深度開(kāi)發(fā)黑菊芋產(chǎn)品提供科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑菊芋 以“慶芋2號(hào)”菊芋品種為原料，按照實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)明的工藝制備[19]，為黑色質(zhì)軟塊狀物，無(wú)特殊氣味；SPF級(jí)雄性健康C57BL/6小鼠 48只，5～6周齡，體重18～22 g，長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK-（吉）2020-0002；小鼠基礎(chǔ)飼料和高脂飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司，高脂飼料配方（基礎(chǔ)飼料中添加20.0%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉）；阿托伐他汀 北京嘉林藥業(yè)股份有限公司；血脂水平檢測(cè)試劑盒、抗氧化指標(biāo)檢測(cè)試劑盒 南京建成生物科技有限公司；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）、RT-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 日本TaKaRa公司。

3BT9610 PCR儀 美國(guó)Select CyclerⅡ公司；CFX96 Real time PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；5200自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng) 上海Tanon科技有限公司；TANKPE0600純水系統(tǒng) 美國(guó)MILLIPORE公司；VFD-4500型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋天津市歐諾儀器表有限公司；SORVALL ST8/8R低溫離心機(jī)、MULTISKAN FC酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑菊芋低聚糖的制備 參照文獻(xiàn)[20]提取和純化粗多糖，然后以300 Da透析膜透析除去單糖，再以1000 Da的透析膜獲得分子量在300～1000 Da之間的低聚糖溶液，凍干得黑菊芋低聚糖，低聚糖純度為85.50%。

1.2.2 動(dòng)物飼養(yǎng) 參照國(guó)食藥監(jiān)?；痆2012]107號(hào)文件附件中的輔助降血脂功能評(píng)價(jià)法，建立高脂血癥模型，實(shí)驗(yàn)在東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開(kāi)展，飼養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境條件為溫度20～22 ℃，相對(duì)濕度28%～50%，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，給予普通飼料，自由取食飲水。第8 d隨機(jī)分成高脂飼料組（40只）和空白組（8只），高脂飼料組給予高脂飼料，空白組給予普通飼料，第35 d，取血檢測(cè)血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量，判斷模型建立成功，然后將小鼠分為6組，原空白組轉(zhuǎn)為空白對(duì)照組（CK），原高脂飼料組小鼠隨機(jī)分為5組：模型對(duì)照組（MC）、陽(yáng)性對(duì)照組（AC）、黑菊芋低聚糖低劑量組（OSL）、黑菊芋低聚糖中劑量組（OSM）和黑菊芋低聚糖高劑量組（OSH），每組8只，每只小鼠灌胃量為0.2 mL/d，每天灌胃1次，灌胃46 d。CK和MC組給予生理鹽水；AC組給予阿托伐他汀1.0 mg/（kg·bw）；黑菊芋低聚糖各組分別灌胃0.25、1.25、2.50 g/（kg·bw）的黑菊芋低聚糖溶液。CK組飼喂正常飼料，其余各組飼喂高脂飼料，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)周期82 d，期間，7、21、35、49、63和82 d檢測(cè)小鼠體質(zhì)量。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 樣本的采集 藥物干預(yù)結(jié)束后，小鼠禁食12 h，稱(chēng)量體重，取血于無(wú)酶管中，室溫靜置2 h，5000 r/min離心10 min，取血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。解剖取肝臟，液氮迅速冷凍，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 血清指標(biāo)的檢測(cè) 按照不同試劑盒的要求檢測(cè)小鼠血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、GSH-Px、MDA含量，每個(gè)樣本設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.3.3 HE染色觀(guān)察高脂血癥小鼠肝臟組織形態(tài)變化 取1 cm3大小的肝臟組織，10%甲醛固定，酒精脫水，石臘包埋，制成病理切片，HE染色[9]。具體步驟按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.2.3.4 相關(guān)蛋白檢測(cè) 取20 mg左右肝臟組織，加入Complete RIPA buffer，冰上靜置20 min，加入RIPA預(yù)冷浸泡小鋼珠，冰凍研磨機(jī)震蕩1 min，提取肝臟蛋白，具體操作參照文獻(xiàn)[8]，然后將β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算SREBP-1c和PPAR-γ蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS v7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間差異顯著性分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA），同時(shí)進(jìn)行Turkey事后檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示，認(rèn)為P＜0.05時(shí)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑菊芋低聚糖干預(yù)對(duì)小鼠體質(zhì)量變化的影響

從表1可以看出，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組小鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，35 d造模成功時(shí)，高脂飼料組小鼠體質(zhì)量顯著高于CK組（P＜0.05）。飼喂結(jié)束時(shí)，各組小鼠體質(zhì)量仍極顯著高于CK組（P＜0.01），與MC組相比，各處理組小鼠體質(zhì)量差異均不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明飼喂高脂飼料可增加小鼠體質(zhì)量，灌胃黑菊芋低聚糖不能顯著抑制體質(zhì)量增長(zhǎng)，但也不會(huì)使小鼠進(jìn)一步肥胖。

