毛殼霉木聚糖酶B（CsXyn11B）的分泌表達(dá)及其在面包中的應(yīng)用

楊 行，馬俊文，李延嘯，江正強(qiáng)，劉學(xué)強(qiáng)，閆巧娟,

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100083）

木聚糖酶（β-1,4-xylanase，EC 3.2.1.8）是木聚糖降解酶系中最重要的一種，以內(nèi)切的方式隨機(jī)水解木聚糖主鏈上的β-1,4-糖苷鍵，廣泛的應(yīng)用于低聚木糖生產(chǎn)、面制品、麥芽糖化和果汁澄清等食品領(lǐng)域[1]。微生物天然發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力較低，純化步驟復(fù)雜，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)。利用基因工程手段將木聚糖酶進(jìn)行基因克隆和異源表達(dá)能夠提高木聚糖酶活力[2]。畢赤酵母是一種甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，內(nèi)無天然質(zhì)粒，外源木聚糖酶基因通過載體與畢赤酵母染色體同源重組形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，實(shí)現(xiàn)外源基因表達(dá)。該表達(dá)系統(tǒng)具有菌體繁殖快，分泌表達(dá)水平高且適用于高密度發(fā)酵等特點(diǎn)[3]。目前已有多種木聚糖酶基因在畢赤酵母中成功分泌表達(dá)，如嗜熱單胞菌（Thermobifida fusca）YX木聚糖酶rXyn11A的產(chǎn)酶表達(dá)水平為1157.6 U/mL[4]，雙孢霉（Bispora sp.MEY-1）木聚糖酶產(chǎn)酶表達(dá)水平為73400 U/mL，這也是迄今文獻(xiàn)中報(bào)道木聚糖酶的最高表達(dá)水平[5]。

木聚糖酶的最適pH、最適溫度、底物特異性和水解特性等性質(zhì)的不同決定了它們適用于不同食品領(lǐng)域。小麥面粉作為面制品的主要原料之一，其中含有2%～4%的阿拉伯木聚糖[6]。阿拉伯木聚糖分為水溶性阿拉伯木聚糖（Water extractable arabinoxylan，WEAX）和水不溶性阿拉伯木聚糖（Water unextractable arabinoxylan，WUAX），其中WUAX的含量約為70%～75%，在面包制作過程中會(huì)干擾面筋網(wǎng)絡(luò)的形成，導(dǎo)致面包體積變小，質(zhì)地、口感變差[7]。在面包制作中添加木聚糖酶能夠改善面包品質(zhì)，對(duì)小麥阿拉伯木聚糖（Wheat arabinoxylan，WAX）特異性降解能力強(qiáng)的木聚糖酶可以將部分WUAX水解成WEAX，能夠增加面團(tuán)的延展性和彈性。當(dāng)二者比例適當(dāng)時(shí)能夠與其他組分發(fā)生氧化凝膠作用，增強(qiáng)面團(tuán)持水性。最終面包的比容增大，硬度降低，相同時(shí)間下面包老化緩慢[8]。已有研究中，木聚糖酶對(duì)WAX的底物特異性普遍較低，如黑曲霉（Aspergillus niger）BCC 14405木聚糖酶（169 U/mg）[9]、丙酸帕盧迪桿菌（Paludibacter propionicigenes）木聚糖酶（181 U/mg）[10]和蟲草屬（Talaromyces leycettanus）木聚糖酶（3.5 U/mg）[11]。發(fā)掘?qū)AX具有高底物特異性的木聚糖酶對(duì)烘焙行業(yè)具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)室前期在土壤中分離鑒定得到一株具有高木質(zhì)纖維素分解能力的嗜熱絲狀真菌毛殼霉CQ31，從中發(fā)掘出一個(gè)對(duì)阿拉伯木聚糖具有較高比酶活的GH11家族木聚糖酶CsXyn11B[12]。本研究對(duì)該基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在畢赤酵母中分泌表達(dá)，提高其木聚糖酶表達(dá)量。該基因?qū)Π⒗揪厶堑谋让富畲蠓岣?，能夠高效水解食品原料中的阿拉伯木聚糖，提高食品品質(zhì)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其在面包烘焙中的潛在應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛殼霉 由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏；畢赤酵母GS115 購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司，載體pPIC9K購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；櫸木木聚糖、樺木木聚糖、燕麥木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖 美國(guó)Sigma公司；除特殊說明外，本實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析級(jí)試劑。

AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)Mettler Toledo公司；Sun-Mate醒發(fā)箱、電烤箱和模具烤盤 江蘇三麥?zhǔn)称窓C(jī)械有限公司；質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木聚糖酶基因的克隆與表達(dá) 利用在線軟件SignalP4.1（ http://www. cbs.dtu. dk/services/signalP）分析毛殼霉CQ31木聚糖酶B（CsXyn11B）信號(hào)肽編碼序列。采用ExPASy ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)，使用DNAWorks對(duì)該基因密碼子優(yōu)化。根據(jù)密碼子優(yōu)化后的重組CsXyn11B基因序列，設(shè)計(jì)上游引物CsXyn11BUP（5” CCGGAATTCCGTCCATTCGAT TTTTTGGACG 3” ）和下游引物CsXyn11BDN（5” ATA AGAATGCGGCCGCTCAGTGGGTCTGCACGTA GATGTC 3” ）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切后與載體pPIC9K連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9KCsXyn11B，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalI線性化，電轉(zhuǎn)化得到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。

電轉(zhuǎn)化液體涂布于MD平板培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)3 d后洗脫、重懸。涂于含有不同質(zhì)量濃度G418（0.5～4.0 mg/mL）的YPD-G418平板培養(yǎng)基上。30 ℃下培養(yǎng)2～5 d。挑取單菌落于BMGY培養(yǎng)基30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)1 d。吸取菌液于BMMY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min誘導(dǎo)3 d，每24 h加入0.5%甲醇（v/v）。誘導(dǎo)3 d后測(cè)定木聚糖酶活力，篩選產(chǎn)木聚糖酶活力最高的轉(zhuǎn)化子。

1.2.2 高密度發(fā)酵產(chǎn)毛殼霉木聚糖酶B（CsXyn11B）參照畢赤酵母發(fā)酵手冊(cè)（VersionB，053002，Invitrogen）將菌液接種于150 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為10.0左右。發(fā)酵罐中加入1.5 L BSM發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，種子液中加入6.6 mL痕鹽溶液，利用濃氨水調(diào)節(jié)pH至4.0后加入種子液。于轉(zhuǎn)速600 r/min、通氣量1.0 vvm下發(fā)酵24 h至甘油耗盡。向發(fā)酵罐中流加甘油，直至菌體濕重達(dá)到180～220 g/L之間。饑餓30 min后，調(diào)節(jié)pH至6.0、轉(zhuǎn)速800 r/min。流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，保持DO＞20%。發(fā)酵過程中每隔12 h取樣測(cè)定菌體濕重、蛋白質(zhì)含量和木聚糖酶活力。

1.2.3 木聚糖酶CsXyn11B的純化 粗酶液離心后收集上清液，在20 mmol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液中透析，然后以0.5 mL/min流速上樣至Q-Sepharose FF層析柱。采用快速蛋白液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行純化，以含有0～500 mmol/L NaCl的緩沖液（20 mmol/L pH8.0 Tris-HCl）線性洗脫10個(gè)柱體積，流速為1 mL/min，收集具有木聚糖酶活力的洗脫液。收集液在20 mmol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液中4 ℃透析過夜，SDS-PAGE驗(yàn)證木聚糖酶的純度，SDSPAGE電泳方法參照Laemmli進(jìn)行[13]。

1.2.4 木聚糖酶的活力和蛋白質(zhì)含量測(cè)定 木聚糖酶的活力測(cè)定采用DNS法[14]。在900 μL（1%，w/v）櫸木木聚糖底物中加入100 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）稀釋后的酶液，65 ℃反應(yīng)10 min，加1 mL DNS終止反應(yīng)。沸水加熱15 min，加1 mL 40%酒石酸鉀鈉，冷卻后在540 nm下測(cè)吸光值。木聚糖酶的活力定義：在以上反應(yīng)條件下每分鐘生成1 μmol木糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。

蛋白含量測(cè)定：參照Lowry等[15]方法測(cè)定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，福林酚甲A液和福林酚甲B液按50:1混合，100 μL酶液適當(dāng)稀釋后添加于1 mL福林酚甲混合液中。輕微振蕩后室溫靜置10 min，加入100 μL福林酚乙液，振蕩后于37 ℃保溫30 min后在OD650處測(cè)定吸光度值計(jì)算蛋白含量。

