甘薯黑斑病拮抗細(xì)菌抑菌性能及抑菌物質(zhì)鑒定

王智敏，馬金伶,2，孫兆勇,2，石瑩瑩，李東炎，石晶盈,

（1.山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018；2.山東省濟(jì)寧市汶上縣人民政府，山東濟(jì)寧 272500）

甘薯中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括多種必需氨基酸、維生素、膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)和功能成分[1-3]。但是，甘薯在采后貯藏過(guò)程中容易受病原微生物侵染造成腐爛損失，其中，由長(zhǎng)喙殼菌（Ceratocystis fimbriata）侵染引起的甘薯黑斑病是主要的病害之一，長(zhǎng)喙殼菌有很強(qiáng)的寄生能力，主要通過(guò)傷口侵染甘薯[4]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。另外，由于甘薯喜溫，低溫貯藏會(huì)使甘薯發(fā)生冷害[7-8]，需要在12 ℃以上進(jìn)行甘薯貯藏，但是此溫度下長(zhǎng)喙殼菌仍然可以生長(zhǎng)繁殖，因此，目前產(chǎn)業(yè)上多依賴化學(xué)殺菌劑如多菌靈等抑制黑斑病發(fā)生。但是，化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，容易造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等諸多問(wèn)題[9-10]。生物防治憑借無(wú)毒無(wú)害、無(wú)污染且無(wú)抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是有望降低化學(xué)殺菌劑使用量或替代化學(xué)殺菌劑的有效方法[11-12]。

拮抗微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)于果蔬采后病害控制有重要作用。綠葉假單胞菌（Pseudomonas adaceae）釋放的揮發(fā)性物質(zhì)中含有的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇和2-甲基-1-丁醇能有效抑制甘薯黑斑病的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)[13]。萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）HAB-5產(chǎn)生的烷烴、醇、酸等揮發(fā)性物質(zhì)，對(duì)炭疽菌有較高的抑制活性[14]。枯草芽孢桿菌（B. subtilis）CF-3的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物不僅能抑制褐腐菌的生長(zhǎng)，而且還激活了桃果實(shí)的抗病相關(guān)酶，誘導(dǎo)果實(shí)提高抗病性[15]。因此，利用拮抗微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物來(lái)抑制采后病害，成為采后病害生物防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

本研究對(duì)前期從甘薯表面和甘薯種植的土壤中分離到兩株對(duì)甘薯黑斑病有較強(qiáng)抑制作用的菌株解淀粉芽孢桿菌JK和克雷伯氏桿菌GK進(jìn)行抑菌性能分析[16]。通過(guò)熏蒸方法探究揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)甘薯的抑菌效果，通過(guò)氣相色譜-離子遷移譜（Gas chromatograph-ion mobility spectrometry，GC-IMS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對(duì)分離得到的兩株拮抗菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物組分進(jìn)行分析鑒定，同時(shí)在平板上篩選出對(duì)黑斑病抑制作用較強(qiáng)的成分，旨在為甘薯黑斑病的防治提供新的拮抗菌株資源，為開發(fā)新型、安全的防腐保鮮劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）JK、克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）GK、長(zhǎng)喙殼菌（Ceratocystis fimbriata） 均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院果蔬采后貯藏保鮮實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NB），制備方法參照Liu等[17]；己醛（Hexanal）、2-己酮（2-Hexanone）、乙酸丙酯（Propyl acetate）、2-壬酮（2-Nonanone）、異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）、甲基壬基甲酮（2-Undecanone）、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯（2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate）濃度分別為97%、99.5%、99%、99%、99%、99%、98.5% 購(gòu)于北京優(yōu)尼康生物科技有限公司和上海麥克林生化科技有限公司；甘薯品種為蘇薯8號(hào)采購(gòu)于山東省泰安市岱岳區(qū)，挑選成熟度一致、大小均勻、果色良好、沒(méi)有病蟲害且無(wú)機(jī)械傷的新薯進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

