殼聚糖通過下調(diào)動靜脈內(nèi)瘺模型家兔血清MCP-1和VEGF-A表達(dá)影響血管內(nèi)膜增生作用機制

鄭婕 李小生 彭鳳 羅娟 湯顯湖

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

慢性腎臟病(CKD)發(fā)病率逐年增加，我國CKD患病率為10.8%，發(fā)病率高達(dá)5%左右〔1〕，而CKD引起的尿毒癥已嚴(yán)重威脅患者生命健康〔2〕。血液透析是CKD引起的尿毒癥有效療法，在臨床中得以廣泛應(yīng)用，而正確有效的血管通路選擇關(guān)乎患者生命健康。自體動靜脈內(nèi)瘺具有通暢率高、并發(fā)癥少、手術(shù)操作、簡便及醫(yī)療費用較低等優(yōu)點，因此首選用于血液透析治療，并且自體動靜脈內(nèi)瘺是血液透析的主要血管通路形勢，由于血管內(nèi)膜增生作用，自體動靜脈內(nèi)瘺的容易出現(xiàn)通暢率下降和血管通路并發(fā)癥現(xiàn)象，大大降低了其使用壽命及增加了血管功能障礙，因此臨床探討藥物抑制血管內(nèi)膜增生具有重要的意義。殼聚糖又名為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用得到，在醫(yī)藥、食品、化工等諸領(lǐng)域中的應(yīng)用研究取得了重大進(jìn)展〔3～5〕，研究證實殼聚糖不僅具有降血脂、降血糖的作用〔6，7〕，也被證實與新生血管形成相關(guān)。研究顯示單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A蛋白與血管內(nèi)膜形成相關(guān)〔8〕，本研究觀察殼聚糖影響動靜脈內(nèi)瘺模型家兔血清MCP-1和VEGF-A變化水平，探討其抑制血管內(nèi)膜增生作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年健康新西蘭兔60只，雌雄各半，體重(2 500±50)g，購自實驗動物中心，本研究通過動物倫理委員會批準(zhǔn)，符合倫理要求。

1.2主要試劑與儀器 主要試劑：殼聚糖〔批準(zhǔn)文號：粵食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2019第1413247號，30 ml/瓶〕購自廣州潤虹醫(yī)藥科技有限公司，12%水合氯醛購自青島青爾源藥業(yè)有限公司，4%甲醛和10%甲醛購自聊城芫澤化工產(chǎn)品有限公司，石蠟、伊紅染液、蘇木素染液均購自甘肅隆鑫商貿(mào)有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)和TUNEL試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司?？俁NA提取試試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自Promega公司，PCR引物由上海達(dá)科為生物技術(shù)公司合成，GAPDH購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。兔抗大鼠MCP-1一抗(批號：sc-190328)和兔抗大鼠VEGF-A一抗(批號：sc-135471)均購自美國Santa Cruz公司。主要儀器：普通外科手術(shù)器械屬上海金鐘手術(shù)器械廠有限公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡屬日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，紫外分光光度計購自上海光譜儀器有限公司，酶標(biāo)儀屬Thermo multiskan MK3 公司產(chǎn)品，實時熒光定量PCR儀屬Applied Biosystems產(chǎn)品，高速離心機屬德國Eppendorf公司產(chǎn)品，電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)屬美國Bio-Rad公司產(chǎn)品 。

1.3動靜脈內(nèi)瘺模型建立 將60只新西蘭兔進(jìn)行雌、雄分類后，隨機從中分別選取雌、雄各選24只新西蘭兔建立動靜脈內(nèi)瘺模型，參照文獻(xiàn)動靜脈內(nèi)瘺模型建立方法〔9〕。經(jīng)兔耳緣靜脈注射12%水合氯醛進(jìn)行麻醉，剪開頸部皮毛，在無菌操作環(huán)境下沿下頜角與鎖骨中點連線切開皮膚長約3 cm，分離皮下組織及游離左頸動、靜脈，結(jié)扎頸內(nèi)靜脈遠(yuǎn)端，剪斷，應(yīng)用無創(chuàng)血管阻斷鉗阻斷頸動脈近端和遠(yuǎn)端血流，用手術(shù)刀沿頸動脈長軸切口0.5 cm切口，再行頸內(nèi)靜脈與頸動脈端側(cè)吻合。動靜脈內(nèi)瘺模型判定：去除動、靜脈兩端無創(chuàng)血管阻斷鉗恢復(fù)循環(huán)后，近端頸靜脈立即充盈，可觸及明顯的搏動和震顫，提示頸動靜脈吻合成功。另取12只新西蘭兔也進(jìn)行相關(guān)手術(shù)用于假傷對照，除動靜脈吻合的操作步驟外，其余步驟與動靜脈內(nèi)瘺模型建立一致。

