不同環(huán)境條件對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成能力的影響

劉永吉，劉根梅 ，劉國凌，康林芝

（1.韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005；2.廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東韶關(guān) 512005）

生物被膜（Biofilm，BF）是細(xì)菌抵抗不良生存條件、適應(yīng)環(huán)境的一種生存模式，多數(shù)細(xì)菌以生物被膜狀態(tài)群居生長(zhǎng)[1]。生物被膜是由胞外多糖類、蛋白類、eDNA、脂類等胞外基質(zhì)（Matrix）包裹著細(xì)菌形成的結(jié)構(gòu)化、組織化的三維復(fù)合結(jié)構(gòu)[2]。這些生物被膜基質(zhì)將細(xì)菌群體包裹起來并緊密黏附在接觸面上，增加了內(nèi)部細(xì)菌對(duì)抗生素、營養(yǎng)不足、酸堿和溫度改變等不良生存條件的耐受性和適應(yīng)性[3]。因此，細(xì)菌一旦在食品或食品設(shè)備表面形成生物被膜就具有更強(qiáng)的適應(yīng)性和抵抗力，會(huì)導(dǎo)致常規(guī)的抑菌手段、清洗和消毒等衛(wèi)生措施達(dá)不到應(yīng)有效果，往往難以清除并成為持續(xù)的污染源，會(huì)反復(fù)污染食品并引發(fā)食品腐敗和食源性疾病[4-5]。食源性細(xì)菌的生物被膜已成為影響食品安全和衛(wèi)生的新的危害因子。在食品工業(yè)中控制被膜態(tài)的細(xì)菌對(duì)預(yù)防和阻止食品腐敗非常重要[6]。

隆德假單胞菌（Pseudomonas lundensis，PL）是腐敗冷藏肉中經(jīng)常分離到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[7-8]，也是生牛奶中的主要腐敗菌[9-10]，還是少量水產(chǎn)品中的腐敗菌[11-12]。采用經(jīng)典的結(jié)晶紫染色定量法和激光共聚焦顯微鏡結(jié)構(gòu)觀察對(duì)PL的研究表明：PL具有較強(qiáng)的生物被膜產(chǎn)生能力，較短生物被膜形成周期，能在12～24 h內(nèi)形成大量的胞外復(fù)合物，而且其生物被膜的產(chǎn)量與蛋白酶的活性具有正相關(guān)性[13]。在腐敗肉中，采用原位熒光染色和激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)：PL在冷藏豬肉腐敗過程能夠形成易于分散的生物被膜，與莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi）相比，PL在肉表面的生物被膜更具有立體性[14]。同時(shí)該菌在10 ℃的低溫條件下比在25 ℃時(shí)在牛肉中形成更多的生物被膜[15]。鑒于該菌在導(dǎo)致肉類腐敗中的危害，有研究者針對(duì)性地探索了肉桂醛、3-蒈烯對(duì)該菌的抑菌作用，以促進(jìn)冷藏肉類保鮮[16-17]。在自然和食品加工環(huán)境中，細(xì)菌生物被膜的形成或消除受到多種環(huán)境條件的影響。目前，國內(nèi)外對(duì)隆德假單胞菌生物被膜的研究已確定了其在冷藏條件的生物被膜特征，但缺少更多食品相關(guān)環(huán)境條件下其生物被膜形成能力的研究。本文主要研究不同環(huán)境條件對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成能力的影響，為更好地認(rèn)識(shí)與防控隆德假單胞菌生物被膜的潛在危害提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

隆德假單胞菌106 分離自冷藏的豬肉，甘油管-80 ℃保存于本實(shí)驗(yàn)室[13]；胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone Soy Broth, TSB） 青島海博生物科技有限公司；營養(yǎng)肉湯（Nutrient Broth, NB）、LB培養(yǎng)基 杭州百思生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、乙酸 天津市大眾試劑研發(fā)中心；氯化鎂、甲醇 天津市百世化工有限公司；葡萄糖 廣州化學(xué)試劑廠；結(jié)晶紫 天津市大茂化學(xué)試劑廠。