SJ-CJ-1D超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；ZQTY-70F恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；AL204電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；EPED-E2-20TF實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器 南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；8200氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS） 德國(guó)GAS公司；7010 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS） Agilent Technologies Inc。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌菌液熏蒸對(duì)甘薯黑斑病病斑擴(kuò)展抑制率的測(cè)定 將在NA平板上生長(zhǎng)良好的兩株拮抗菌JK、GK分別接種到1000 mL NB培養(yǎng)基中，在28 ℃180 r/min下培養(yǎng)48 h后，分別將1000 mL菌液倒入容積為20 L的密封罐的隔板下層，對(duì)照為相同體積的無(wú)菌水，隔板上層放置10個(gè)甘薯，用凡士林密封罐蓋，熏蒸1 h。在熏蒸后的甘薯果實(shí)上用打孔器打直徑為1 cm，高度為1 cm的圓孔，每個(gè)甘薯的同一面每間隔7～8 cm打一個(gè)孔，每個(gè)甘薯打三個(gè)圓孔，去除圓孔中的甘薯表皮，分別立即接種5×105個(gè)孢子囊/mL的長(zhǎng)喙殼菌孢子囊懸浮液20 μL[18]，對(duì)照組接種同上。每個(gè)處理重復(fù)三次，每次重復(fù)處理10個(gè)甘薯，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。于28±1 ℃ RH 90%條件下保濕貯藏，每5 d測(cè)量一次病斑，計(jì)算病斑擴(kuò)展抑制率。

抑制率（%）=（對(duì)照病斑直徑-處理病斑直徑）/對(duì)照病斑直徑×100

1.2.2 拮抗菌揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的測(cè)定

1.2.2.1 拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物GC-IMS測(cè)定 樣品預(yù)處理：將JK和GK分別接種于100 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)48 h后，分別吸取10 mL于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，對(duì)照為相同體積的NB培養(yǎng)基，每個(gè)處理重復(fù)兩次，分別記作JK1、JK2，GK1、GK2，CK1、CK2。

GC-IMS條件：色譜柱型號(hào)FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm，1 μm），IMS溫度45 ℃，色譜柱溫度40 ℃，分析時(shí)間20 min，載氣/漂移器N2，離子化模式為正離子模式，以β射線（氚，3H）進(jìn)行放射處理。

自動(dòng)頂空進(jìn)樣條件：進(jìn)樣體積為300 μL，孵育時(shí)間 10 min，孵育溫度40 ℃，進(jìn)樣針溫度45 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。載氣流速參照邵悅春等[19]設(shè)定，初始?xì)庀噍d氣流速為2 mL/min，保持2 min后，在10 min內(nèi)線性增至100 mL/min，在20 min內(nèi)線性增至150 mL/min。漂移氣流速為150 mL/min。

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)兩次，采用GC-IMS儀器配套的LAV（Laboratory Analytical Viewer）分析軟件對(duì)拮抗菌的揮發(fā)性氣味進(jìn)行采集和分析，利用LAV中的Reporter插件對(duì)比樣品之間的譜圖差異，Gallery Plot插件構(gòu)建指紋圖譜，直觀對(duì)比樣品之間的譜圖差異，采用Dynamic PCA插件對(duì)樣品進(jìn)行動(dòng)態(tài)主成分分析。同時(shí)根據(jù)特征性物質(zhì)保留時(shí)間和遷移時(shí)間計(jì)算每種揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)，通過(guò)GC-IMS Library Search中的NIST和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)揮發(fā)性代謝成分進(jìn)行定性分析。

1.2.2.2 拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物GC-MS測(cè)定 采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-SPME-GCMS）分離鑒定揮發(fā)性活性物質(zhì)的組分，并對(duì)平板抑菌活性進(jìn)行跟蹤。將JK和GK分別接種于100 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)48 h。將萃取頭在250 ℃進(jìn)樣口老化30 min。50 ℃條件下預(yù)熱10 min后，分別用65 μm PDMS/DVB和75 μm PDMS萃取纖維頭對(duì)JK和GK揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行頂空吸附，吸附時(shí)間30 min[20]。氣相色譜色譜柱為Rtx-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30.0 m×0.32 mm×0.25 μm），載氣為He，采用程序升溫的起始溫度為60 ℃，維持2 min，以5 ℃/min 的速率升溫至180 ℃，再以2 ℃/min的速率升溫至250 ℃，維持3 min，運(yùn)行時(shí)間 64 min。質(zhì)譜條件為：電子轟擊離子源及四級(jí)桿質(zhì)量檢測(cè)器，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，熱解析1 min，質(zhì)量掃描范圍45～500 m/z[21-22]。

