磷酸化大豆多肽螯合鈣的制備工藝優(yōu)化及其對成骨細胞的活性影響

廖子蔚，陳 陽，陳秀云，黃茜茜，龍 林，孫代華，胡 輝,

（1.勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北黃石 435000；2.湖北省中藥配方顆粒工程技術研究中心，湖北黃石 435000）

大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）是豆科大豆屬一年生草本植物，廣泛種植于我國的東北、華北等地域[1]。大豆的精深加工過程中會產生大量的大豆分離蛋白粉，由于其具有良好的凝膠性能常被用于提高米面制品的品質[2]。目前，對大豆分離蛋白粉的進一步開發(fā)應用主要表現(xiàn)在制備大豆分離蛋白多肽上[3-4]。有研究表明大豆多肽具有較好的降血糖、抗氧化、抗癌、促進骨細胞增殖等作用，具有較高的經濟價值[5-6]。

鈣是人體必需的常量元素，它參與生物體的神經傳遞、激素釋放和滲透壓調節(jié)等生命活動[7]。缺鈣影響兒童正常的生長發(fā)育，還會加大中老年人患骨質軟化癥、骨質疏松癥的風險。我國人民習慣攝入植物性食物，但其中的草酸、植酸會限制鈣的吸收[8]。近年來有研究表明，以無機鈣和有機鈣為原料的第一、第二代補鈣制劑具有吸收率差、生物利用率低等缺陷，而將蛋白質酶解成多肽后與鈣離子螯合形成的第三代多肽螯合鈣制劑具有水溶性好、生物利用率高和鈣吸收能力強等特點[9-11]。王思遠等[12]以蠶蛹為原料，經過粉碎、脫脂、酶解、螯合以及冷凍干燥等工序制備蠶蛹多肽螯合鈣，發(fā)現(xiàn)其在胃腸道環(huán)境中釋放率遠遠高于碳酸鈣和葡萄糖酸鈣，具有較高的消化穩(wěn)定性。Guo等[13]以魚鱗為原料，經過酸解、超濾、螯合鈣等工序制備魚鱗膠原多肽螯合鈣，證明其能顯著提高小鼠的股骨骨密度。然而多肽螯合鈣負載的鈣離子含量較少，人體攝入量較少時不能起到較強的補鈣作用[14]。磷酸化修飾改性能引入大量的電負離子，從而增強與鈣離子的螯合能力，明顯提高補鈣制劑中的鈣含量[15]。

目前，已有以動物為原料來源制備磷酸化膠原多肽螯合鈣的研究報道，但本課題組尚未發(fā)現(xiàn)有以大豆分離蛋白粉為原料來源制備磷酸化大豆多肽螯合鈣的相關研究，且對其生物活性尚不清楚[16]。本實驗以單因素實驗篩選出對三聚磷酸鈉與大豆多肽磷酸化程度影響較大的因素，再利用Box-Behnken試驗對磷酸化大豆多肽的制備工藝進行優(yōu)化研究，以使大豆多肽獲得較為合適的磷酸化程度。最后，制備出磷酸化大豆多肽螯合鈣，以驗證其生物活性，為大豆延長加工鏈條和高效應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白粉（純度≥90%） 深圳樂芙生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（批號：9001-73-4，蛋白酶活力≥800 U/mg）、中性蛋白酶（批號：327T011，蛋白酶活力≥50U/mg）、PBS緩沖液 索萊寶科技有限公司；胎牛血清、胰酶、堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒、茜素紅染液 Sigma有限公司；人成骨細胞 北京安諾倫生物科技有限公司；堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒 北京伊塔生物科技有限公司；超濾膜 上海善然生物科技有限公司；三聚磷酸鈉、葡萄糖酸鈣、MTT溶液 阿拉丁生化科技股份有限公司。

TU-1901紫外可見分光光度計 北京普析通用有限公司；AB135-S分析天平 梅特勒-托利多公司；RM2016病理切片機 上海徠卡儀器有限公司；Synergy H1多功能酶標儀 美國Biotek公司；Mshot MSX2成像系統(tǒng) 廣州市明美光電技術有限公司；ZA3000原子吸收分光光度計 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備工藝流程 大豆多肽、大豆多肽螯合鈣、磷酸化大豆多肽和磷酸化大豆多肽螯合鈣的制備工藝流程圖如圖1所示。