1.2.5 CsXyn11B的最適pH和最適溫度 最適pH的測(cè)定：采用50 mmol/L pH3.0～10.0范圍內(nèi)的不同緩沖液，按標(biāo)準(zhǔn)的方法于65 ℃下測(cè)定木聚糖酶活力，以最大值為100%，計(jì)算各pH下的相對(duì)酶活力。

最適溫度的測(cè)定：在45～80 ℃范圍內(nèi)，在50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）中按標(biāo)準(zhǔn)的方法測(cè)定木聚糖酶活力，以最大值為100%，計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力。

1.2.6 CsXyn11B的底物特異性與水解特性分析配制不同木聚糖底物（1%，w/v），按1.2.4中描述的方法測(cè)定酶活力。以CsXyn11B對(duì)櫸木木聚糖的比酶活力為100%，計(jì)算不同聚糖底物下CsXyn11B的比酶活力和相對(duì)酶活力。木聚糖底物包括：樺木木聚糖、櫸木木聚糖、燕麥木聚糖和阿拉伯木聚糖。

用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）配制櫸木木聚糖溶液和阿拉伯木聚糖溶液（1%，w/v）。60 ℃下，加入CsXyn11B（5 U/mL）水解，定時(shí)取樣后沸水中滅活3 min。冷卻離心取上清液，以木糖和低聚木糖作為對(duì)照進(jìn)行薄層層析（TLC）分析，展層劑為正丁醇、冰醋酸和水的混合溶液（體積比為2:1:1），顯色劑為甲醇與濃硫酸的混合液（體積比為95:5）。

1.2.7 CsXyn11B在面包中的應(yīng)用 面包制作方法：500 g面粉，6 g酵母，5 g鹽，50 g白糖，290 g水與純化后的木聚糖酶CsXyn11B（1～5 ppm）混勻，以不加木聚糖酶的面包為對(duì)照組。低速和面2 min，高速3 min，加入4%黃油后低速和面2 min，高速3 min，靜置5 min。分割（150 g/個(gè)）滾圓再靜置15 min后整形、裝盤。于38 ℃，80%相對(duì)濕度，醒發(fā)90 min。醒發(fā)好的面坯于面火180 ℃，底火200 ℃，烘烤20 min。烘烤結(jié)束后，將面包放在室溫冷卻2 h后裝入保鮮袋密封。

通過油菜籽置換法測(cè)定其體積，計(jì)算面包的比容。將面包切成厚度為20 mm的薄片，采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定面包芯的硬度。測(cè)試速度1 mm/s，壓縮程度40%，感應(yīng)力0.5 N。通過測(cè)定烘焙當(dāng)天面包硬度和4 ℃冰箱貯藏2 d后面包硬度觀察木聚糖酶CsXyn 11B對(duì)面包老化的作用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖片處理均采用Origin 8.0進(jìn)行，數(shù)據(jù)均為3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛殼霉木聚糖酶B（CsXyn11B）的基因克隆和分泌表達(dá)

毛殼霉重組木聚糖酶B（CsXyn11B）的基因序列長(zhǎng)684 bp，編碼227個(gè)氨基酸，在N端含有19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列。預(yù)測(cè)該酶的等電點(diǎn)為6.5，分子量為25.2 kDa。優(yōu)化后的密碼子適應(yīng)數(shù)值從0.52提高到0.96，G+C的含量由65.05%下降到49.77%。PCR擴(kuò)增得到的CsXyn11B基因序列，經(jīng)雙酶切后連接到載體中，得到重組質(zhì)粒pPIC9KCsXyn11B。重組質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ線性化，電轉(zhuǎn)化得到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)化子對(duì)G418抗性不同進(jìn)行高拷貝篩選，得到一株產(chǎn)胞外木聚糖酶活力最高為32 U/mL的菌株。

2.2 高密度發(fā)酵產(chǎn)毛殼霉木聚糖酶B（CsXyn11B）及純化

篩選得到的菌株在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵156 h后，發(fā)酵上清液木聚糖酶酶活力達(dá)2788 U/mL，蛋白含量達(dá)4.8 mg/mL，菌體濕重達(dá)434.4 g/L（圖1）。

