抗氧化乳酸菌的篩選及其對小腸上皮細胞氧化損傷的保護作用

王小鵬，崔文明，王子卓越，楊文月，黃宇琪，李靜蕊，陳水燕，郭培培，趙改名, ，閆 爽,

（1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學機電工程學院，河南鄭州 450002；3.河南花花牛乳業(yè)集團股份有限公司乳工程研究院，河南鄭州 450064）

正常代謝產(chǎn)生的適量活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）發(fā)揮著細胞內(nèi)信息傳遞、生化反應調(diào)節(jié)等重要作用[1]，但衰老、虛弱、肥胖等生理病理因素都會加速體內(nèi)ROS的產(chǎn)生[2]，過量的ROS會破壞機體氧化和抗氧化平衡，造成氧化應激，損傷生物體的蛋白質(zhì)、脂類及核酸等成分，引發(fā)高血壓、糖尿病、動脈粥狀硬化等疾病[3-4]。生物體具有抗氧化酶類和非酶分子組成的防御修復系統(tǒng)，如細胞可產(chǎn)生超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）來抵御ROS的損傷[5]。然而，當體內(nèi)ROS積累過高時，內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)無法消除活性氧自由基對人體的傷害，補充外源性抗氧化劑成為應對氧化應激的有效方式。正丁基羥基茴香醚和正丁基羥基甲苯等合成抗氧化劑能夠有效減輕氧化損傷，但由于對肝臟有損害并存在致癌風險，其安全性受到質(zhì)疑[6]。

乳酸菌具有抗氧化特性，能夠減輕氧化應激對生物體的影響[7]。Song等[8]從泡菜中分離到一株短乳桿菌B13-2，其具有較高的DPPH和ABTS+自由基清除能力以及脂質(zhì)過氧化抑制活性，經(jīng)85 ℃、30 min熱處理后，菌體仍具有抗氧化活性。Zhang等[9]研究了植物乳桿菌J26發(fā)酵對藍莓汁抗氧化能力的影響，結(jié)果表明發(fā)酵藍莓汁的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力顯著增強，與抗氧化性密切相關的酚類物質(zhì)、花色苷含量明顯升高。動物實驗和臨床研究也表明，乳酸菌能夠緩解生物體的氧化應激狀態(tài)，乳雙歧桿菌HN019能夠改善健康個體和代謝綜合征患者的炎癥和氧化應激指標，且對健康受試者顯示出特定的抗氧化防御作用[10]。乳酸菌作為生物抗氧化劑，正在受到更多的研究和關注。

基于產(chǎn)業(yè)需求，眾多研究關注了抗氧化乳酸菌的篩選和體外抗氧化指標測定[6,11]，乳酸菌對正常腸道細胞氧化損傷的修復作用及細胞中抗氧化酶活性的影響還鮮見報道。目前，不良飲食習慣、焦慮等社會環(huán)境因素對人們腸道健康造成極大影響，其中氧化損傷是重要方面。小腸黏膜上皮細胞（IEC-6）保留了小腸上皮干細胞未分化的特性，在組織學和免疫學方面與增殖性隱窩細胞無明顯差別，而且在合適條件下，能分化為成熟的腸細胞，是研究外源性物質(zhì)對小腸作用效果的良好模型[12]。相對于HT-29和Caco-2等結(jié)腸癌細胞系，IEC-6細胞更適合研究乳酸菌菌株對小腸功能的影響作用。

本研究通過體外抗氧化實驗，從長壽老人腸道菌群中篩選出3株高抗氧化活性乳酸菌菌株，分析其對小腸上皮細胞（IEC-6）的細胞黏附能力并通過H2O2誘導構建細胞氧化損傷模型，探索菌株對IEC-6細胞氧化損傷的修復作用，以及對細胞中GSHPx、SOD、CAT等抗氧化酶活性和MDA（malondialdehyde）生成量的影響，為潛在功能性食品添加劑或食品配料開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌菌株 分離自河南省周口市夏邑縣長壽老人糞便；大鼠小腸上皮細胞（IEC-6，CRL-1592TM）美國ATCC公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒（glu-tathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、總抗氧化能力試劑盒（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛試劑盒（malonaldehyde，MDA） 南京建成生物工程研究所；溶菌酶（＞20 kU/mg） 上海碧云天生物技術有限公司；CCK-8試劑盒 日本Dojindo公司；過氧化氫、鄰苯三酚、鄰二氮雜菲、鐵氰化鉀等生化試劑 阿拉丁試劑（上海）有限公司。

