OsNAC2d基因編輯水稻突變體的創(chuàng)建及其對干旱脅迫的響應

李兆偉 莫祖意 孫聰穎 師 宇 尚 平 林偉偉 范 凱 林文雄,*

基因編輯水稻突變體的創(chuàng)建及其對干旱脅迫的響應

李兆偉1,2莫祖意1,2孫聰穎1,2師 宇1,2尚 平2,3林偉偉1,2范 凱2,3林文雄1,2,*

1福建農(nóng)林大學生命科學學院, 福建福州 350002;2福建農(nóng)林大學/ 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點實驗室, 福建福州 350002;3福建農(nóng)林大學農(nóng)學院, 福建福州 350002

為探究轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d的生物學功能及其對水稻耐旱性的影響, 本研究利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)對粳稻中花11中的基因進行突變, 并考察突變體在田間種植下的農(nóng)藝性狀, 以及突變體幼苗在干旱脅迫下的生長情況和基因表達水平。結(jié)果表明,基因主要在水稻成熟籽粒、葉片和花藥中表達, 在根系和莖中的表達量較低, 并且受干旱脅迫誘導, 在10株陽性基因突變株系的T2代植株中, 篩選出6種純合突變體, 田間試驗調(diào)查表明,突變體與野生型中花11相比, 株高、有效穗、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重和單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀無顯著差異。在干旱脅迫時,突變體幼苗的根系與植株生長、根系和地上部生物量的積累均受到抑制, 且在突變體中的表達量維持在較低水平, 而野生型水稻的表達則受干旱脅迫誘導而增強, 植株生長與生物量積累未受到顯著抑制, 表明轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d正調(diào)控水稻響應干旱脅迫。創(chuàng)建的突變體材料為進一步揭示OsNAC2d的生物學功能及其響應干旱脅迫的精細調(diào)控機制提供了優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。

水稻; 干旱脅迫; 基因編輯;基因

水稻作為世界主要糧食作物之一, 占全球糧食總產(chǎn)量的四分之一, 是全球近一半以上人口的主糧, 尤其在亞洲地區(qū), 約90%的人口以稻米為主食[1]。我國的水稻產(chǎn)量約占糧食總產(chǎn)量的1/3, 是全國2/3人口的主糧, 維持水稻產(chǎn)量穩(wěn)定對保障國家糧食安全具有重要現(xiàn)實意義[2]。然而, 隨著全球生態(tài)環(huán)境惡化, 極端氣候頻發(fā), 降水區(qū)域分布不均勻和環(huán)境高溫持續(xù)出現(xiàn), 農(nóng)業(yè)灌溉水資源日益匱乏, 農(nóng)田旱災現(xiàn)象變得日趨嚴重, 干旱已成為制約水稻產(chǎn)量潛力發(fā)揮和造成稻谷減產(chǎn)的最主要環(huán)境脅迫因素之一, 嚴重威脅著國家的糧食安全[3-4]。為有效緩解農(nóng)田干旱現(xiàn)象, 除大力興修農(nóng)田水利設(shè)施、開發(fā)節(jié)水灌溉栽培技術(shù)等措施外, 選育對干旱脅迫耐性較強的水稻品種是緩解農(nóng)田水資源短缺的有效措施之一[5]。進入21世紀以來, 隨著現(xiàn)代分子遺傳學和生物技術(shù)的快速發(fā)展, 大量水稻新基因的遺傳調(diào)控功能被相繼發(fā)掘, 以關(guān)鍵農(nóng)藝性狀功能基因為基礎(chǔ), 制定高效、精確的分子設(shè)計育種策略, 將水稻功能基因組學成果應用于遺傳育種改良, 能有效彌補傳統(tǒng)水稻育種手段周期長、效率低、預見性差等缺陷[1,6]。