圖1 大豆多肽、大豆多肽螯合鈣、磷酸化大豆多肽和磷酸化大豆多肽螯合鈣工藝流程Fig.1 Technological process of soybean polypeptide, soybean polypeptide chelated calcium, phosphorylated soybean polypeptide and phosphorylated soybean polypeptide chelated calcium

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 大豆多肽的制備 參考李宇等[6]的方法制備大豆多肽，首先精確稱取35 g大豆分離蛋白粉和0.175 g木瓜蛋白酶，加入到20倍體積的純凈水中，混勻，水浴升溫至55 ℃，使用0.1 mol/L的氫氧化鈉調節(jié)pH至7.0±0.5并保持酶解液pH穩(wěn)定，酶解3 h，然后將反應體系降溫至45 ℃并加入0.35 g的中性蛋白酶，反應2 h，升溫至95 ℃滅活蛋白酶20 min，冷卻至室溫后在8000 r/min的條件下離心15 min，取上清液，透析除鹽，并過分子量30 kD的超濾膜，收集透過液，冷凍干燥得到大豆多肽。

1.2.2.2 大豆多肽螯合鈣的制備 取1.2.2.1項中的大豆多肽完全溶解于去離子水中，并根據(jù)本課題組預實驗得到的螯合鈣最佳工藝條件進行鈣離子螯合，大豆多肽與氯化鈣的質量比為2:1，反應pH為8.0，反應溫度為50℃，反應時間為1.5 h。最后加入10倍體積的無水乙醇沉淀，在8000 r/min的條件下離心15 min并取出沉淀，冷凍干燥得到大豆多肽螯合鈣。

1.2.2.3 磷酸化大豆多肽和磷酸化大豆多肽螯合鈣的制備 取1.0 g 1.2.2.1項中的大豆多肽溶解于10 mL去離子水中，加入適量的三聚磷酸鈉，調節(jié)pH為6.0，50 ℃恒溫水浴反應8 h，反應后在4 ℃的純水中透析24 h以除去游離的磷酸鹽，然后冷凍干燥成磷酸化大豆多肽粉，并根據(jù)本課題組預實驗得到的螯合鈣最佳工藝條件進行鈣離子螯合，最優(yōu)螯合條件為磷酸化大豆多肽與氯化鈣的質量比為2:1，反應pH為8.0，反應溫度為50 ℃，反應時間為1.5 h。最后加入10倍體積的無水乙醇沉淀，離心并取出沉淀，冷凍干燥得到磷酸化大豆多肽螯合鈣。

1.2.3 不同磷酸化條件對鈣螯合量的影響

1.2.3.1 單因素實驗 精確稱取1.0 g大豆多肽，設定三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比1:2，反應溫度50 ℃，反應時間11 h，反應pH7為磷酸化大豆多肽單因素實驗過程中的常規(guī)變量，以三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1），反應溫度（30、40、50、60、70 ℃），反應時間（5、7、9、11、13 h），反應pH（4、5、6、7、8）四個變量代替單因素實驗中的相應常規(guī)變量，并將得到的磷酸化大豆多肽與氯化鈣在質量比為2:1，反應pH為8.0，反應溫度為50 ℃，反應時間為1.5 h條件下反應。反應結束后加入10倍體積的無水乙醇沉淀，離心并取出沉淀，冷凍干燥得到磷酸化大豆多肽螯合鈣，測定鈣螯合量。

1.2.3.2 響應面試驗優(yōu)化磷酸化大豆多肽的制備工藝 依據(jù)單因素實驗的結果，選取反應溫度（A）、反應時間（B）和反應pH（C）為自變量，設定鈣螯合量（Y）為響應值，進行三因素三水平響應面優(yōu)化試驗，實驗設計表如表1所示。

表1 磷酸化大豆多肽的制備工藝響應面試驗設計因素與水平Table 1 Design factors and levels of response surface methodology for the preparation of phosphorylated soybean polypeptides

