靶向超聲微泡介導VEGF基因轉(zhuǎn)染對薄型子宮ER的影響研究*

孫泉 楊潔 許松 胡碧娟 劉敏 黃志平

子宮內(nèi)膜容受性（endometrial receptivity，ER）主要是指子宮內(nèi)膜處于一種允許胚泡黏附直至完成胚胎著床的狀態(tài)，薄型子宮內(nèi)膜是指子宮內(nèi)膜厚度低于可以妊娠的最低厚度，本質(zhì)是黃體中期子宮內(nèi)膜厚度＜7 mm[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜血流量的減少會抑制子宮腺上皮的生長，從而引起血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達的降低，引發(fā)內(nèi)膜血管系統(tǒng)損傷，子宮內(nèi)膜生長受限繼而導致薄型子宮內(nèi)膜[4-6]。由此推測，通過相關(guān)醫(yī)療技術(shù)將外源性VEGF 基因靶向轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜損傷部位，可能有助于內(nèi)膜修復。而尋找一種安全有效、經(jīng)濟實惠、易于控制的針對薄型子宮內(nèi)膜的基因轉(zhuǎn)染治療技術(shù)具有重要意義。鑒于此，本文研究了靶向超聲微泡介導VEGF 基因轉(zhuǎn)染對薄型ER 的效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇40 只性成熟但未交配的具有動情周期的雌性SD 大鼠進行研究。將其隨機分為四組，包括對照組10 只，模型組10 只，陰性對照組10 只，治療組10 例。均購自空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心[許可證編號SCXK（陜）2019-001]，10 周齡，體重220～240 g，實驗大鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物房，自由飲食，自然光照，環(huán)境相對濕度為50%～55%，溫度為22～26 ℃，明暗周期為12 h/12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。實驗全過程符合動物倫理學標準。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 儀器：彩色多普勒超聲診斷儀（PhilipsiU22）、Malvern 激光粒徑測量儀、熒光定量PCR 儀、熒光顯微鏡、流式細胞分析儀、掃描電子顯微鏡。試劑：大鼠VEGF 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒及大鼠白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor，LIF）ELISA 試劑盒均購自深圳子科生物科技有限公司，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色液購自南昌雨露實驗器材有限公司。

1.2.2 干預方式 模型組、陰性對照組及治療組大鼠均自宮角處注入95%無水乙醇貯留5 min。經(jīng)過兩個動情周期后，取處于動情周期的大鼠，測量其內(nèi)膜厚度。若子宮內(nèi)膜變薄即造模成功。薄型子宮內(nèi)膜大鼠造模成功后，通過鼠尾靜脈注入制備好的造影劑，初始劑量為1.0 mL，注射后每4 min 給藥0.5 mL，間隔給藥8 次，累計5.0 mL。采用超聲監(jiān)測微泡運動，每次待微泡運動到子宮內(nèi)膜部位時破裂微泡予以治療，即用彩色多普勒超聲診斷儀，探頭S5-1，啟用二次諧波模式，并將發(fā)射頻率和接收頻率分別調(diào)整為1.5 MHz、3.0 MHz，將機械指數(shù)調(diào)至最大。間隔1 d 實施1 次上述治療，共5 次，注射5 次后間隔10 d 再注射一次。模型組予以0.9%生理鹽水注射治療，陰性對照組則予以超聲微泡+抗體（不含VEGF165 基因和穿膜肽）治療，治療組則予以靶向超聲微泡介導VEGF 基因轉(zhuǎn)染治療。

1.3 觀察指標 干預4 個動情周期之后，比較四組大鼠子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量，子宮內(nèi)膜血流灌注，子宮內(nèi)膜VEGF 以及LIF 水平。（1）子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量。采集大鼠子宮組織，以4%多聚甲醛固定，做厚度為10 μm 的連續(xù)切片。每個子宮隨機選擇2 個切片，HE 染色之后觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)，同時完成子宮內(nèi)膜厚度的測量。此外，將HE 染色后切片放置在高倍鏡下拍照并統(tǒng)計切片腺體數(shù)目。（2）內(nèi)膜血流灌注檢測。用彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率5.0 MHz，選擇子宮內(nèi)膜或/和內(nèi)膜下區(qū)域彩色血流最顯著部位，以脈沖多普勒顯示其頻譜。并由超聲儀內(nèi)置軟件自動生成數(shù)據(jù)，獲得血流阻力指數(shù)（RI）、搏動指數(shù)（PI）、臍動脈收縮壓與舒張壓比值（S/D）數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均進行2 次測量，以平均值作為最終結(jié)果。（3）VEGF 及LIF 水平檢測。采集大鼠子宮內(nèi)膜組織，制備組織勻漿，酶標儀于450 nm 波長下檢測吸光度，并通過標準曲線計算樣本濃度。