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHA-B數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司；SW-CJ-1D單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SM600酶標(biāo)儀 上海水創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司，Zeiss LSM 710激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser scanning microscopy，CLSM） 德國Carl Zeiss公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化與菌懸液制備 將甘油保藏的德隆假單胞菌平板劃線，在30 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化二次。再挑取第二次平板畫線活化后的單菌落于裝有5 mL TSB培養(yǎng)基的試管中，在30 ℃下180 r/min搖床過夜培養(yǎng)兩次，取第二次液體活化的菌種，用無菌TSB培養(yǎng)基稀釋至OD600nm為0.5待用。

1.2.2 生物被膜的形成與測(cè)定 將制備好的菌液5 μL接種在含195 μL TSB培養(yǎng)基的96孔酶標(biāo)板中，每個(gè)測(cè)試至少接種5個(gè)平行孔，以無菌的TSB培養(yǎng)基為空白對(duì)照。將接種好的酶標(biāo)板，放入恒溫生化培養(yǎng)箱中，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h后取出，小心除去未黏附的浮游菌培養(yǎng)液。再用無菌生理鹽水清洗3次，隨后用200 μL甲醇固定15 min，移去甲醇并晾干，再用1%的結(jié)晶紫200 μL/孔染色5 min后用流水沖洗至沒有顏色流出，自然晾干后用200 μL/孔的33%乙酸溶解5 min，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm處的吸光度，以O(shè)D630值表示隆德假單胞菌生物被膜形成量或生物被膜形成能力[18-19]。

1.2.3 不同培養(yǎng)基和營養(yǎng)脅迫對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響 取制備好的菌液5 μL分別接種在含195 μL的TSB培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基的96孔酶標(biāo)板中，30 ℃靜置培養(yǎng)生物被膜12 h，處理后測(cè)定OD630值，比較不同培養(yǎng)基對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響。

為探究培養(yǎng)基濃度對(duì)隆德假單胞菌的影響，以TSB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用蒸餾水將培養(yǎng)基分別稀釋10倍、20倍、50倍和100倍，以不稀釋的培養(yǎng)基為對(duì)照組樣品，然后分別將隆德假單胞菌按1.2.2方法接種在5種不同濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行生物被膜培養(yǎng)和測(cè)定，評(píng)價(jià)細(xì)菌在營養(yǎng)脅迫下的生物被膜形成能力。

1.2.4 不同接種量對(duì)生物被膜形成的影響 將二次過夜活化后的菌液稀釋分成6個(gè)不同的菌密度，使OD600分別為1.00、0.50、0.20、0.10、0.05和0.01。當(dāng)接種菌液的OD600為1.00時(shí)，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定隆德假單胞菌的菌落數(shù)約為5.0×108CFU/mL。分別取5 μL菌液接種在含195 μL TSB培養(yǎng)基的96孔板中，接種后不同梯度的孔板中菌落數(shù)分別為：1.3×107、6.3×106、2.5×106、1.3×106、6.3×105、2.5×104CFU/mL。按1.2.2方法培養(yǎng)并測(cè)定不同接種量對(duì)生物被膜形成的影響。

1.2.5 不同理化因素對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響

1.2.5.1 葡萄糖濃度對(duì)生物被膜形成的影響 所購TSB培養(yǎng)基含有葡萄糖，按使用說明配制成1 L液體TSB培養(yǎng)，其中含有0.25%的葡萄糖，在此基礎(chǔ)上分別額外添一定濃度的葡萄糖，使培養(yǎng)基中的葡萄糖最終濃度分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.25%、2.25%、4.25%、6.25%和8.25%，按1.2.2方法培養(yǎng)并測(cè)定不同葡萄糖濃度對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響。

1.2.5.2 pH對(duì)生物被膜形成的影響 分別用稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液配制pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的TSB培養(yǎng)基，按1.2.2方法比較不同pH對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響。