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)兩次，色譜分離后，質(zhì)譜掃描每個(gè)色譜峰得到質(zhì)譜圖，所得質(zhì)譜信息經(jīng)計(jì)算機(jī)用標(biāo)準(zhǔn)NIST08質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)確定香氣物質(zhì)組分種類。用色譜峰面積歸一化法進(jìn)一步確定各物質(zhì)組分含量。

1.2.3 揮發(fā)性單物質(zhì)的抑菌作用分析 為驗(yàn)證兩株拮抗菌產(chǎn)生的主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)甘薯黑斑病病原菌的抑菌作用，通過(guò)分析兩株拮抗菌共同產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的測(cè)定結(jié)果（GC-IMS、GC-MS）以及結(jié)合各成分安全性分析和在食品中應(yīng)用現(xiàn)狀，選擇研究己醛（Hexanal）[23]、2-己酮（2-Hexanone）[24]、乙酸丙酯（Propyl acetate）[25]、2-壬酮（2-Nonanone）[26]，同時(shí)在GC-MS測(cè)定結(jié)果中選擇相對(duì)含量較高的物質(zhì)，并根據(jù)各成分安全性、實(shí)際應(yīng)用和購(gòu)買情況，選擇研究異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）[27]、甲基壬基甲酮（2-Undecanone）[28]、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯（2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate）[29]，因此購(gòu)買以上7種揮發(fā)性物質(zhì)純品分析其對(duì)病原菌的抑制情況，平板對(duì)扣法對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行抑菌效果的檢測(cè)。在NA平板培養(yǎng)基中央放置直徑為5 mm的無(wú)菌濾紙片，分別滴加20 μL的七種物質(zhì)（對(duì)照不滴加試劑），迅速與放置有直徑8 mm甘薯長(zhǎng)喙殼菌菌餅的PDA平板培養(yǎng)基對(duì)扣，封口膜密封。每個(gè)處理重復(fù)三次。28 ℃下培養(yǎng)96 h，每天觀察并測(cè)量病原菌的菌落直徑，并計(jì)算抑菌率[30-31]。

1.2.4 揮發(fā)性混合物質(zhì)的抑菌作用分析 將對(duì)甘薯黑斑病病原菌有較強(qiáng)抑菌作用的揮發(fā)性物質(zhì)己醛和2-壬酮按照1:1比例混合。在PDA平板培養(yǎng)基上放置直徑為8 mm的甘薯長(zhǎng)喙殼菌菌餅，在另一個(gè)NA平板培養(yǎng)基上放置直徑5 mm的無(wú)菌濾紙片，分別滴加50 μL不同濃度的揮發(fā)性混合物質(zhì)，濃度設(shè)定為0、100、200、1000 μL/L，將兩平板對(duì)扣，封口膜密封，28 ℃下培養(yǎng)72 h，每天觀察并測(cè)量病原菌的菌落直徑，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SigmaPlot 13.0軟件作圖、計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan” s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性（P＜0.05）水平檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌菌液熏蒸對(duì)甘薯黑斑病病斑擴(kuò)展的影響

如圖1所示，經(jīng)菌株JK和GK發(fā)酵液熏蒸處理后甘薯黑斑病發(fā)病時(shí)間明顯晚于對(duì)照，其中，拮抗菌JK發(fā)酵液熏蒸處理的薯塊對(duì)病斑的擴(kuò)展有較強(qiáng)的抑制作用，在處理薯塊15 d后，病斑擴(kuò)展的抑制率達(dá)61.29%；拮抗菌GK發(fā)酵液熏蒸薯塊15 d后，病斑擴(kuò)展的抑制達(dá)54.84%。表明兩種拮抗菌菌液中含有抑制甘薯黑斑病的揮發(fā)性代謝成分，且顯著（P＜0.05）抑制病原菌的生長(zhǎng)。同時(shí)大量研究也表明，細(xì)菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性成分對(duì)病原菌具有抑制作用[13-15]。如Xu等[32]研究表明用Bacillus tequilensisXK29的發(fā)酵液熏蒸甘薯后，對(duì)于甘薯黑斑病有明顯的抑制作用，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 菌株JK及GK揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)甘薯黑斑病病斑擴(kuò)展的影響Fig.1 Effects of volatile metabolites of strain JK and GK on disease development of black spot inoculated with C. fimbriata