1.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)處理由SPSS 22.0 軟件完成，計量資料表示為（x-±s），分析開展獨立樣本t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)變化 正常組大鼠子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)完整，呈波浪狀，且間質(zhì)無水腫，血管及腺體數(shù)量較多，見圖1；模型組大鼠子宮內(nèi)膜厚度相較于正常組織顯著變薄，且內(nèi)膜結(jié)構(gòu)不完整，血管、腺體稀疏，見圖2；陰性對照組相較于正常組織顯著變薄，血管、腺體稀疏，見圖3；治療組子宮內(nèi)膜表面存在一定波浪形，部分區(qū)域新生腺體和毛細血管增加，子宮內(nèi)膜厚度相較模型組及陰性對照組明顯增加，見圖4。

圖1 正常組（HE染色，×400）

圖2 模型組（HE染色，×400）

圖3 陰性對照組（HE染色，×400）

圖4 治療組（HE染色，×400）

2.2 四組大鼠子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量對比 正常組子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量均高于模型組、陰性對照組及治療組，治療組子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量均高于模型組、陰性對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 四組大鼠子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量對比（）

表1 四組大鼠子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量對比（）

#與正常組相比，P＜0.05；*與治療組相比，P＜0.05。

2.3 四組大鼠子宮內(nèi)膜血流灌注對比 正常組RI、PI、S/D 均低于模型組、陰性對照組及治療組，治療組RI、PI、S/D 均低于模型組、陰性對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 四組大鼠子宮內(nèi)膜血流灌注對比（）

表2 四組大鼠子宮內(nèi)膜血流灌注對比（）

#與正常組相比，P＜0.05；*與治療組相比，P＜0.05。

2.4 四組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF 以及LIF 水平對比 正常組子宮內(nèi)膜VEGF、LIF 水平均高于模型組、陰性對照組及治療組，治療組子宮內(nèi)膜VEGF、LIF水平均高于模型組、陰性對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 四組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF以及LIF水平對比（）

表3 四組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF以及LIF水平對比（）

#與正常組相比，P＜0.05；*與治療組相比，P＜0.05。

3 討論

攜抗ICAM-1 單克隆抗體的造影劑微泡可能通過特異性結(jié)合在受損的內(nèi)膜血管，從而發(fā)揮靶向作用[7-9]。VEGF 屬于子宮血管發(fā)育關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子之一，子宮內(nèi)膜處于種植窗期時會出現(xiàn)VEGF 的明顯上調(diào)，且表達部位自子宮內(nèi)膜普遍表達至著床位點局部，反映了VEGF 可作為植入胚胎與接受狀態(tài)子宮內(nèi)膜血管結(jié)構(gòu)間的局部信號分子[10-11]。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量均高于模型組、陰性對照組及治療組，治療組子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量均高于模型組、陰性對照組（P＜0.05），這提示了靶向超聲微泡介導VEGF 基因轉(zhuǎn)染可有效修復子宮內(nèi)膜。分析原因，種植窗期子宮內(nèi)膜VEGF 及其受體flk-1/KDR 表達均顯著增加，VEGF 與受體flk-1/KDR 結(jié)合后發(fā)揮多種生物學功能，如血管內(nèi)皮細胞增殖、血管生成、增加血管通透性、介導信號轉(zhuǎn)導、改變內(nèi)皮細胞基因的表達、調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜生長等[12-14]。而靶向超聲微泡轉(zhuǎn)染主要是通過抗ICAM-1 可特異性的與損傷血管內(nèi)皮結(jié)合的特點制備靶向造影劑，加入穿膜肽Tat 增加其結(jié)合能力，將VEGF 基因轉(zhuǎn)染至受損內(nèi)膜血管并發(fā)揮作用，最終實現(xiàn)子宮內(nèi)膜修復作用[15]。此外，正常組RI、PI、S/D 均低于模型組、陰性對照組及治療組，治療組RI、PI、S/D 均低于模型組、陰性對照組（P＜0.05），這反映了靶向超聲微泡介導VEGF基因轉(zhuǎn)染有助于患者子宮內(nèi)膜血流灌注的改善。究其原因，VEGF 具有誘導血管生成、增加血管通透性及維持血管功能等作用，是迄今為止人類所發(fā)現(xiàn)的最強效促血管生成因子[15-17]。而靶向超聲微泡技術(shù)主要是通過靶向轉(zhuǎn)染外源性VEGF 基因至子宮內(nèi)膜損傷部位，從而促進子宮內(nèi)膜血管的生成，為受損內(nèi)膜的修復起到積極促進作用，進一步恢復其增殖能力。另外，正常組子宮內(nèi)膜VEGF、LIF 水平均高于模型組、陰性對照組及治療組，治療組子宮內(nèi)膜VEGF、LIF 水平均高于模型組、陰性對照組（P＜0.05）。其中VEGF 是介導調(diào)控子宮內(nèi)膜血管生成的關(guān)鍵性蛋白，不但有利于誘導血管新生，同時可增加血管通透性。LIF 則是多功能細胞因子之一，可通過對胚胎干細胞分化進行抑制，繼而維持其增殖能力，對胚泡植入具有極其重要的作用。這充分說明了治療組可有效修復子宮內(nèi)膜損傷，促進ER的恢復[18-20]。

綜上所述，靶向超聲微泡介導VEGF 基因轉(zhuǎn)染治療薄型子宮內(nèi)膜效果顯著，可促進ER 的改善。