表1 各組小鼠試驗(yàn)過(guò)程中體質(zhì)量變化情況Table 1 Body weight changes in each group mice during the experiment

2.2 黑菊芋低聚糖干預(yù)對(duì)高脂血癥小鼠血脂水平的影響

從表2可以看出，MC組小鼠血清中TG、TC、LDL-C含量極顯著高于CK組（P＜0.01），HDL-C含量極顯著低于CK組（P＜0.01），說(shuō)明已成功建立混合型高脂血癥模型。黑菊芋低聚糖各組小鼠血清中HDL-C水平顯著高于MC組（P＜0.01或P＜0.05），TG、TC和LDL-C水平均低于MC組，中高劑量組小鼠TG和LDL-C的降低水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TG水平甚至低于AC組。中高劑量組小鼠的TG水平與CK組無(wú)顯著差異（P＞0.05），TC、LDL-C和HDL-C水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。

表2 不同組別小鼠血脂水平Table 2 Blood lipid levels in different groups mice

適量黑菊芋低聚糖干預(yù)可顯著降低高脂血癥小鼠的TG值，使之接近正常水平；可降低LDL-C值，但仍高于正常水平；HDL-C值顯著高于MC組且超過(guò)CK組水平，HDL-C主要在肝臟合成，是一種抗動(dòng)脈粥樣硬化的脂蛋白，臨床醫(yī)學(xué)認(rèn)為其含量與患心血管病的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[20]，是公認(rèn)的指標(biāo)升高對(duì)人體有益的脂蛋白。胡彩紅[21]研究表明，HDL-C水平小于30 mg/dL組人群全因死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯高于參照組，大于80 mg/dL組人群全因死亡風(fēng)險(xiǎn)與參照組無(wú)顯著性差異，作者認(rèn)為，該研究結(jié)果不支持HDL-C水平越高越好的假設(shè)，高水平HDL-C可能增加全因死亡的風(fēng)險(xiǎn)并且對(duì)心血管疾病死亡無(wú)保護(hù)作用，但是關(guān)于HDL-C偏高的程度沒(méi)有具體給出。本研究中黑菊芋低聚糖中高劑量組小鼠外觀(guān)和行為未出現(xiàn)異常，且肝臟內(nèi)脂滴量較MC組明顯減少，接近或達(dá)到CK組水平，說(shuō)明小鼠血清中此濃度水平的HDLC對(duì)改善高脂血癥是有利的。

2.3 黑菊芋低聚糖干預(yù)對(duì)高脂血癥小鼠氧化應(yīng)激水平的影響

從表3可看出，與CK組相比，MC組小鼠血清中的丙二醛（MDA）水平極顯著升高（P＜0.01），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力極顯著降低（P＜0.01），黑菊芋低聚糖中、高劑量組的MDA水平極顯著升高（P＜0.01），SOD酶活力無(wú)顯著差異（P＞0.05）；OSM組的GSH-Px酶活力顯著低于CK組（P＜0.05），OSH組的GSH-Px酶活力與CK組差異不顯著（P＞0.05）。與MC組相比，中、高劑量的黑菊芋低聚糖組小鼠的MDA水平極顯著降低（P＜0.01），SOD、GSH-Px水平極顯著升高（P＜0.01）?？梢?jiàn)，適量黑菊芋低聚糖對(duì)由高脂飲食引起的氧化應(yīng)激具有一定抑制作用，能夠提高高脂血癥小鼠血清中SOD和GSH-Px酶的活力，使之恢復(fù)接近CK組水平；可降低MDA含量，但與CK組相比仍有一定差距。

表3 不同組別小鼠抗氧化指標(biāo)水平Table 3 Levels of antioxidant indexes in different groups of mice

2.4 黑菊芋低聚糖干預(yù)對(duì)高脂血癥小鼠肝組織病理變化的影響

從圖1可以看出，CK組小鼠肝臟細(xì)胞排列整齊、規(guī)律，結(jié)構(gòu)正常，胞漿無(wú)脂肪滴；MC組肝臟細(xì)胞狀態(tài)異常，胞漿中出現(xiàn)大量脂滴；中、高劑量的黑菊芋低聚糖對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用，肝臟內(nèi)脂肪滴數(shù)量明顯下降，細(xì)胞排列相對(duì)整齊，以高劑量組（OSH）肝組織狀態(tài)最好，未見(jiàn)明顯脂肪變性肝細(xì)胞，效果接近AC組。

圖1 不同組別小鼠肝臟組織病理變化Fig.1 Pathological changes of liver tissue in different groups mice