1.2.4 鈣螯合量的測定 使用原子吸收分光光度計測定磷酸化大豆多肽螯合鈣中的鈣含量，并計算鈣螯合量。鈣螯合量按公式1計算：

式中：Y：供試品的鈣螯合量（mg/g）；A：供試品的含鈣量（mg）；B：供試品的質量（g）。

1.2.5 細胞活性實驗

1.2.5.1 人成骨細胞的培養(yǎng)和傳代 參考Brezulier等[17]方法，首先將凍存的人成骨細胞（6×103cells/cm2）在37 ℃條件下解凍后接種于裝有DMEM-F12培養(yǎng)基的離心管中，加入質量分數(shù)10%的胎牛血清和1%的抗生素（100 U/mL 青霉素:100 μg/mL 鏈霉素=1:1），然后以1000 r/min的轉速離心2 min，將上清液在無菌條件下棄去后再次加入新鮮的DMEMF12培養(yǎng)基混懸，最后取適量的細胞懸液轉入無菌培養(yǎng)瓶中在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱（內含5% CO2）中培養(yǎng)。當細胞融合后，使用乙二胺四乙酸脫落，再次進行離心、混懸和傳代，每隔1 d更換培養(yǎng)基，觀察培養(yǎng)瓶中成骨細胞的生長狀態(tài)。

1.2.5.2 MTT比色法檢測人成骨細胞相對增殖率參考Muralidharan等[18]的方法，使用乙二胺四乙酸將傳代后的人成骨細胞消化，然后1000 r/min離心5 min，混懸配制成細胞懸液并接種于96孔細胞培養(yǎng)板上（1×104cells/well）。在細胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)24 h后，加入濃度為40 μg/mL的大豆多肽（樣品A）、磷酸化大豆多肽（樣品B）、大豆多肽螯合鈣（樣品C）、磷酸化大豆多肽螯合鈣（樣品D）和葡萄糖酸鈣（樣品E，鈣含量10 mg/mL），用不加樣品的培養(yǎng)基處理的細胞作為對照組，PBS緩沖液作為空白組。然后繼續(xù)培養(yǎng)，在樣品加入后的5 d內，每隔1 d分別取出細胞培養(yǎng)板，在每孔中加入15 μL的MTT溶液，最后繼續(xù)培養(yǎng)5 h后取出培養(yǎng)板使用酶標儀在450 nm處測定吸光度。人成骨細胞相對增殖率按式（2）計算：

1.2.5.3 ALP染色實驗 將對數(shù)生長期的人成骨細胞接種到無菌細胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)一段時間，待細胞貼壁生長時分別加入樣品A、樣品B、樣品C、樣品D和樣品E，然后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h后使用ALP染色試劑盒進行染色，并觀察染色情況。

1.2.5.4 人成骨細胞ALP活性檢測 將傳代后的人成骨細胞消化、離心、混懸配制成細胞懸液并接種于96孔細胞培養(yǎng)板上（1×104cells/well）。在細胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)24 h后，加入濃度為40 μg/mL的大豆多肽（樣品A組）、磷酸化大豆多肽（樣品B組）、大豆多肽螯合鈣（樣品C組）、磷酸化大豆多肽螯合鈣（樣品D組）和葡萄糖酸鈣（樣品E組，鈣含量10 mg/mL），用不加樣品的培養(yǎng)基處理的細胞作為對照組，PBS緩沖液作為空白組。當細胞培養(yǎng)第7 d、第14 d時使用ALP活性檢測試劑盒檢測各樣品組細胞的ALP活性。

1.2.5.5 茜素紅染色實驗 參考鄭家強等[19]的方法并根據(jù)預實驗結果進行茜素紅染色實驗。首先，在每個樣品的平行組中選取細胞相對增殖活性和ALP活性相對較強的組，與空白組一起，將細胞按1×105cells/well的濃度接種到細胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清和成骨誘導液）。細胞繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后，進行茜素紅染色，并使用光學顯微鏡觀察和采集圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗使用Origin8.6進行圖形繪制，Design-Expert V8.0.6軟件進行響應面優(yōu)化試驗設計與結果分析，SPASS 22.0軟件進行顯著性分析和多重比較（t檢驗），P＜0.05說明有顯著性差異。所有試驗重復3次用平均值±標準偏差（±s）表示。

2 結果與分析

2.1 磷酸化大豆多肽螯合鈣單因素實驗結果

2.1.1 三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比對鈣螯合量的影響 實驗結果如圖2所示，鈣螯合量隨著三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比的升高，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，但整體效果并不顯著（P＞0.05）。當三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比較小時，磷酸根離子含量過低，大豆多肽未達到最高的鈣螯合程度，當三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比達到1:2時，磷酸根離子對大豆多肽進行最大程度的改性，螯合到最多的鈣離子。當磷酸根離子濃度繼續(xù)增加時，磷酸根離子在反應體系中處于過飽和狀態(tài)，使空間位阻強度達到最大，降低了磷酸根離子的改性程度，從而使鈣螯合量減小[20]。因此，三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比對鈣螯合量的影響不顯著（P＞0.05），考慮到生產成本，選擇三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比1:2作為反應條件最為合理。