1.2.5.3 NaCl添加量對(duì)生物被膜形成的影響 分別配制最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、3.00%、4.00%、5.00%、6.00%、7.00%、8.00% NaCl的TSB培養(yǎng)基，按1.2.2方法培養(yǎng)測(cè)定不同NaCl濃度下PL生物被膜的形成情況。

1.2.5.4 Mg2+濃度對(duì)生物被膜形成的影響 分別配制含0.00%、0.25%、0.50、1.00%、1.50% MgCl2的TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)并測(cè)定生物被膜，按1.2.2方法比較不同濃度的Mg2+對(duì)PL生物被膜形成的影響。

1.2.6 在不銹鋼表面的生物被膜形成能力 將制備好的PL菌液按照1%的比例接種于含無菌不銹鋼片（12 mm×12 mm×1 mm，304）和1 mL TSB培養(yǎng)基的24孔板中。將24孔板至于30 ℃條件下分別培養(yǎng)12 h，在30 ℃條件下分別培養(yǎng)12 h后取出。取出后將菌液輕輕吸出，用0.05 mol/L的PBS清洗3次，每次3～5 min。然后用2.5%戊二醛固定2 h并再次用PBS清洗；吸干水份后用50 μg/mL的FITC-conA熒光染色[20]，置于4 ℃避光染色30 min后用PBS沖洗出去染料，用激光共聚焦顯微鏡采集圖像，并用儀器自帶軟件處理圖片，觀測(cè)生物被膜特征。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)至少重復(fù)兩次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行分析，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05，數(shù)據(jù)用Excel軟件處理并繪圖，CLSM成像圖由設(shè)備自帶軟件生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基和營養(yǎng)對(duì)生物被膜形成的影響

細(xì)菌生物被膜能夠抵抗?fàn)I養(yǎng)不良的生長(zhǎng)環(huán)境，而營養(yǎng)物質(zhì)的可利用情況也對(duì)細(xì)菌生物被膜的形成有直接影響。營養(yǎng)成分的限制可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌在傳代的過程中發(fā)生更多的適應(yīng)性變異，如浮游型銅綠假單胞菌（Pse. aeruginosa）在只含有葡糖糖、乳酸和氨基酸的培養(yǎng)基中，出現(xiàn)了典型的生物被膜調(diào)控基因表達(dá)增加和由于群體感應(yīng)基因激活而誘導(dǎo)的毒力基因表達(dá)增加等現(xiàn)象[21]。隆德假單胞菌在LB培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基中生物被膜形成量無顯著差異（P＞0.05），但其在TSB培養(yǎng)基中的生物被膜形成量顯著高于其在LB培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基中的生物被膜形成量（P＜0.05），如圖1所示。對(duì)比三種培養(yǎng)基的具體成分發(fā)現(xiàn)，TSB培養(yǎng)基中含有葡萄糖，而LB培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基中無葡萄糖添加。這表明含葡萄糖的TSB培養(yǎng)基更適合隆德假單胞菌產(chǎn)生生物被膜。后續(xù)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基均采用了TSB培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.1 Effects of different culture medium on the biofilm formation of Pse. lundensis