Biometra T-Gradient梯度PCR儀 德國Biometra公司；EC3 310凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；UV2600紫外分光光度計 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；HVE-50自動高壓滅菌器 日本Hirayama公司；SW-CJ-2FD超潔凈工作臺 江蘇蘇凈集團公司；Thermo 371 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；VCX750超聲破碎儀 美國Sonics Materials公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)及菌體裂解液的制備 取出凍存于甘油管（-80 ℃）中的36株乳酸菌菌株，接種至MRS液體培養(yǎng)基中，傳代3次。菌株按照2%接種量在MRS液體培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)18 h后，利用平板涂布計數(shù)法計算活菌數(shù)，4000×g離心5 min，菌體細胞重懸于無菌PBS緩沖液中，調(diào)整細菌濃度為1×109CFU/mL，該菌懸液用于后續(xù)研究。

待測菌株菌懸液（1×109CFU/mL）中加入溶菌酶（1 mg/mL），37 ℃培養(yǎng)30 min，冰浴條件下超聲破碎（250 W，超聲5 s，間隔10 s，共10 min），8000×g離心10 min，收集上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，得到菌株裂解液。

1.2.2 菌株的過氧化氫耐受能力分析 菌株過氧化氫耐受能力分析參照Das等[13]的方法，待測菌株按照1%接種量分別接種于H2O2濃度為0.8 mmol/L的MRS液體培養(yǎng)基和不含H2O2的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)8 h，600 nm波長下測定培養(yǎng)液吸光度值，以不含H2O2的樣品作為空白。

1.2.3 DPPH自由基清除能力分析 取2 mL的DPPH-無水乙醇溶液（400 μmol /L），加入2 mL待測菌株混勻，室溫避光靜置30 min，8000×g離心10 min，測定上清液在517 nm的吸光度值[14]。DPPH自由基清除率計算公式為：

式中：A0為等體積無水乙醇代替樣品的吸光度值；A1為實驗組吸光度值；A2為等體積無水乙醇代替DPPH乙醇溶液的吸光度值。

1.2.4 羥自由基清除能力分析 將1 mL鄰二氮雜菲（2.5 mmol/L）、1 mL的PBS（pH7.4）、0.5 mL待測菌株混合均勻，隨后加入1 mL的FeSO4溶液（2.5 mmol/L）和0.5 mL的H2O2（20 mmol/L），37 ℃水浴1 h，檢測其在536 nm波長處的吸光度值[15]。羥自由基清除率計算公式為：

式中：A0為等體積水代替樣品的吸光度值；A1為等體積水分別代替樣品和H2O2的吸光度值；A2為含樣品和H2O2的吸光度值。

1.2.5 超氧陰離子自由基清除能力分析 取3.4 mL Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH8.2）、0.5 mL鄰苯三酚溶液（50 mmol/L），加入1 mL待測菌株，混合均勻后放入25 ℃的培養(yǎng)箱反應4 min，隨后加入0.1 mL的HCl溶液（8 mol/L）終止反應，測定其在320 nm的吸光值[2]。超氧陰離子自由基清除率計算公式為：

式中：A0為等體積水代替樣品的吸光度值；A1為實驗組吸光度值。

1.2.6 細胞培養(yǎng) IEC-6細胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、90% DMEM（4 mmol/L的L-谷氨酰胺、1 mmol/L的丙酮酸鈉、4.5 g/L的葡萄糖）和100 U/L牛胰島素的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO2濃度為5%，隔天換液1次，培養(yǎng)瓶中細胞密度達到80%～90%時傳代，第15～20代對數(shù)期生長細胞用于本研究。

1.2.7 細胞黏附能力分析 細胞黏附實驗參照Song等[8]的方法。IEC-6細胞以每孔6×105個的濃度接種于96孔板中，完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至6×103/孔，貼壁24 h后再無血清培養(yǎng)12 h使細胞同步于G0期，吸出無血清培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入100 μL待測菌株（109CFU/mL），37 ℃培養(yǎng)2 h，PBS洗滌去除未黏附細菌，隨后加入Triton X-100，使黏附細菌從細胞脫落，初始細菌數(shù)及黏附細菌數(shù)統(tǒng)計均采用平板涂布計數(shù)。細胞黏附率公式如下：

式中：A0為初始細菌數(shù)量；A1為黏附細菌數(shù)量。

1.2.8 細胞氧化損傷模型建立 細胞氧化損傷模型參照朱靜靜等[16]的方法建立并根據(jù)預實驗結(jié)果稍作修改。96孔板上調(diào)整IEC-6細胞細胞密度至6×103/孔，貼壁24 h后再無血清培養(yǎng)12 h使細胞同步于G0期，吸出無血清培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入200 μL不同濃度（0、50、75、100、125、150 μmol/L）的H2O237 ℃培養(yǎng)4 h后，吸去H2O2，PBS洗滌。隨后采用CCK-8試劑盒測定細胞存活率，即向每孔加入含10 μL CCK-8溶液的無血清培養(yǎng)液110 μL，37 oC孵育90 min，測定各孔OD值（檢測波長450 nm）。CCK-8試劑盒方法測定細胞存活率的計算公式如下：