NAC是近二十多年來發(fā)現(xiàn)的一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子, 依據(jù)矮牽牛()的()基因、擬南芥()的基因和()基因的首字母命名[7-8], 氨基酸序列包含1個特異的N端NAC結(jié)構(gòu)域和C端轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域, NAC結(jié)構(gòu)域由150～160個氨基酸形成5個亞結(jié)構(gòu)域(A～E), 其中A、C、D亞結(jié)構(gòu)域序列高度保守, 并含核定位信號, B和E亞結(jié)構(gòu)域序列的變異頻率較高, 賦予NAC轉(zhuǎn)錄因子不同功能, C端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域的氨基酸組分呈現(xiàn)多樣化, 起對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活功能[9], 在植物響應生物和非生物脅迫反應的激素調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、器官構(gòu)建、免疫應激等過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[10]。水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)151個NAC轉(zhuǎn)錄因子[11], 其中多個NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植株對干旱脅迫的響應調(diào)節(jié), 如干旱脅迫能誘導在水稻葉片保衛(wèi)細胞中表達, 過表達的轉(zhuǎn)基因植株通過調(diào)節(jié)葉片氣孔關(guān)閉, 減少水分丟失, 提高對土壤干旱脅迫的抗性[12]; 過表達能擴大轉(zhuǎn)基因植株的根系中柱和通氣組織, 并改善植株的根型結(jié)構(gòu), 增強對干旱脅迫的抗性, 顯著提高在干旱條件下的稻谷產(chǎn)量[13]; 轉(zhuǎn)錄因子OsNAC5能特異結(jié)合耐旱功能基因()的啟動子, 增加表達豐度, 從而增強水稻的抗旱性和耐鹽性[14]; 過表達顯著增加植株的根皮層和根中柱細胞數(shù)目, 使根系直徑增大, 根系變粗, 顯著提升植株的抗旱性, 并提高轉(zhuǎn)基因植株在干旱條件下的田間產(chǎn)量[15]; 在過表達的轉(zhuǎn)基因植株中, 轉(zhuǎn)錄因子OsNAC3通過清除干旱、高溫等脅迫造成的細胞內(nèi)多余活性氧積累, 維持細胞內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài), 提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性和耐高溫能力[16]。

本課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測序分析, 發(fā)現(xiàn)了1個在水稻葉片衰老過程顯著差異表達基因[17],該基因的表達水平受干旱脅迫誘導, 基因ID號為, 位于水稻3號染色體, 編碼區(qū)含有1503個核苷酸, 無內(nèi)含子, 氨基酸序列包含一個典型的NAC結(jié)構(gòu)域, 屬于水稻NAC轉(zhuǎn)錄因子家族, 然而該基因的在水稻生長發(fā)育階段的生理作用和分子調(diào)控模式等生物學功能, 目前還未見相關(guān)報道。本研究通過CRISPR/Cas9編輯技術(shù)構(gòu)建了突變體, 并從T2代中分離到純合突變植株, 調(diào)查突變植株的田間農(nóng)藝性狀, 考察突變體幼苗在干旱條件下的生長情況和基因響應干旱的表達模式。研究結(jié)果對系統(tǒng)揭示轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d應答干旱逆境的分子調(diào)控機理有積極的理論價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以粳稻中花11 (Zhonghua 11, ZH11,subsp. Keng)為遺傳背景材料, 進行重組載體轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌為EHA105菌種, 原核感受態(tài)為大腸桿菌DH5α菌株。pYL-U6a-gRNA、pYL-U6b- gRNA中間載體以及pYLCRISPR/Cas9-MT表達載體, 均由福建農(nóng)林大學海峽聯(lián)合研究院朱強教授惠贈, 最早由華南農(nóng)業(yè)大學劉耀光院士贈予。試驗材料種植于福建省福州市福建農(nóng)林大學試驗農(nóng)場的轉(zhuǎn)基因材料管理專區(qū)。

試驗用TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4連接酶、qPCR試劑盒等購買于寶生物工程(大連)有限公司,I限制性內(nèi)切酶購買于NEB (北京)有限公司, KOD-Plus-Neo高保真酶購買于東洋紡(上海)生物科技有限公司, 基因編輯靶點序列和引物合成、以及測序服務均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 OsNAC2d表達模式分析

野生型ZH11水稻種子經(jīng)浸泡、催芽、播種后, 采用溶液培養(yǎng)至四葉一心時, 剪取葉、莖、根組織, 液氮速凍后用于RNA提取, 檢測在不同組織中的表達情況; 另選取生長到二葉一心的植株, 在完全營養(yǎng)液中添加聚乙二醇(PEG-6000)至終濃度為15%, 模擬環(huán)境干旱脅迫, 分別于脅迫第0、0.5、3、6、12和24 h剪取葉片, 液氮速凍后提取樣品RNA,用于檢測在干旱脅迫不同時期的表達量。