圖2 三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比對鈣螯合量的影響Fig.2 Effect of mass ratio of sodium tripolyphosphate to soybean polypeptide on calcium chelation amount

2.1.2 反應溫度對鈣螯合量的影響 分析圖3可知，鈣螯合量隨著反應溫度的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在50 ℃時達到最高值。溫度升高使體系能量變大，提高了大豆多肽、磷酸根離子與鈣離子的碰撞機率，增加了單位質量大豆多肽的鈣螯合量。當溫度高于50 ℃時鈣螯合量下降，這可能是因為溫度過高使多肽發(fā)生了部分變性，從而降低了單位質量大豆多肽的鈣螯合量[21]。因此，后續(xù)優(yōu)化試驗選擇反應溫度50 ℃為宜。

圖3 反應溫度對鈣螯合量的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on calcium chelation amount

2.1.3 反應時間對鈣螯合量的影響 由圖4可知，隨著反應時間的延長，鈣螯合量呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，在第9 h時鈣螯合量達到最大值。隨著反應時間的延長，大豆多肽的磷酸化改性程度提高，鈣螯合量變大，當反應時間繼續(xù)延長時，鈣螯合量反而下降，這可能是因為磷酸化改性過程伴隨著副反應的發(fā)生，產生的副產物會阻礙大豆多肽、磷酸根離子和鈣離子螯合[22]。因此，選擇反應時間9 h最為合適。

圖4 反應時間對鈣螯合量的影響Fig.4 Effect of reaction time on calcium chelation amount

2.1.4 反應pH對鈣螯合量的影響 由圖5可以看出，pH的變化對鈣螯合量有顯著的影響（P＜0.05）。當pH在4～6時，隨著pH的增加鈣螯合量變大，當pH為6時，鈣螯合量最大，當pH繼續(xù)增加時，鈣螯合量逐漸下降。這是因為酸性反應體系，有利于多肽鏈上氨基酸的羥基易與磷酸根離子形成C-O-P-結構，且pH=6時形成的結構穩(wěn)定性最強，從而使鈣螯合量最高[23]。

圖5 反應pH對鈣螯合量的影響Fig.5 Effect of reaction pH value on calcium chelation amount

2.2 Box-Benhnken試驗優(yōu)化分析

2.2.1 響應面多元回歸方程的建立 使用Design-Expert V8.0.6軟件對表2中的響應面數(shù)值與被預測變量之間的相互關系進行多元回歸方程擬合分析。獲得兩個因素之間的交互作用對鈣螯合量影響的等高線圖和3D立體響應面圖（見圖3），并獲得以鈣螯合量為目標的二元多次回歸方程模型公式為：Y=106.44800-2.06250A-3.32625B+0.14875C+0.61250AB-(2.50000E-003)AC-2.57000BC-6.78400A2-4.95150B2-9.24650C2。

表2 磷酸化大豆多肽的制備工藝響應面優(yōu)化方案及結果Table 2 Optimization scheme and results of response surface methodology for the preparation of phosphorylated soybean polypeptides

2.2.2 響應面方差分析 進一步利用響應面軟件對模型進行方差分析和顯著性檢驗以驗證該模型的有效性，結果如表3所示。

表3 響應面回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression equation model

從表3可以看出，多元回歸方程模型中P＜0.05，另外失擬項P=0.5184＞0.05，說明得到的多元回歸方程模型具有較高的擬合度，可以用來優(yōu)化磷酸化大豆多肽的制備工藝[24]。另外，該模型的響應值決定系數(shù)為R2=0.9930，說明鈣螯合量有99.30%的變化可以通過該模型進行解釋。該模型的調整系數(shù)RAdj2=0.9840，說明該模型的擬合度較好。因此，該模型可以用于優(yōu)化磷酸化大豆多肽的制備工藝。表3中A與B的P值均小于0.05，而C的P值大于0.05，說明影響鈣螯合量的主要因素是反應時間和反應溫度，而反應pH對鈣螯合量的影響較小[25]。由圖6可知，AB、AC各項之間的交互作用等高曲線接近于圓形，而BC各項之間的交互作用等高曲線接近于橢圓形，這說明BC各項的交互作用比AB、AC各項之間的交互作用更加明顯[26]。同時，表3中的方差分析結果也表明BC之間的交互作用對響應值的影響顯著（P＜0.05），AB、AC之間的交互作用對響應值的影響不顯著（P＞0.05），與等高曲線的分析結果一致。由此模型預測出磷酸化大豆多肽的最佳制備工藝為反應時間9.72 h，反應溫度51.68 ℃，反應pH為6.94，在此基礎上，預測鈣螯合量最高為107.23 mg/g。