式中：A0為無細胞培養(yǎng)基的吸光度值；A1為正常培養(yǎng)組的吸光度值；A2為H2O2處理組的吸光度值。

1.2.9 細胞存活率、丙二醛含量及抗氧化酶活力分析 IEC-6細胞以2×105/孔接種于6孔板中，無血清培養(yǎng)基使細胞同步于G0期，PBS洗滌后加入2 mL含有菌株裂解液的培養(yǎng)基（菌株的無細胞裂解液和完全培養(yǎng)基以1:1混合），37 ℃培養(yǎng)24 h。PBS洗滌，100 μmol/L的H2O2處理4 h。隨后進行細胞存活率、丙二醛含量及抗氧化酶活力的分析。其中，細胞存活率采用CCK-8試劑盒測定細胞存活率，具體方法同1.2.8；丙二醛含量及抗氧化酶活力分析參照Liu等的方法并稍作改動[2]，即每孔中加入1 mL 1%的Triton-X-100，冰上裂解10 min，離心后取上清液（8000×g，5 min），根據(jù)試劑盒方法測定不同處理組的GSH-Px、T-SOD、CAT活性，T-AOC值及MDA含量。

具體分組和實驗處理如下：空白組不添加菌株裂解液，不經(jīng)H2O2損傷處理；損傷組不添加菌株裂解液，經(jīng)H2O2損傷處理；實驗組添加菌株裂解液，經(jīng)H2O2損傷處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以“均值±標準偏差”的形式表示，并采用SPSS 26.0進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析進行組間比較，顯著水平設為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株H2O2耐受能力

H2O2是一種長效氧化劑，可通過直接氧化損傷或作為羥自由基的前體物質(zhì)，加速細胞衰老過程甚至殺死細胞[17]?？寡趸昴軌虻钟欢ǔ潭菻2O2造成的氧化損傷，同等培養(yǎng)條件下，菌株抗氧化能力越強，菌株生長受H2O2影響越小。一定濃度范圍內(nèi)，培養(yǎng)液中細菌濃度與液體光密度（OD值）成正比，因此可以利用菌液的OD600值來分析菌株生長情況[18]。

36株分離菌株的H2O2耐受能力如表1所示。空白組各菌株的OD600為2.34～2.76，不同菌株生長情況有差異；實驗組各菌株經(jīng)0.8 mmol/L H2O2共培養(yǎng)8 h后，OD600為0.36～1.27，所有菌株生長都受到一定程度抑制，但不同菌株對H2O2脅迫的抗性不同。高抗氧化菌株經(jīng)0.8 mmol/L H2O2處理8 h后，菌株對氧化損傷抗性較高，OD600通常大于1.0[13]，本研究初篩實驗組OD600＞1.0的16株菌株用于后續(xù)抗氧化實驗。

表1 分離菌株的H2O2（0.8 mmol/L）耐受能力Table 1 Tolerance of H2O2 (0.8 mmol/L) of the isolated strains

2.2 菌株的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基性狀穩(wěn)定，是一種常見的抗氧化效果評價方法，可用于篩查乳酸菌的抗氧化活性[19]。由表2可知，16株乳酸菌都有一定的DPPH自由基清除能力（16.28%～57.16%），不同菌株清除DPPH自由基能力有較大差異，HN-04、HN-05、HN-15的DPPH自由基清除能力較強，分別為54.31%、57.16%和52.81%。乳酸菌的DPPH自由基清除能力與其分泌到菌體表面和代謝產(chǎn)物中的胞外多糖有關，這些多糖類物質(zhì)通過氫原子和電子轉(zhuǎn)移，中和DPPH自由基[20]。王英等[21]從傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中分離出29株乳酸菌，除發(fā)酵乳桿菌P13（DPPH自由基清除率為73.02%）外，其余菌株的DPPH自由基清除率在10.81%～62.68%之間，結(jié)果與本研究基本一致。

表2 分離菌株的DPPH自由基清除能力Table 2 DPPH radical scavenging ability of the isolated strains