1.3 靶點設(shè)計與CRISPR/Cas9-OsNAC2d-T12載體構(gòu)建

依據(jù)(LOC_Os03g39100)基因序列特征, 利用CCTop-CRISPR/Cas9在線軟件在基因反義鏈的上游和下游位置各設(shè)計1個20 bp的編輯靶點(圖2-A), PAM序列分別為GGG和AGG, 參照李兆偉等[18]方法, 在靶點1與靶點2序列端頭添加gccg/aaac與gttg/aaac連接接頭序列, 使其分別能與pYL-U6a-gRNA和pYL-U6b-gRNA中間載體經(jīng)I酶切后形成互補黏性末端。

參照Ma等[19]的方法構(gòu)建雙靶點pYLCRISPR/ Cas9-OsNAC2d-T12表達載體, 先將2個靶點分別與pYL-U6a-gRNA和pYL-U6b-gRNA中間載體連接, 再經(jīng)過2次PCR擴增獲得含特異性接頭的U6a- OsNAC2d-T1和U6b-OsNAC2d-T2表達盒, 依據(jù)圖2-B方式, 將U6a-OsNAC2d-T1和U6b-OsNAC2d-T2表達盒與pYLCRISPR/Cas9-MT載體連接, 并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài), 平板培養(yǎng), 單菌落測序后采用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化ZH11愈傷, 經(jīng)培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因株系, 利用表1中的潮霉素基因檢測引物, PCR擴增篩選出陽性轉(zhuǎn)基因株系。

1.4 編輯植株的突變類型檢測鑒定

為檢測編輯植株中基因的突變情況, 分別在2個靶位點兩端設(shè)計引物OsNAC2d-T1-F/ OsNAC2d-T1-R和OsNAC2d-T2-F/OsNAC2d-T2-R (表1), 提取編輯突變水稻植株的T2代幼苗葉片DNA, 作為模板, 進行PCR擴增, 2個檢測靶點的擴增產(chǎn)物大小分別為373 bp和415 bp, 擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序, 以野生型ZH11水稻DNA為模板的擴增產(chǎn)物片段測序序列為參照, 分析編輯植株的基因突變類型。

1.5 osnac2d突變體的農(nóng)藝性狀考查

編輯突變植株幼苗經(jīng)測序鑒定后, 單本插秧移栽到福建農(nóng)林大學小試驗農(nóng)場轉(zhuǎn)基因材料管理專區(qū),依據(jù)當?shù)爻Ｒ?guī)稻田管理方式進行水肥管理、病蟲草害防除。待水稻成熟時, 分別于不同變異類型突變體中選取10株長勢基本一致的植株, 考察株高、有效穗、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重和單株產(chǎn)量等田間農(nóng)藝性狀。利用SPSS13.0軟件計算平均值與標準差, 采用單因素方差分析比較指標的種間差異, 以≤0.05為顯著性差異。

表1 本研究采用的核苷酸序列及相應引物

1.6 osnac2d突變體耐旱性分析

選取和突變體與野生型ZH11為試驗材料, 種子經(jīng)浸泡、催芽后, 利用完全營養(yǎng)液培養(yǎng)14 d至幼苗長至二葉一心, 更換新鮮營養(yǎng)液, 并添加PEG-6000至終濃度為15%, 進行干旱模擬培養(yǎng), 脅迫培養(yǎng)3 h后, 剪取葉片提取總RNA, 用于分析在各個基因型材料中的表達水平, 每個突變體材料分別設(shè)置3組重復處理, 脅迫培養(yǎng)14 d后, 分別從每個處理選取5株用于觀察幼苗表型, 并測定根長、苗長、干重等外觀指標, 衡量突變體植株對干旱脅迫的耐受性。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsNAC2d基因的組織表達模式與干旱響應模式