2.2 拮抗菌揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的鑒定結(jié)果

2.2.1 GC-IMS測(cè)定的拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物

2.2.1.1 兩種拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物差異變化 三組樣品的GC-IMS譜圖如圖2所示，整個(gè)圖背景為藍(lán)色，橫坐標(biāo)1.0處紅色豎線為RIP峰（反應(yīng)離子峰，經(jīng)歸一化處理），RIP峰兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物。其中顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大，點(diǎn)越大顏色越深表明峰信號(hào)越強(qiáng)?？傮w來(lái)說(shuō)，兩種拮抗菌的揮發(fā)性有機(jī)物的遷移時(shí)間大都集中在1.0～1.5 ms區(qū)間內(nèi)，保留時(shí)間在100～300 s區(qū)間，兩種樣品的揮發(fā)性有機(jī)物在氣相保留時(shí)間300 s內(nèi)完成了GC-IMS分離。

圖2 三組樣品氣相色譜離子遷移譜譜圖Fig.2 GC-IMS of three groups of samples

為了進(jìn)一步比較不同樣品的差異，選取空白NB培養(yǎng)基CK對(duì)照為背景參照，其他樣品的譜圖扣減參比，若兩種拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物一致，則扣減后的背景為白色；若濃度高于參比，則扣減后的背景為紅色；若濃度低于參比，則扣減后的背景為藍(lán)色。從圖3可以看出以空白培養(yǎng)基作參比時(shí)，JK和GK譜圖中的背景顏色為藍(lán)色，表明揮發(fā)性有機(jī)物含量均比培養(yǎng)基中的揮發(fā)性有機(jī)物少，為更好比較揮發(fā)性有機(jī)物的變化情況，框選這些揮發(fā)性有機(jī)物的峰，形成樣品指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比。

圖3 三組樣品氣相色譜離子遷移譜差異圖Fig.3 Difference diagram of GC-IMS of three groups of samples

2.2.1.2 兩種拮抗菌中揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜對(duì)比

由圖4和表1所示，區(qū)域A1中標(biāo)出的物質(zhì)正辛醇（1-Octanol）、甲基環(huán)戊烯醇酮（2-Cyclopenten-1-one-2-hydroxy-3-methyl）、羥基丙酮（Hydroxyacetone）、3-甲基丁醛（3-Methylbutanal）、2-辛酮（2-Octanone）、糠醇（2-Furanmethanol）、4-羥基丁酸內(nèi)酯（Gammabutyrolactone）、2-甲基吡嗪（2-Methylpyrazine）、3-甲基-3-丁烯-1-醇（3-Methyl-3-buten-1-ol）、2-甲基丁酸甲酯（Methyl-2-methylbutanoate）、2-甲基丙醛（2-Methylpropanal）等物質(zhì)僅在培養(yǎng)中存在，在兩株拮抗菌中未發(fā)現(xiàn)，可作為培養(yǎng)基的特征標(biāo)記物，原因可能是被拮抗菌作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在生長(zhǎng)過(guò)程中被消耗，或者是拮抗菌生長(zhǎng)抑制這些物質(zhì)的揮發(fā)。區(qū)域A2中標(biāo)出的1、8、9、27、32、36（未定性出）等物質(zhì)在培養(yǎng)基中含量最高，在兩株拮抗菌中含量較少。區(qū)域B標(biāo)出的物質(zhì)在培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)，在兩株拮抗菌中存在，但含量不同。區(qū)域C中物質(zhì)為JK的特征揮發(fā)性有機(jī)物，如丁酸（Butanoic acid）、異戊醇（Isoamyl alcohol）、3-甲基-1-丁醇（3-Methyl-1-butanol）等，在培養(yǎng)基和GK中均未發(fā)現(xiàn)。區(qū)域D中標(biāo)出的物質(zhì)如乙酸丙酯（Propyl acetate）、2-己酮（2-Hexanone）、己醛（Hexanal）在GK中含量高于對(duì)照和JK菌株。由于有些物質(zhì)在GC-IMS數(shù)據(jù)庫(kù)中未能定性，所以有必要結(jié)合GC-MS進(jìn)行定性。