2.3 菌株的羥自由基清除能力

羥自由基清除劑可猝滅體系中強氧化性的羥自由基，保護生物分子免受氧化損傷影響。乳酸菌菌體表面存在Fe2＋和Cu2＋等過渡金屬離子的螯合物質(zhì)，能夠抑制芬頓反應（Fenton reaction），防止羥自由基的生成[22]。如表3所示，16株乳酸菌均具有一定的羥自由基清除能力（18.03%～52.38%），不同菌株清除羥自由基能力有較大差異，其中HN-04、HN-05、HN-15的羥自由基清除能力較強，分別為48.10%、52.38%、47.44%。張俊等[23]從甘南傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵酸奶中篩選出6株乳酸菌，菌株的羥自由基清除率為14.03%～36.92%，略低于本研究數(shù)據(jù)，這可能是由于菌株的羥自由基清除能力和菌株自身特性有關。

表3 分離菌株的羥自由基清除能力Table 3 Hydroxyl radical scavenging ability of the isolated strains

2.4 菌株的超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基和羥基結(jié)合后，會破壞細胞DNA，引起脂質(zhì)過氧化，對細胞和生物體造成損傷[24]。由表4可知，16株乳酸菌均具有一定的超氧陰離子自由基清除活性（12.98%～43.31%），不同菌株的超氧陰離子自由基清除能力不同，其中HN-04、HN-05、HN-15超氧陰離子自由基清除率較高，分別為42.06%、43.31%、37.11%。乳酸菌清除超氧陰離子自由基的能力，與其代謝產(chǎn)生的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等抗氧化酶類有關[6]。李穎等[25]發(fā)現(xiàn)7株人源植物乳桿菌的超氧陰離子自由基清除能力為49.99%～54.04%，與本文研究結(jié)果接近。

表4 分離菌株的超氧陰離子自由基清除能力Table 4 Superoxide anion radical scavenging ability of the isolated strains

綜合菌株的DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力分析結(jié)果，選擇抗氧化性較強的HN-04、HN-05、HN-15進行下一步分析。

2.5 菌株的細胞黏附能力

乳酸菌對小腸上皮細胞的黏附是發(fā)揮其腸道定殖、抗菌、抗氧化等益生作用的前提條件。乳酸菌通過表面特異性識別分子和宿主靶細胞表面的相應受體，在空間結(jié)構上相互匹配并結(jié)合。乳酸菌的黏附能力除與菌體和細胞直接相關外，也受外界溫度、酸堿度、離子強度等因素的影響[26]。

分離菌株對IEC-6細胞黏附作用如表5所示，HN-04、HN-05、HN-15菌株的初始細菌數(shù)分別為9.08、9.07和9.15（lg CFU/mL），和IEC-6細胞共培養(yǎng)孵育2 h后，3株菌的細胞黏附率分別為6.77%、6.92%和5.82%，HN-04和HN-05菌株的細胞黏附率顯著高于HN-15菌株（P＜0.05）。報道顯示，乳酸菌的細胞黏附率一般在2%～10%之間，不同菌株的細胞黏附率不同，明串珠菌H40、植物乳桿菌SY11和短乳桿菌KU15153對結(jié)腸癌細胞HT-29的黏附率分別為2.86%、7.20%和8.91%[27-28]，本研究數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致。

表5 分離菌株的IEC-6細胞黏附能力Table 5 Adhesion ability to IEC-6 cells of the isolated strains

2.6 H2O2氧化損傷模型建立及菌株對IEC-6細胞存活率的影響

H2O2可以通過芬頓反應、自動氧化等途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基自由基，造成細胞的氧化損傷，直觀反映氧化還原環(huán)境失衡對細胞活性的影響，因此，可利用H2O2建立IEC-6細胞氧化損傷模型[29]。如圖1a所示，IEC-6細胞存活率隨著H2O2濃度的增加而降低，當H2O2濃度小于100 μmol/L時，其對IEC-6細胞損傷不明顯，細胞存活率仍大于80%；隨著H2O2濃度升高，細胞存活率快速下降，當H2O2濃度為150 μmol/L時，細胞存活率僅為48.65%。為防止H2O2濃度太高導致IEC-6細胞損傷難以恢復，選取100 μmol/L的H2O2用于建立細胞氧化損傷模型。

乳酸菌能夠降低氧化劑或外源真菌毒素對細胞的毒性，提升細胞存活率，預防或修復細胞損傷[30]。由圖1b可知，HN-04、HN-05、HN-15菌株裂解液共培養(yǎng)24 h后，IEC-6細胞存活率分別提升了7.24%、11.19%和5.31%，表明3株乳酸菌對H2O2誘導的IEC-6細胞損傷有一定的預防作用。Németh等[31]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌2142無論是預防處理還是共培養(yǎng)保護，都能夠顯著降低H2O2氧化損傷導致的Caco-2細胞凋亡。乳酸菌可以調(diào)節(jié)相關基因的表達緩解氧化損傷，例如Hou等[32]通過轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能夠下調(diào)細胞中氧化應激相關基因（TNF、NUAK2、FBN2）表達、抑制免疫應答和凋亡相關信號通路中基因（Jak-STAT、MAPK）的表達，減輕細胞的氧化應激損傷。