以TSB初始濃度為對(duì)照，將TSB稀釋不同的倍數(shù)測(cè)定不同營養(yǎng)脅迫對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成能力的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著培養(yǎng)基的稀釋倍數(shù)增大和營養(yǎng)物質(zhì)濃度降低，各梯度之間有顯著差異，隆德假單胞菌的生物被膜形成量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)基稀釋100倍時(shí)，隆德假單胞菌的培養(yǎng)基呈透明狀，生物被膜形成量極低，生物被膜量值為0.05±0.03，遠(yuǎn)低于營養(yǎng)充足的初始濃度組的生物被膜量1.75±0.35，也低于培養(yǎng)基稀釋50倍造成的營養(yǎng)脅迫下形成的生物被膜量0.24±0.17。對(duì)于成熟的生物被膜，營養(yǎng)缺乏會(huì)促進(jìn)生物被膜的擴(kuò)散而減少。對(duì)于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的生物膜，營養(yǎng)缺乏會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中磷酸二酯酶 BifA 水解 c-di-GMP，進(jìn)而導(dǎo)致粘附素 LapA 蛋白水解，隨后釋放生物膜細(xì)胞，最終導(dǎo)致生物被膜擴(kuò)散而減少生物被膜[22]。而在細(xì)菌生物被膜形成初期，營養(yǎng)限制可能會(huì)直接限制細(xì)菌生物被膜的形成。在多菌生物被膜系統(tǒng)中，往往會(huì)出現(xiàn)營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)性限制。當(dāng)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的混合生物被膜發(fā)展到成熟階段后出現(xiàn)了營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)壓力，導(dǎo)致了群體感應(yīng)信號(hào)的釋放和調(diào)控二者細(xì)胞表型變化以適應(yīng)營養(yǎng)不足[23]。

圖2 營養(yǎng)脅迫對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.2 Effect of nutrition stress on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.2 菌液起始生物量對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響

為探究菌液中隆德假單胞菌的生物量對(duì)生物被膜形成的影響，將接種了不同起始生物量的微孔板進(jìn)行了生物被膜孵化培養(yǎng)，結(jié)果如圖3所示。在營養(yǎng)充足的情況下，隆德假單胞菌初始接種生物量相差1000倍的情況下，接種菌液OD600從0.01到1.00的變化過程中，即微孔板中該菌菌落數(shù)在2.5×104至1.3×107CFU/mL范圍時(shí)，各組生物被膜的形成量沒有顯著差異（P＞0.05）。這表明在一定范圍內(nèi)，隆德假單胞菌生物被膜的形成能力并沒有因初始生物量降低而減弱。這種現(xiàn)象可能是與該菌的生物被膜形成能力較強(qiáng)有關(guān)。對(duì)該菌的生物被膜形成周期的研究表明，在30 ℃時(shí)該菌的生物被膜成熟期較短，在6～8 h內(nèi)就能夠形成較多的生物被膜[13]；而6～8 h的培養(yǎng)時(shí)間屬于細(xì)菌的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)初期，此時(shí)的菌密度相對(duì)穩(wěn)定期仍然較低。在該菌數(shù)量較低的初始階段就應(yīng)注意防控其生物被膜的形成。

圖3 不同菌液濃度對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.3 Effect of bacteria concentration on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.3 pH對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響

生物被膜作為其內(nèi)部微生物的保護(hù)性外殼，被生物被膜包裹在內(nèi)部的被膜菌比浮游菌能夠更好地抵抗極端pH壓力[24]。生物被膜菌適應(yīng)極端酸性環(huán)境的原因可能與極端酸性pH條件下酸和重金屬的結(jié)合導(dǎo)致生物被膜胞外復(fù)合物組成發(fā)生顯著改變有關(guān)[25]本研究以浮游菌為起點(diǎn)測(cè)定了不同pH對(duì)其生物被膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基pH的變化對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成有較大影響，如圖4所示。隆德假單胞菌的生物被膜形成量隨培養(yǎng)基的pH升高呈現(xiàn)先出現(xiàn)倒V形變化趨勢(shì)，在pH低于4.0或大于10.0時(shí)基本不生長(zhǎng)，無生物被膜形成。在pH為8.0時(shí)，隆德假單胞菌的生物被膜產(chǎn)生量均達(dá)到最高值。這表明隆德假單胞菌在偏弱堿性的條件下能夠較好地形成生物被膜，而在過酸或過堿的環(huán)境中其生長(zhǎng)和生物被膜的形成受到抑制。細(xì)菌形成生物被膜有利于抵抗偏酸的環(huán)境，但是當(dāng)pH偏離細(xì)菌正常代謝的適宜條件時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝整體受到了抑制[26]。因此pH對(duì)細(xì)菌生物被膜形成的影響或者生物被膜菌對(duì)pH的適應(yīng)范圍，與細(xì)菌對(duì)酸堿環(huán)境的實(shí)用功能能力密切相關(guān)。變形鏈球菌（Streptococcus mutans）、茸毛鏈球菌（Streptococcus sobrinus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的生物膜量在pH為7.0～7.5時(shí)最大，而在pH為5.0或5.5時(shí)因菌落數(shù)低于在較高pH的菌落數(shù)而生物被膜量較小[27]。而對(duì)于創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）分別在pH為5.5、7.5和8.5培養(yǎng)時(shí)，野生型菌株和分離得到的致病菌株都在pH5.5時(shí)觀察到更高的生物膜產(chǎn)量[28]。