圖6 各因素交互作用對鈣螯合量的影響Fig.6 Effects of interaction of various factors on calcium chelation

結合實際生產情況，并結合反應時間9.7 h，反應溫度52 ℃，反應pH為7.0進行三次平行驗證實驗，得到鈣螯合量的平均值為107.25±0.10 mg/g，與多元回歸方程模型得到的預測值無明顯差異。孫博[27]以玉米黃粉為原料，通過提取、純化、酶解、超濾以及螯合鈣等工藝得到玉米多肽螯合鈣，其鈣螯合量（77.2 mg/g）低于本實驗制得的磷酸化大豆多肽螯合鈣，表明磷酸化大豆多肽螯合鈣具有較高的鈣含量。因此，磷酸化大豆多肽螯合鈣具有一定的市場應用價值。

2.3 細胞活性分析

2.3.1 各樣品對人成骨細胞相對增殖率的影響 磷酸化對成骨細胞具有調控作用，可調節(jié)成骨細胞和破骨細胞之間的平衡，降低成骨細胞凋亡水平[28]。圖7是不同樣品組對人成骨細胞相對增殖率的影響趨勢圖。分析圖中結果可知，所有樣品組均表現(xiàn)出對人成骨細胞具有促增殖的作用。各組樣品從第1 d開始，細胞相對增殖率均呈現(xiàn)先升高后減低的趨勢，A組、B組、C組和D組均在第3 d出現(xiàn)拐點，E組在第4 d出現(xiàn)拐點，這是因為隨著時間的延長，細胞的代謝能力和樣品的作用效果開始減弱，從而導致相對增殖率下降。對各組樣品的細胞相對增殖率進行比較，發(fā)現(xiàn)第3 d時A組和E組的細胞相對增殖率無顯著性差異（P＜0.05），B組、C組和D組的細胞相對增殖率是A組和E組1.13～1.67倍。從整體來看，各組樣品對人成骨細胞的相對增殖能力強弱順序為D組＞C組＞E組＞B組＞A組，這可能是因為磷酸化降低了成骨細胞凋亡速率，從而導致B組細胞相對增殖率高于A組。同時，多肽螯合鈣能刺激細胞，提高細胞增殖能力，且提升程度與鈣離子濃度成正相關，磷酸化多肽螯合鈣增加了多肽的單位含鈣量，所以細胞相對增殖率D組＞C組＞E組，這與劉閃等[29]的研究結果相似。

圖7 不同樣品組對人成骨細胞相對增殖率的影響Fig.7 Effects of different sample groups on the relative proliferation rate of human osteoblasts

2.3.2 ALP染色分析 堿性磷酸酶（ALP）是人成骨細胞早期分化過程中產生的標志性產物，它代表著骨鈣化的程度[30]。圖8反映了在加樣96 h后，不同樣品組的ALP染色和ALP染色陽性率情況。由圖8可知，各樣品組與人成骨細胞作用后均呈現(xiàn)陽性反應，但染色陽性率有明顯的差異性（P＜0.05），空白組的染色程度較低，D組（磷酸化大豆多肽螯合鈣）的染色程度最高，這可能是因為成骨細胞的分化程度與其作用的鈣濃度有關，磷酸化大豆多肽螯合鈣對人成骨細胞具有最強的促分化能力，所以導致各組樣品的ALP染色陽性率呈現(xiàn)D組＞C組＞E組＞B組＞A組。

圖8 不同樣品組的ALP染色圖和ALP染色陽性率圖Fig.8 ALP staining chart and ALP staining positive rate chart of different sample groups