圖1 H2O2濃度（a）和菌株裂解液（b）對IEC-6細胞存活率影響Fig.1 Effects of the H2O2 concentration (a) and the three strains (b) on the viability of the IEC-6 cells

2.7 菌株對IEC-6細胞中丙二醛含量的影響

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物，可與生物大分子發(fā)生反應，產(chǎn)生細胞毒性和遺傳毒性，常被作為反映機體氧化損傷的指標[22]。細胞內(nèi)的MDA由細胞膜磷脂中的脂肪?；^氧化物分解產(chǎn)生，是前列腺素合成中環(huán)氧合酶反應的產(chǎn)物，MDA作為氧化應激過程中的脂質(zhì)過氧化物，可引起組織細胞損傷，其含量常用來評估氧化應激的程度[33]。由圖2可知，H2O2氧化損傷導致IEC-6細胞內(nèi)MDA含量顯著上升，乳酸菌預處理可顯著降低MDA含量（P＜0.05）。相對于損傷組，HN-04、HN-05、HN-15菌株處理組細胞中的MDA含量分別降低了29.12%、48.80%和20.98%。乳酸菌預處理能夠降低氧化損傷模型細胞內(nèi)的MDA含量，表明3種乳酸菌能減輕H2O2引發(fā)的脂質(zhì)氧化作用，對抗氧化應激損傷。

圖2 乳酸菌對H2O2誘導損傷的IEC-6細胞中MDA含量的影響Fig.2 Effects of the three strains on MDA content in IEC-6 cells under oxidative stress induced by H2O2

2.8 菌株對IEC-6細胞中抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶類在機體抵御活性氧損傷中起著重要作用，抗氧化酶能夠迅速催化抗氧化反應，抵御氧化應激刺激，避免組織和細胞遭受過氧化物損害[34]。

由表6可知，H2O2處理后，IEC-6細胞內(nèi)抗氧化酶系活性顯著降低（P＜0.05），3株乳酸菌預處理能夠緩解抗氧化物酶系活力的下降趨勢。氧化損傷使IEC-6細胞中的GSH-Px、T-SOD、CAT活性和T-AOC值分別降低32.53%、54.06%、56.89%和60.91%；相對于損傷組，乳酸菌HN-04、HN-05、HN-15預處理可使細胞中GSH-Px、T-SOD、CAT和T-AOC值分別增加12.03%～32.39%、21.20%～47.42%、36.10%～87.14%和23.55%～48.69%。一些研究關注了乳酸菌對細胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響，植物乳桿菌Y16發(fā)酵產(chǎn)物能夠提升氧化損傷HepG2細胞株中的SOD、GSH-Px、CAT酶活性，提高細胞存活率[30]。植物乳桿菌C88、干酪乳桿菌Zhang能夠增強受試動物血清中的SOD、GSH-Px、CAT酶活性，減輕氧化應激對機體的損傷[22,35]。SOD、CAT和GSHPx是機體防御和消除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的重要屏障，T-AOC反映了機體非酶抗氧化防御體系能力，3株乳酸菌能夠提升氧化模型細胞中的抗氧化酶活性和T-AOC值，這一結(jié)果和3株乳酸菌的自由基清除效果一致。

表6 乳酸菌對H2O2誘導損傷的IEC-6細胞抗氧化酶活性的影響Table 6 Effects of the three strains on antioxidant enzyme activities in IEC-6 cells under oxidative stress induced by H2O2

3 結(jié)論

通過H2O2初篩及DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力分析，從河南夏邑長壽老人腸道中篩選得到具備抗氧化活性的發(fā)酵乳桿菌HN-04、植物乳桿菌HN-05、動物雙歧桿菌HN-15。3株菌作用于H2O2誘導的IEC-6細胞損傷模型后，均能夠提高氧化損傷細胞的存活率，增強細胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（12.03%～32.39%）、超氧化物歧化酶（21.20%～47.42%）、過氧化氫酶活性（36.10%～87.14%）和總抗氧化能力（23.55%～48.69%），降低丙二醛含量（20.98%～48.80%）。所篩選的3株乳酸菌可作為潛在的天然抗氧化劑應用于功能性食品開發(fā)。