1.4實驗兔治療及分組 參考臨床殼聚糖使用劑量(120 μg/ml)〔10〕，按照體重(兔：2.5 kg，人：50 kg)折算后，計算兔適宜劑量(中劑量)為5 μg/ml，設(shè)置低劑量和高劑量分別為1 μg/ml和25 μg/ml。將假傷對照的12只新西蘭兔作為假傷對照組，動靜脈內(nèi)瘺模型隨機分成模型對照組、殼聚糖低、中、高劑量組，每組12只，雌雄各半。殼聚糖低、中、高劑量組分別在術(shù)后將殼聚糖涂抹在動靜脈內(nèi)瘺血管上，假傷對照組和模型對照組術(shù)后涂抹生理鹽水，觀察28 d后相關(guān)指標(biāo)變化情況。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色觀察血管內(nèi)膜病理變化 殼聚糖治療28 d后，抽取各組兔血液保存?zhèn)溆?，隨機處死各組兔子，在無菌操作臺中剪取左頸頸內(nèi)靜脈段(近端，距離動靜脈瘺口約1 cm內(nèi))用于血管內(nèi)膜病理學(xué)觀察，以4%甲醛固定，石蠟包埋后制作約5 μm厚的病理組織切片，HE染色后在光鏡下(400倍)觀察靜脈內(nèi)膜病理變化，選擇清晰視野進(jìn)行拍照，采用Image Pro Plus6.0軟件對圖片進(jìn)行分析，測量各組實驗兔血管內(nèi)膜厚度，計算各模型組新生血管內(nèi)膜厚度，新生血管內(nèi)膜厚度=實際測量血管內(nèi)膜厚度-假傷對照組血管內(nèi)膜厚度均值。

1.6免疫組化法檢測血管內(nèi)膜組織MCP-1和VEGF-A表達(dá)水平 制作切片：剪取左頸內(nèi)靜脈段(近端，距離動靜脈瘺口約1 cm內(nèi))組織，用12%甲醛固定液固定，48 h后用PBS洗滌，脫水后浸蠟，包埋機上進(jìn)行包埋，制作標(biāo)本切片。免疫組化染色：烤片脫蠟，水化后高壓修復(fù)15 min，在濕盒中加入3%H2O2孵育12 min，加入鼠抗兔MCP-1、VEGF-A抗體4℃過夜孵育，滴加二抗室溫再孵育25 min，加入DAB顯色劑，標(biāo)本切片用蘇木素染色3 min，再用1%鹽酸乙醇分化透明，在光鏡(200倍)視野下進(jìn)行觀察，用Lecia Applaction Stiue圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，陽性表達(dá)計2分，陰性表達(dá)計1分，分值越高代表陽性表達(dá)越高。

1.7Western印跡檢測實驗兔血清MCP-1和VEGF-A表達(dá)水平 抽取各組實驗兔血液5 ml，放入離心管中，室溫下3 000 r/min離心12 min，靜置后收集上清液，提取血清總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒對提取的總蛋白進(jìn)行定量，按比例加入4×蛋白上樣緩沖液，95℃變性 5 min，置于-20℃保存?zhèn)溆?。設(shè)置濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為 120 V進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印。取聚偏氟乙烯(PVDF)膜用TBST 洗膜 5 min，共3次，加入2%膜封閉液(BSATBS)配制封閉液中進(jìn)行封閉，室溫?fù)u床孵育2 h。 洗膜后先后加入一抗工作液(MCP-1抗體和VEGF-A抗體)和二抗工作液，進(jìn)行一抗孵育和二抗孵育。將新鮮配制的電化學(xué)發(fā)光(ECL)液滴加到PVDF膜表面，轉(zhuǎn)移至成像分析系統(tǒng)暗箱中曝光，采集圖像并分析。蛋白定量：以相對光密度值代表蛋白相對表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行分析，實驗至少重復(fù)3次。