圖4 不同pH對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.4 Effect of pH on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.4 葡萄糖濃度對(duì)生物被膜形成的影響

環(huán)境或食品基質(zhì)中糖含量對(duì)其中的微生物的生長(zhǎng)代謝有較大影響。對(duì)于隆德假單胞菌，當(dāng)TSB培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度為0.25%、0.50%和0.75%時(shí)，其生物被膜的形成量無顯著差異（P＞0.05），但當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到1.25%以上時(shí)，隆德假單胞菌的生物被膜產(chǎn)生量顯著降低（P＜0.05）（如圖5所示）。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.25%、4.25%、6.25%和8.25%時(shí)，隆德假單胞菌生物被膜的形成量無顯著差異（P＞0.05）。這表明低濃度的葡萄糖環(huán)境對(duì)隆德假單胞菌生物被膜的形成沒有影響，而高于1.25%的葡萄糖濃度形成了較高的滲透壓，抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制了隆德假單胞菌生物被膜的形成。

圖5 不同葡萄糖濃度對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.5 Effect of glucose concentration on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.5 NaCl 添加量對(duì)生物被膜形成的影響

NaCl添加量對(duì)隆德假單胞菌生物被膜的生長(zhǎng)有明顯的影響，如圖6所示。隨著TSB培養(yǎng)基中NaCl添加量的增加，隆德假單胞菌生物被膜的形成量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在NaCl的添加量在1%～3%時(shí)，該菌的生物被膜形成量之間無顯著差異（P＞0.05），與沒有在培養(yǎng)基中額外添加NaCl的培養(yǎng)條件相比（圖3，OD600=0.5）也無顯著差異（P＞0.05）。在添加的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于3%后，其生物被膜形成量隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而降低；添加的NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在6%及以上時(shí)，隆德假單胞菌幾乎沒有形成生物被膜，其生物被膜形成量與無菌空白對(duì)照無差異。這可能是因?yàn)樵?%和5%的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下隆德假單胞菌的生長(zhǎng)受到了一定的抑制；而NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過6%時(shí)，該菌的生長(zhǎng)完全受到了高滲透壓的抑制。但也有研究指出，部分隆德假單胞菌具有較高的耐鹽性，在9% NaCl濃度下仍然能夠生長(zhǎng)[11]。

圖6 NaCl添加量對(duì)隆德假單胞菌的生物被膜形成的影響Fig.6 Effect of the addition of NaCl on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.6 Mg2+ 對(duì)生物被膜形成的影響