圖1 CsXyn11B高密度發(fā)酵歷程Fig.1 Time-course profile of CsXyn11B high cell-density fermentation

目前已有許多種木聚糖酶在畢赤酵母中高效表達(dá)。重組木聚糖酶B（CsXyn11B）通過密碼子優(yōu)化的方法進(jìn)一步提高在畢赤酵母中的分泌表達(dá)水平（2788 U/mL），比毛殼霉天然發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力（131 U/mL）提高21.3倍[12]。該水平高于嗜熱棒狀桿菌（Corynascus thermophilus）（2000 U/mL）[16]、鏈霉菌（Streptomycessp.）FA1（1374 U/mL）[17]和樟絨枝霉（Malbranchea cinnamomea）（573 U/mL）[18]木聚糖酶分泌表達(dá)水平，低于同屬毛殼霉CQ31的嗜熱木聚糖酶CsXyn10Aop（10017 U/mL）[19]。

CsXyn11B經(jīng)QSFF強(qiáng)陰離子交換層析柱純化得到電泳級(jí)純酶（圖2），該酶分子量約為25.1 kDa，在電泳圖上顯示為一條清晰條帶。純酶液相較于粗酶液的比酶活從320 U/mg提高到1464 U/mg，純化倍數(shù)為4.6，回收率96%。

圖2 木聚糖酶CsXyn11B純化電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of the purified CsXyn11B

2.3 CsXyn11B的基本酶學(xué)性質(zhì)

不同pH下CsXyn11B的相對(duì)酶活如圖3a所示，該重組木聚糖酶最適pH為8.0。不同溫度下CsXyn11B的相對(duì)酶活如圖3b所示，該重組木聚糖酶最適溫度為65 ℃。

不同來源的木聚糖酶最適pH有明顯差異，真菌木聚糖酶多為酸性木聚糖酶。畢赤酵母表達(dá)后的CsXyn11B比毛殼霉天然發(fā)酵的木聚糖酶更耐堿，最適pH由7.5升至8.0，同時(shí)在偏堿性環(huán)境下的相對(duì)酶活力更高[12]。CsXyn11B的最適pH8.0（圖3a）屬于堿性木聚糖酶，高于大多數(shù)真菌木聚糖酶，如來源于銅綠擬青霉（Paecilomyces aerugineus）（pH5.5）[20]、厭氧瘤胃真菌（Anaeromyces robustus）（pH5.5）[21]和棘孢木霉（Trichoderma asperellum）（pH5.0）[22]的木聚糖酶。低于少數(shù)真菌木聚糖酶如來源于冰河藻（Planomicrobium glaciei）（pH9.0）[23]和魚曲霉（A.fischeri）（pH9.0）[24]的木聚糖酶。大多數(shù)真菌木聚糖酶的最適溫度在50～60 ℃。CsXyn11B的最適溫度65 ℃（圖3b）高于多數(shù)真菌木聚糖酶，如來源于裂褶菌（Schizophyllum commune）（55 ℃）[25]、棘孢木霉（T.asperellum）（50 ℃）[22]和畢赤酵母表面展示木聚糖酶（sdLeXyn）（50 ℃）[26]，更適合在烘焙食品中應(yīng)用。但仍不及一些嗜熱真菌木聚糖酶，如同屬于毛殼霉木聚糖酶CsXyn11A（70 ℃）[27]和毛殼霉木聚糖酶CsXyn10Aop（85 ℃）[19]的木聚糖酶。

圖3 CsXyn11B的最適pH（a）和最適溫度（b）Fig.3 Optimal pH (a) and optimum temperature (b) of CsXyn11B

2.4 CsXyn11B的底物特異性和水解特性

CsXyn11B的底物特異性結(jié)果見表1，CsXyn11B對(duì)燕麥木聚糖的比酶活力最高，達(dá)1145.8 U/mg；其次分別為阿拉伯木聚糖（1041.7 U/mg）、櫸木木聚糖（692.3 U/mg）和樺木木聚糖（653.3 U/mg）。CsXyn11B能夠水解櫸木木聚糖，隨時(shí)間延長(zhǎng)，木三糖和聚合度較高的低聚木糖生成量不斷增加，木四糖的含量逐漸降低。最終產(chǎn)物以木二糖、木三糖和聚合度較高的寡糖為主（圖4）。水解阿拉伯木聚糖12 h后產(chǎn)物以木四糖、木五糖和木六糖為主，無木糖、木二糖和木三糖的生成（圖4）。