圖4 通過(guò)GC-IMS檢測(cè)出的兩種拮抗菌中揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜對(duì)比Fig.4 Comparison of fingerprints of volatile organic compounds from two antagonistic bacteria by GC-IMS

表1 兩種拮抗菌及NB培養(yǎng)基揮發(fā)性有機(jī)物定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile organic compounds in two antagonistic and Nutrient Broth

2.2.1.3 兩種拮抗菌中揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜主成分分析 根據(jù)圖4構(gòu)建的兩種拮抗菌揮發(fā)性產(chǎn)物指紋圖譜，采用Dynamic PCA插件進(jìn)行PCA處理，比較2種拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的差異，如圖5所示，培養(yǎng)基和兩種拮抗菌分據(jù)PCA圖的兩側(cè)，區(qū)分非常明顯，兩種拮抗菌差異區(qū)分亦非常明顯，分據(jù)PCA兩端。

圖5 兩種拮抗菌和NB培養(yǎng)基所產(chǎn)揮發(fā)性成分的PCAFig.5 PCA of the volatile compounds from the two antagonistic bacteria and Nutrient Broth

2.2.2 GC-MS測(cè)定的拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物 如表2所示，在 GC-MS分析后，對(duì)測(cè)得的每種化合物依據(jù)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)比及相對(duì)保留值進(jìn)行定性，去除對(duì)照組中含有的物質(zhì)后，JK和GK所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)分別為17和9種（其中兩種萃取頭測(cè)定出的相同物質(zhì)，以峰面積大的萃取頭為準(zhǔn)），屬于酮類、烷類、醇類、酯類、醛類等物質(zhì)，這與Rajaofera等[14]的報(bào)道一致，萎縮芽孢桿菌HAB-5發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物也主要包括烷烴、烯烴、醇類和有機(jī)酸。其中十四甲基六硅氧烷（Hexasiloxane, tetradecamethyl-）和2-壬酮（2-Nonanone）是菌株JK和GK揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中共有的物質(zhì)，峰面積分別為3.98%和1.22%。

表2 菌株JK和GK揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的主要成分及相對(duì)含量Table 2 Relative content of main volatile components of strain JK and GK

2.3 揮發(fā)性單物質(zhì)的抑菌作用

如表3所示，七種物質(zhì)中異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）對(duì)病原菌的抑制率最高，能完全抑制病原菌的生長(zhǎng)，己醛（Hexanal）、2-壬酮（2-Nonanone）和2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯（2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate）的抑菌率分別為93.15%、81.19%和58.62%，對(duì)病原菌的抑制效果較好，但是2-己酮（2-Hexanone）、甲基壬基甲酮（2-Undecanone）和乙酸丙酯（Propyl acetate）抑菌作用較弱。

表3 七種揮發(fā)性單物質(zhì)對(duì)甘薯黑斑病病原菌的抑制作用Table 3 Antifungal activity of seven compounds against C. fimbriata

2.4 揮發(fā)性混合物質(zhì)的抑菌作用

異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）能完全抑制甘薯黑斑病病原菌的生長(zhǎng)，其次是己醛（Hexanal）和2-壬酮（2-Nonanone）?？紤]到己醛和2-壬酮的安全性高，常被用作食品添加劑，同時(shí)在果蔬病害的防治上已有明顯的效果。此前有研究者發(fā)現(xiàn)用己醛熏蒸香蕉果實(shí)后，在800 ppm濃度下，香蕉果實(shí)的炭疽菌和焦腐病菌兩種病原菌的菌絲生長(zhǎng)被完全抑制[23]。同時(shí)Romina等[26]發(fā)現(xiàn)2-壬酮能明顯抑制灰霉病菌的生長(zhǎng)。因此結(jié)合安全性和實(shí)際應(yīng)用效果選擇將己醛和2-壬酮兩者混合后探究其抑菌效果。如圖6所示，當(dāng)混合液濃度為100、200、1000 μL/L時(shí)對(duì)甘薯黑斑病病原菌的生長(zhǎng)均有很強(qiáng)的抑制作用。在培養(yǎng)72 h后，100 μL/L的混合物濃度抑菌率達(dá)到70%，濃度為200 μL/L時(shí)，菌斑直徑不再增加，病原菌停止生長(zhǎng)。