2.3.3 ALP活性分析 在加入各組樣品處理7 d和14 d后人成骨細胞的ALP活性如圖9所示。ALP活力值越高，表明人成骨細胞的分化能力越強[31]。從圖9中可知，空白組和樣品組均表現(xiàn)出一定的ALP活性，且樣品組的ALP活力明顯高于空白組（P＜0.05），其中D組的促分化能力最強，而C組和E組沒有顯著性差異（P＞0.05）。第7 d時，各樣品組的ALP活力是空白組的2.2倍以上，這可能是因為磷酸化修飾和鈣離子的引入能提高細胞ALP活力，促進成骨細胞分化。在所有組中，第14 d的ALP活力整體低于第7 d，這可能是由于堿性磷酸酶是人成骨細胞分化過程中的早期表型標志物，隨著分化時間的延長，堿性磷酸酶可以催化骨磷酸單酯的水解，提供與鈣結合的無機磷酸鹽來調節(jié)骨代謝和分化[30]。

圖9 不同樣品組的ALP活性情況Fig.9 ALP activity of different sample groups

2.3.4 茜素紅染色實驗分析 茜素紅與鈣離子以螯合方式形成復合物，用來識別組織細胞的鈣鹽成分，通過茜素紅染色，產生桔紅色沉積（即鈣結節(jié)），茜素紅染色越深表示鈣離子沉積越明顯，鈣結節(jié)數(shù)量越多，表示向成骨分化能力越高[32]。從表4和圖10可以發(fā)現(xiàn)，不同樣品組中D組鈣結節(jié)數(shù)量最多，C組次之。C組、D組和E組的鈣結節(jié)數(shù)量顯著高于A組和B組（P＜0.05），這可能是因為樣品中的鈣離子可以促進鈣離子受體和ALP的表達，加速鈣結節(jié)形成，從而促進人成骨細胞進行增值、分化[31]。因此，鈣離子的有效引入，對人成骨細胞的增值、分化具有重要的意義。Wu等[33]將豬骨酶解分別制備豬骨膠原多肽、磷酸化豬骨膠原多肽、豬骨膠原多肽螯合鈣以及磷酸化豬骨膠原多肽螯合鈣，通過茜素紅染色實驗分析各樣品對成骨細胞MC3T3-E1的增殖、分化作用，證明了各樣品中磷酸化豬骨膠原多肽螯合鈣具有最高的促增殖、分化作用，這與本實驗的研究結果一致。

表4 不同樣品組茜素紅染色鈣結節(jié)計數(shù)（ ±s，n=3）Table 4 Alizarin red staining of calcium nodules in different sample groups ( ±s,n=3)

表4 不同樣品組茜素紅染色鈣結節(jié)計數(shù)（ ±s，n=3）Table 4 Alizarin red staining of calcium nodules in different sample groups ( ±s,n=3)

注：*表示與空白組相比差異顯著，P＜0.05。

組別 鈣結節(jié)計數(shù)（個·孔-1）空白組 3±1 A組 26±3*B組 77±6*C組 377±30*D組 614±45*E組 282±27*

圖10 不同樣品組的茜素紅染色圖Fig.10 Alizarin red staining of different sample groups

3 結論

本實驗通過單因素實驗得到三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比、反應溫度、反應pH值和反應時間對鈣螯合量的影響，并通過Box-Behnken法優(yōu)化磷酸化大豆多肽螯合鈣的制備工藝，得出最佳的制備工藝條件為三聚磷酸鈉與大豆多肽的質量比1:2，磷酸化反應溫度52 ℃，磷酸化反應pH7.0，磷酸化反應時間9.7 h，磷酸化大豆多肽與氯化鈣的質量比2:1，螯合反應pH8.0，螯合反應溫度50 ℃，螯合反應時間1.5 h，在此制備工藝條件下鈣螯合量最大為107.25±0.10 mg/g。另外，通過檢測加樣后人成骨細胞的細胞相對增殖率、ALP染色陽性率、ALP活性和鈣結節(jié)數(shù)量，來考察大豆多肽（樣品A）、磷酸化大豆多肽（樣品B）、大豆多肽螯合鈣（樣品C）、磷酸化大豆多肽螯合鈣（樣品D）和葡萄糖酸鈣（樣品E）對人成骨細胞增殖、分化的影響，結果表明與空白組相比，各樣品組對人成骨細胞均有顯著促增殖、分化的能力（P＜0.05），其中磷酸化大豆多肽螯合鈣具有最強的作用效果。這意味著磷酸化大豆多肽螯合鈣有望成為一種預防人體骨質疏松的新功能食品原料。本實驗為大豆的精深加工和高值化利用指出了一種新方法，提高了大豆原料的附加值。