對O在野生型ZH11水稻的根、莖、葉、花藥和成熟籽粒中的表達量檢測發(fā)現(xiàn),在ZH11水稻不同組織中的表達量存在較大差異, 其中在成熟籽粒中的表達量最高, 其次為葉片與花藥, 在根系中的表達水平顯著低于在籽粒、葉片和花藥中的表達水平, 而在莖中表達水平最低(圖1-A); 通過15%的PEG-6000脅迫處理發(fā)現(xiàn), 葉片和根系中O的表達量在PEG處理3 h后顯著提高, 在處理3～12 h期間, 均顯著高于未處理時, 而在PEG處理24 h后, 葉片和根系中的O表達水平開始降低到接近于未處理前水平(圖1-B), 表明基因在水稻葉片和根系對干旱逆境脅迫響應中起作用。

2.2 OsNAC2d基因編輯靶點設(shè)計與pYLCRISPR/ Cas9-OsNAC2d-T12載體構(gòu)建

為進一步探究的生物學功能, 借助CRISPR/Cas9技術(shù)編輯突變ZH11的基因, 根據(jù)基因編碼區(qū)含1503個堿基且無內(nèi)含子的序列結(jié)構(gòu)特征, 以基因CDS編碼區(qū)+133 ～ +135 bp的GGG作為PAM序列, +136 ～ +155 bp區(qū)域的20 bp堿基片段作為靶點1序列, 編碼區(qū)下游+1090 ～ +1092 bp處的AGG作為靶點2的PAM序列, 從+1093 ～ +1112 bp間的20 bp堿基序列為靶點2編輯位點(圖2-A), 以增加基因的突變頻率。

為構(gòu)建pYLCRISPR/Cas9-OsNAC2d-T12表達載體, 首先將雙鏈靶點1與pYL-U6a-gRNA中間載體連接, 靶點2與pYL-U6b-gRNA中間載體連接, 使2個靶點序列分別由OsU6a和OsU6b啟動子驅(qū)動, 再通過PCR擴增得到含特異連接接頭的U6a啟動子-gRNA1表達盒和U6b啟動子-gRNA2表達盒, 根據(jù)圖2-B連接模式, 將2個表達盒與pYLCRISPR/ Cas9-MT載體經(jīng)酶切連接, 獲得pYLCRISPR/Cas9- OsNAC2d-T12重組載體, 測序表明, 重組載體的2個靶序列核苷酸(圖3)與設(shè)計靶點序列完全一致(表1), 表明2個靶點均準確連接到了pYLCRISPR/Cas9- MT載體上, 重組pYLCRISPR/Cas9-OsNAC2d-T12表達載體可用于轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織。

2.3 T0代陽性植株篩選

將重組pYLCRISPR/Cas9-OsNAC2d-T12載體通過農(nóng)桿菌介導法侵染轉(zhuǎn)化ZH11愈傷組織, 經(jīng)組織培養(yǎng)獲得11株再生轉(zhuǎn)化植株, 提取再生植株葉片的基因組DNA, 利用PCR擴增潮霉素基因, 瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn), 共10株轉(zhuǎn)基因株系的基因組DNA能擴增出280 bp的潮霉素基因條帶(圖4), 為陽性再生株系, 其中1個轉(zhuǎn)基因株系沒有檢測到潮霉素標記基因, 為陰性植株。

圖1 水稻OsNAC2d的表達量分析

A:在野生型ZH11水稻的根、莖、葉、花藥和籽粒中的表達水平; B: 葉片和根系中在15%的PEG-6000脅迫下的動態(tài)表達分析, 取樣時間分別為處理后0、0.5、3、6、12和24 h; 不同字母表示在< 0.05水平的顯著性差異。

A: the differential expression level ofgene in the root, stem, leaf, anther, and grain of wild type ZH11; B: the temporal expression ofin leaves and roots of rice incubated in the nutrient solution including 15% PEG-6000, and samples were collected at 0, 0.5, 3, 6,12, and 24 hours after treatment, respectively. Different letters above the columns are significantly different at the 0.05 probability level.

圖2 OsNAC2d的gRNA靶點和pYLCRISPR/Cas9-OsNAC2d-T12表達載體重組示意圖

A:的2個gRNA靶點位置和堿基序列; B: 2個靶點gRNA表達盒與pYLCRISPR/Cas9-MT重組示意圖。

A: the position and nucleotide sequences of two gRNA targets in thegene locus; B: the recombining diagram of two gRNA cassettes and pYLCRISPR/Cas9-MT vector.