低濃度的Mg2+對(duì)部分細(xì)菌的生物被膜形成有促進(jìn)作用[29]，Mg2+對(duì)細(xì)菌生物被膜的結(jié)構(gòu)也有影響。對(duì)于隆德假單胞菌，不添加Mg2+與Mg2+添加量為0.25%試驗(yàn)組對(duì)比，其生物被膜形成量無顯著差異（P＞0.05），如圖7所示。這表明在此濃度區(qū)間內(nèi)，Mg2+的添加量對(duì)隆德假單胞菌生物被膜的生長(zhǎng)無顯著影響。當(dāng)Mg2+的添加量超過0.50%后，生物被膜量顯著降低（P＜0.05），且Mg2+濃度為0.50%時(shí)，隆德假單胞菌生物被膜形成量最少，與其他各組均有顯著差異（P＜0.05）。這表明，在測(cè)試范圍內(nèi)，低濃度的Mg2+對(duì)隆德假單胞菌生物被膜的形成有促進(jìn)，高濃度的Mg2+對(duì)隆德假單胞菌生物被膜的形成有一定抑制作用；高于本研究中的Mg2+對(duì)該菌生物被膜形成的影響趨勢(shì)仍需要進(jìn)一步研究。對(duì)于部分細(xì)菌，高濃度的Mg2+脅迫可能通過抑制pilV和pilW基因表達(dá)，減少IV型菌毛形成，進(jìn)而減弱細(xì)菌的附著能力和運(yùn)動(dòng)能力，使細(xì)菌生物膜變得更薄、更松散，最終減少了生物膜的形成[30]。對(duì)于流動(dòng)的物料體系，在流體動(dòng)力學(xué)模擬下，低濃度的Mg2+有利于銅綠假單胞菌（Pse. aeruginosa）形成生物被膜，增加其在流動(dòng)工程系統(tǒng)下游的定植；而高M(jìn)g2+濃度可能會(huì)使銅綠假單胞菌的生物膜轉(zhuǎn)向粘塑性機(jī)械狀態(tài)，這導(dǎo)致對(duì)臨界剪切應(yīng)力的特征響應(yīng)，生物膜變脆例而容易撕裂或脫落[31]。

圖7 不同Mg2+濃度下隆德假單胞菌的生物被膜產(chǎn)生量Fig.7 Effect of the concentration of Mg2+ on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.7 隆德假單胞菌在不銹鋼表面的黏附

部分細(xì)菌在不銹鋼食品加工設(shè)備表面能夠形成生物被膜，被膜菌則會(huì)對(duì)食品造成持續(xù)的污染。實(shí)驗(yàn)觀察了隆德假單胞菌在不銹鋼表面的黏附情況。通過激光共聚焦顯微鏡的觀察研究發(fā)現(xiàn)，該菌在304不銹鋼表面能夠形成較致密的生物被膜（如圖8A），其在不銹鋼表面形成的生物被膜能夠較致密地黏附在不銹鋼接觸面，其生物被膜厚度達(dá)到50 μm以上，且具有一定的蘑菇樣立體結(jié)構(gòu)（圖8B和圖8C），符合典型的細(xì)菌生物被膜結(jié)構(gòu)特征。有研究指出熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）在不銹鋼表面能夠快速黏附并形成生物被膜[32]。該菌在不銹鋼表面形成生物被膜的能力與熒光假單胞菌類似。這表明隆德假單胞菌具有在食品加工的金屬設(shè)備表面形成生物被膜并造成污染的潛力。

圖8 隆德假單胞菌在304不銹鋼表面形成生物被膜的激光共聚焦顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.8 CLSM images of biofilm structures and the development of polysaccharides of Pse. lundensis

3 結(jié)論

本文研究了不同環(huán)境條件對(duì)隆德假單胞菌生物被膜形成能力的影響。隆德假單胞菌能夠在較低的接種密度下形成生物被膜，其生物被膜形成能力受營養(yǎng)條件、葡萄糖濃度、pH、NaCl濃度、Mg2+等環(huán)境因子的影響。該菌在pH為8.0的弱堿性的條件下形成生物被膜量最多。1.25%以上的葡萄糖濃度、4%以上的NaCl濃度和0.5%的Mg2+濃度能夠顯著抑制隆德假單胞菌生物被膜的形成（P＜0.05），同時(shí)，該菌在一定濃度下具有在不銹鋼表面形成典型生物被膜的能力。本研究結(jié)果為調(diào)節(jié)食品加工環(huán)境，防控隆德假單胞菌生物被膜形成提供了理論支持。