圖6 不同濃度的混合揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)甘薯黑斑病病原菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Inhibition of different concentrations of the artificial mixture of volatile metabolites on the growth of C. fimbriata

3 討論與結(jié)論

與化學(xué)殺菌劑相比較，生物防治被認(rèn)為是一種安全高效的防治手段。Bu等[33]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌L1-21對(duì)番茄的灰霉病有明顯的抑制作用。Mu等[34]的研究結(jié)果表明，從土壤中分離到的萎縮芽孢桿菌J-1可以有效控制蘋果輪紋病。本研究從甘薯表面及甘薯地土壤中分離到兩株對(duì)甘薯黑斑病有較強(qiáng)抑制作用的菌株解淀粉芽孢桿菌JK和克雷伯氏桿菌GK，可產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌成分。

許多研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物能夠作用于果蔬，抑制病原菌的生長(zhǎng)，延緩果蔬發(fā)病。Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌ZD01發(fā)酵產(chǎn)生的6-甲基-庚酮對(duì)馬鈴薯上的茄鏈格孢菌有明顯抑制作用。Xu等[32]發(fā)現(xiàn)特基拉芽孢桿菌發(fā)酵能產(chǎn)生21中揮發(fā)性化合物，其中異戊酸、異丁酸和2-甲基丁酸能有效抑制甘薯長(zhǎng)喙殼菌的生長(zhǎng)。本研究分別用JK和GK發(fā)酵液熏蒸處理甘薯果實(shí)后，發(fā)現(xiàn)熏蒸后出現(xiàn)病斑的時(shí)間晚于對(duì)照，同時(shí)期內(nèi)病斑直徑顯著小于對(duì)照，說(shuō)明兩株拮抗菌發(fā)酵其產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可有效的抑制黑斑病，延緩甘薯薯塊發(fā)病。通過(guò)GC-IMS和GC-MS對(duì)菌株JK和GK的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性物質(zhì)主要有酮類、烷類、醇類、酯類、醛類等物質(zhì)。經(jīng)過(guò)平板抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)己醛、2-壬酮、異辛醇和2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯是抑制黑斑病的主要?dú)怏w成分，己醛和2-壬酮對(duì)黑斑病的抑制率分別為93.15%和81.19%，將兩者按照1:1的比例混合后，混合液濃度為100 μL/L時(shí)，對(duì)甘薯黑斑病病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到70%，濃度高于200 μL/L時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)。

芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中除了可以產(chǎn)生具有抑菌作用的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物之外，發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌也有抑制作用。汪靜杰等[36]研究發(fā)現(xiàn)篩選到的拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵濾液中含有明顯抑制球孢白僵菌的物質(zhì)，經(jīng)提取鑒定后，確定有效成分為芬枯草菌素和伊枯草菌素。Zhang等[37]發(fā)現(xiàn)從番茄根際中分離到的解淀粉芽孢桿菌對(duì)多種植物病原菌有廣譜抑菌性，鑒定抑菌物質(zhì)為伊枯草素和芬枯草菌素，說(shuō)明發(fā)酵菌液中含有能抑制真菌生長(zhǎng)的物質(zhì)。因此在后續(xù)研究中可以對(duì)分離到的兩株拮抗菌中的活性物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本研究中的兩株拮抗菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，繁殖速度快，產(chǎn)生的揮發(fā)代謝產(chǎn)物對(duì)于黑斑病有較強(qiáng)的抑制效果，在甘薯采后病害控制中有一定的應(yīng)用前景，為減少化學(xué)殺菌劑的使用提供了新途徑。