2.5 黑菊芋低聚糖干預(yù)對(duì)高脂血癥小鼠肝組織相關(guān)蛋白的影響

從圖2可知，與CK組相比，MC組小鼠肝組織中SREBP-1c的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），PPAR-γ的表達(dá)略有下調(diào)，但不具有顯著性差異（P＞0.05）。與MC組相比，黑菊芋低聚糖各組SREBP-1c的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；PPAR-γ的表達(dá)略有上調(diào)，但不具有顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠SREBP-1c和PPAR-γ蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative protein expression of SREBP-1c and PPAR-γ in each group mice

3 討論與結(jié)論

黑菊芋中富含低聚糖，占其總糖含量的46.64%，主要以低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖）的形式存在[22]。有研究表明，添加低聚果糖可減少高糖膳食誘導(dǎo)的高血壓模型大鼠的內(nèi)臟脂肪聚積，降低血壓，調(diào)節(jié)其血脂水平[23]，降低高脂飲食大鼠的體脂[24]，降低高脂血癥小鼠體重和血清中TC、TG和LDL-C水平[9]。本研究中，1.25和2.5 g/kg·bw黑菊芋低聚糖能夠顯著提高高脂血癥小鼠的HDL-C水平（P＜0.05），降低TG和LDL-C水平（P＜0.05），這與上述文獻(xiàn)[9]的研究結(jié)果一致，不同的是，黑菊芋低聚糖干預(yù)不能顯著降低高脂飲食小鼠的體重和TC水平，推測(cè)可能與低聚糖的各組分含量及干預(yù)量有關(guān)。

氧化應(yīng)激是活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）家族在細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過(guò)程，與高脂血癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[25]。研究表明，高脂血癥會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性降低，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)[26]，本實(shí)驗(yàn)中MC組小鼠血清中SOD和GSH-Px酶活性顯著降低對(duì)此予以證實(shí)。SOD對(duì)機(jī)體的氧化-抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，其活性的高低可間接反映機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力[27]。GSH-Px特異性催化還原型谷胱甘肽對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[28]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，能引起細(xì)胞損傷，測(cè)定其含量可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化以及細(xì)胞受損程度[29]。黑菊芋低聚糖干預(yù)后，高脂血癥小鼠的SOD、GSH-Px水平（P＜0.01）極顯著升高，MDA水平極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明適量黑菊芋低聚糖干預(yù)有助于抑制小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)。

關(guān)于低聚果糖的降脂機(jī)制尚不清晰，王宇[30]推測(cè)低聚果糖可吸附腸道內(nèi)的油脂、膽固醇及膽酸鈉，促進(jìn)脂質(zhì)排除。研究人員[31-33]證實(shí)，低聚果糖通過(guò)顯著上調(diào)肥胖小鼠和大鼠胰高血糖素樣肽-1（Glucagon like peptide-1，GLP-1）、胰高血糖素樣肽-2（Glucagon like peptide-2，GLP-2）、瘦素（Leptin），下調(diào)胃饑餓素（Ghrelin）水平，來(lái)降低血清中的甘油三酯和膽固醇[34]。為了探索黑菊芋低聚糖的降脂機(jī)制，本研究檢測(cè)了脂質(zhì)代謝相關(guān)基因SREBP-1c和PPAR-γ在高脂血癥小鼠肝臟內(nèi)的表達(dá)量。SREBP-1c與高脂血癥的發(fā)展關(guān)系最為緊密，其在肝臟中表達(dá)豐富，主要激活脂肪酸和甘油三酯的轉(zhuǎn)錄合成，進(jìn)行脂代謝調(diào)節(jié)[35]。PPAR-γ是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，是加強(qiáng)脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存脂肪的中央調(diào)節(jié)器，在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)儲(chǔ)存中起重要作用，其低表達(dá)與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)[36]。本研究表明，黑菊芋低聚糖可以顯著下調(diào)高脂血癥小鼠肝臟中SREBP-1c的表達(dá)，降低血清中TG的含量，但是沒(méi)有顯著上調(diào)PPAR-γ的表達(dá)量，說(shuō)明黑菊芋低聚糖的干預(yù)可以抑制TG的轉(zhuǎn)錄合成，但不能顯著抑制脂質(zhì)的儲(chǔ)存，這與藥物干預(yù)后高脂血癥小鼠體質(zhì)量無(wú)顯著降低的結(jié)果是契合的。

綜上所述，黑菊芋低聚糖具有改善高脂血癥小鼠血脂水平的功效。黑菊芋低聚糖降脂作用機(jī)制與抗氧化應(yīng)激及抑制SREBP-1c因子的表達(dá)密切相關(guān)。本研究為黑菊芋的降血脂功效提供了有力的理論佐證。