1.8qRT-PCR檢測血清MCP-1 mRNA和VEGF-A mRNA表達(dá)水平 抽取各組實驗兔血液5 ml，放入離心管中，室溫下3 000 r/min離心12 min，靜置后收集上清液，采用Trizol法提取血清總RNA，按照PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR引物為：MCP-1：上游：5′-AATGGGTCCAGAAGTAC-3′,下游：5′-TCAGATTTATGGGTCAA-3′;VEGF-A:上游：5′-TTGCTGCTACCTCCAC-3′,下游：5′-AATGC TTTCTCCGCTCTG-3′;GAPDH:上游：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′,下游：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。設(shè)置好qRT-PCR體系，設(shè)置反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 35 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt計算相應(yīng)mRNA的相對表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD檢驗、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1殼聚糖治療實驗兔血管內(nèi)膜組織MCP-1和VEGF-A蛋白表達(dá)影響 免疫組化檢測結(jié)果顯示，各組血管內(nèi)膜組織MCP-1、VEGF-A蛋白陽性表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假傷對照組比較，建模各組MCP-1、VEGF-A蛋白陽性表達(dá)明顯升高，模型對照組MCP-1、VEGF-A蛋白陽性表達(dá)明顯高于殼聚糖低、中、高劑量組，殼聚糖低劑量組明顯高于中、高劑量組，且殼聚糖中劑量明顯高于高劑量組(均P<0.05)。見圖1、表1。

2.2殼聚糖治療實驗兔對血清MCP-1和VEGF-A蛋白和mRNA的影響 各組血清MCP-1、VEGF-A蛋白和mRNA相對表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假傷對照組比較，建模各組MCP-1、VEGF-A蛋白和mRNA相對表達(dá)量明顯升高，模型對照組MCP-1、VEGF-A蛋白和mRNA相對表達(dá)量明顯高于殼聚糖低、中、高劑量組，殼聚糖低劑量組明顯高于中、高劑量組，且殼聚糖中劑量明顯高于高劑量組(均P<0.05)。見表1、圖2。

圖1 假傷對照組血管內(nèi)膜組織MCP-1蛋白和VEGF-A蛋白陽性表達(dá)(HE染色，×200)

表1 各組血管內(nèi)膜組織MCP-1、VEGF-A蛋白陽性表達(dá)和血清MCP-1、VEGF-A蛋白及mRNA相對表達(dá)量及新生血管內(nèi)膜厚度比較

1～5：假傷對照組、模型對照組、殼聚糖低劑量組、殼聚糖中劑量組、殼聚糖高劑量組

2.3殼聚糖治療實驗兔對血管內(nèi)膜增生的影響 HE染色結(jié)果顯示，與假傷對照組比較，模型對照組可見內(nèi)膜增生，管腔明顯變窄，殼聚糖干預(yù)治療各組，增生內(nèi)膜減少，劑量越大抑制內(nèi)膜增生越明顯。測量各組新生血管內(nèi)膜厚度發(fā)現(xiàn)，各組新生血管內(nèi)膜厚度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假傷對照組比較，建模各組新生血管內(nèi)膜厚度升高，模型對照組的新生血管內(nèi)膜厚度明顯于殼聚糖低、中、高劑量組，殼聚糖低劑量組明顯高于中、高劑量組(均P<0.05)，且中劑量組明顯高于高劑量組(均P<0.05)。見表1、圖3。

2.4血清MCP-1、VEGF-A蛋白及其 mRNA相對表達(dá)量與新生血管內(nèi)膜厚度相關(guān)性 血清MCP-1、VEGF-A蛋白及其 mRNA相對表達(dá)量與新生血管內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)(r=0.830、0.840、0.818、0.828；均P=0.000)。見圖4。

圖3 各組血管內(nèi)膜(HE染色，×200)

圖4 血清MCP-1、VEGF-A蛋白及 mRNA相對表達(dá)量與新生血管內(nèi)膜厚度相關(guān)性

3 討 論

動物模型是以適用于人體為最終目的，動物模型中對動物的選擇直接關(guān)乎實驗成敗，因此選擇實驗動物時并不僅僅只考慮容易控制、飼養(yǎng)、費用、倫理等自身之外的因素，同時也要兼顧動物基因與人類基因的相似性及疾病發(fā)病機制的相似性〔11〕。本研究選取兔子建立動靜脈內(nèi)瘺模型是可行的，兔子較其他動物比較更容易飼養(yǎng)，且頸動脈較大便于手術(shù)操作，最主要的是兔子用于動靜脈內(nèi)瘺模型具有成功的先例〔9，12〕，因此本研究選用新西蘭兔建立動靜脈內(nèi)瘺模型。實驗中，當(dāng)去除動、靜脈兩端無創(chuàng)血管阻斷鉗恢復(fù)循環(huán)供血后，近端頸靜脈立即充盈，可觸及明顯的搏動和震顫，提示模型建立成功，得到較好的實驗動物模型，為接下來探討研究相關(guān)機制提供可靠的基礎(chǔ)。