表1 CsXyn11B的底物特異性Table 1 Substrate specificity of CsXyn11B

圖4 CsXyn11B水解特性TLC分析Fig.4 TLC analysis of the hydrolysis products of beechwood xylan and arabinoxylanase by CsXyn11B

CsXyn11B對(duì)各種木聚糖底物的比酶活力與天然菌發(fā)酵木聚糖酶相比均有大幅提高（天然菌發(fā)酵木聚糖酶對(duì)燕麥木聚糖，櫸木木聚糖和樺木木聚糖的比酶活分別為510、449和397 U/mg）[12]。對(duì)阿拉伯木聚糖的比酶活達(dá)到1041.7 U/mg（天然菌307 U/mg），遠(yuǎn)高來源于綠色木霉（502 U/mg）[28]、溫泉宏基因組（61 U/mg）[29]以及羅氏根霉（20 U/mg）[30]的木聚糖酶。CsXyn11B能夠水解不同木聚糖生成低聚木糖，與其他木聚糖酶具有相似水解特性。銅綠擬青霉（P.aerugineus）木聚糖酶（PaXyn10A）水解櫸木木聚糖產(chǎn)物只有木二糖和木三糖[20]。丙酸帕盧迪桿菌木聚糖酶（PpXyn10A）水解木聚糖終產(chǎn)物以木二糖和木三糖為主[10]。

2.5 CsXyn11B在面包中的應(yīng)用

不同加酶量對(duì)面包性質(zhì)的影響見表2。與對(duì)照組相比CsXyn11B添加量為3 mg/kg時(shí)，面包比容增加15.9%，面包硬度降低25.3%，黏著性降低26.03%，咀嚼性降低24.64%，4 ℃貯藏2 d后面包硬度較對(duì)照組降低17%。

表2 CsXyn11B對(duì)面包品質(zhì)的影響Table 2 Effect of CsXyn11B on bread quality

木聚糖酶能夠水解面粉中的阿拉伯木聚糖生成阿拉伯木寡糖，降低面團(tuán)黏度，增強(qiáng)面團(tuán)的穩(wěn)定性，改善面包品質(zhì)；同時(shí)，產(chǎn)生的阿拉伯木寡糖可以在發(fā)酵過程中作為碳源，促進(jìn)酵母發(fā)酵產(chǎn)氣，從而增大面包體積，提高面包比容[31]。黏著性和與咀嚼性的變化趨勢(shì)與硬度一致，有研究表明面包的品質(zhì)與硬度，黏著性和咀嚼性呈負(fù)相關(guān)，較低的硬度，黏著性和咀嚼性可以提高面包口感[32]。迄今，已有一些木聚糖酶在面包中應(yīng)用的研究報(bào)道。子座木霉（T. stromaticum）[31]和Glaciecola mesophila[33]木聚糖酶可分別提高面包比容23.8%和26%。桔青霉木聚糖酶可以使面包硬度降低15%[34]。CsXyn11B對(duì)面包品質(zhì)的改善效果明顯，因此CsXyn11B在焙烤食品中具有良好的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本研究將毛殼霉CQ31 GH11家族木聚糖酶基因（CsXyn11B）在畢赤酵母中分泌表達(dá)，產(chǎn)酶水平是天然菌發(fā)酵的21.3倍（2788 U/mL）。該酶最適pH8.0，最適溫度65 ℃，對(duì)阿拉伯木聚糖具有高比酶活力（1041.7 U/mg）。進(jìn)一步研究其在面包烘焙中的應(yīng)用價(jià)值，添加3 mg/kg重組木聚糖酶CsXyn11B能夠明顯增大面包體積、減小面包硬度，降低黏著性和咀嚼性。同時(shí)降低了面包在4 ℃冰箱中貯藏的老化速度。本文提供了一種在烘焙食品加工中具有良好的應(yīng)用潛力的木聚糖酶。今后仍需發(fā)掘產(chǎn)酶水平高，對(duì)阿拉伯木聚糖比酶活力高的木聚糖酶，為木聚糖酶在烘焙食品和富含阿拉伯木聚糖的食品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。