CKD主要治療手段是血液透析，血管通道的好壞直接影響血液透析治療效果〔13〕。近幾年動靜脈內(nèi)瘺技術(shù)越來越成熟，其為血液透析患者建立了長期的血管通路，避免患者反復(fù)多次刺穿帶來不利的影響，因此臨床具有較高的應(yīng)用價值〔14〕。動靜脈內(nèi)瘺技術(shù)在臨床中得以廣泛應(yīng)用，隨之出現(xiàn)的臨床問題也越來越多，如動靜脈內(nèi)瘺閉塞、血管通路失效的情況時有報道，上述不良現(xiàn)象發(fā)生明顯降低了患者的血流量，影響血液透析的臨床療效。除低血壓、感染、患者自身血管因素等不良因素能引起動靜脈內(nèi)瘺的通暢率外，血管內(nèi)膜增生也是影響動靜脈內(nèi)瘺通暢率的重要因素，因此尋求抑制動靜脈內(nèi)瘺內(nèi)膜增生的治療方法是臨床亟待解決的問題。目前殼聚糖應(yīng)用于臨床的相關(guān)研究報道比較少見，但在治療自體動靜脈瘺中具有顯著效果，楊春和〔15〕研究認(rèn)為殼聚糖聯(lián)合遠(yuǎn)紅外線在治療自體動靜脈瘺方面能夠有效提高血管通路流量，降低并發(fā)癥發(fā)生率；鄢艷等〔10〕認(rèn)為殼聚糖可降低體外培養(yǎng)的尿毒癥患者內(nèi)瘺血管平滑肌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。另一方面，殼聚糖-硫酸化絲素蛋白能抑制動物血管形成〔16〕，以上研究均證實殼聚糖對抑制血管生成具有積極的作用。本研究結(jié)果表明，殼聚糖對實驗兔血管內(nèi)膜增生具有抑制作用。

MCP-1屬于CC趨化因子家族的一種小細(xì)胞因子，多項研究證實MCP-1是極為重要的促炎細(xì)胞因子，由內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥刺激下單核分泌，促進(jìn)單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)膜活化為巨噬細(xì)胞〔17〕，在炎癥性疾病中扮演重要的角色〔18～20〕。此外，有研究表明，MCP-1可促進(jìn)血管纖維化增加動脈粥樣硬化的風(fēng)險〔21〕，以上研究表明均表明MCP-1與血管增生密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明殼聚糖具有下調(diào)MCP-1的作用。VEGF 在促進(jìn)新生血管增殖及分化方面起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，VEGF-A是VEGF成員之一，是促血管新生因子，研究已證實VEGF-A與心血管疾病相關(guān)性疾病病理生理過程相關(guān)〔22〕；VEGF-A/VEGFR-2信號通路對新生血管具有調(diào)控作用，抑制微血管生成可能具有阻斷胃黏膜惡性病變的意義〔23〕；三七總皂苷經(jīng)VEGF-A抑制小鼠視網(wǎng)膜病變新生血管的形成〔24〕；VEGF-A表達(dá)升高可促進(jìn)新生血管生成。本研究結(jié)果提示，建模的實驗兔VEGF-A表達(dá)升高可促進(jìn)血管增生作用。不同劑量殼聚糖干預(yù)治療后，VEGF-A表達(dá)趨勢與MCP-1表達(dá)相一致，因此殼聚糖同樣具有下調(diào)MCP-1的表達(dá)作用。本文證實了MCP-1、VEGF-A表達(dá)水平能影響內(nèi)膜增生。

綜上，殼聚糖具有有效下調(diào)動靜脈內(nèi)瘺模型內(nèi)膜組織及血清MCP-1和VEGF-A表達(dá)、抑制動脈內(nèi)膜增生的作用。然而，在臨床上尿毒癥患者的身體情況與本實驗?zāi)Ｐ瓦€有巨大差距，殼聚糖對于尿毒癥患者能否發(fā)揮一樣的作用，機制是否相似，還需進(jìn)一步探討。