圖3 pYLCRISPR/Cas9-OsNAC2d-T12重組表達載體的2個靶點測序檢測

圖4 陽性轉(zhuǎn)基因株系鑒定

-: 陰性對照, 為等體積的水代替模板; +: 陽性對照, 為等體積陽性質(zhì)粒作模板; 1～11: 轉(zhuǎn)基因株系; M: 2 kb DNA ladder。

-: the negative control is an equal volume of water instead of the template; +: the positive control is an equal volume of the positive plasmid as a template; 1–11: transgenic lines; M: 2 kb DNA ladder.

2.4 純合osnac2d突變體植株的篩選與鑒定

為盡快獲得突變性狀穩(wěn)定遺傳的純合突變植株,本研究直接對轉(zhuǎn)基因株系的T2代植株基因組的2個靶點區(qū)域堿基進行PCR擴增和測序, 并與野生型序列進行比較分析。測序分析結(jié)果表明, 在10個陽性株系的T2代植株中, 共篩選鑒定出6種在2個靶點均產(chǎn)生純合突變的植株, 由圖5可見,突變體在靶點1插入1個A堿基, 導致靶點1與靶點2之間的堿基位移, 在靶點2處的GC堿基突變?yōu)?個A堿基, 造成1個堿基缺失;突變體在2個靶點分別缺失21與3個堿基,突變體在靶點1插入1個A堿基, 在靶點2處則缺失1個G堿基, 并且和純合突變體是來源于同一個T0代雜合突變體的分離后代; 在T0代雜合突變株系的2個純合T2代突變植株中,突變體在靶點1缺失含36個堿基的小片段, 在靶點2則插入1個T堿基,突變體則在2個靶點區(qū)域分別缺失7和3個堿基;突變體在T0代即為純合突變, 在靶點1插入1個A堿基, 在靶點2缺失GCA堿基。

2.5 osnac2d突變體的農(nóng)藝性狀

純合突變植株經(jīng)田間種植試驗, 對其農(nóng)藝性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn), 除的株高、的穗粒數(shù)和的結(jié)實率低于野生型ZH11外, 其余突變體植株的株高、穗粒數(shù)、結(jié)實率等指標均與野生型ZH11無顯著差異, 此外, 6種突變體的有效穗數(shù)、穗長、千粒重和單株產(chǎn)量等指標也與野生型ZH11無顯著差異, 表明基因突變未影響正常田間種植模式下的植株農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量構(gòu)成參數(shù)。

2.6 osnac2d突變體耐旱性調(diào)查

鑒于突變體在靶點1插入1個A堿基, 在靶點2缺失3個堿基,突變體在2個靶點分別缺失7個和3個堿基, 均引起堿基移碼突變, 因此選這2個基因型突變體進行耐旱性調(diào)查。在正常營養(yǎng)液中培養(yǎng)14 d后的和突變體經(jīng)15%的PEG-6000脅迫處理14 d后, 植株的根系和地上部分均受到抑制, 植株變得矮小、瘦弱; 而同樣處理條件下的野生型ZH11則未產(chǎn)生明顯外觀可見的受抑制表型(圖6)。對植株生長情況的測定分析表明,和突變體受PEG脅迫后的根系長度、植株地上部苗長以及植株總長度均顯著低于其在完全營養(yǎng)液中的長勢, 而野生型ZH11各部位的生長長度與未處理組無顯著差異(圖7)。對植株生物量的測定發(fā)現(xiàn), PEG脅迫引起、突變體與野生型ZH11的根系生物量均較其在完全營養(yǎng)液中顯著降低(圖8-A); 此外,、突變體在PEG脅迫下的地上部生物量顯著低于其在完全營養(yǎng)液中生長時的生物量, 而野生型ZH11在PEG處理與完全營養(yǎng)液中的地上部生物量的差異未達到顯著性(圖8-B); 就植株總生物量而言,、突變體與野生型ZH11在PEG脅迫下的植株總生物量均顯著低于其在完全營養(yǎng)液中培養(yǎng)時的生物量, 表明所有供試材料的物質(zhì)合成與植株生長均受到了PEG脅迫抑制, 而在同一PEG脅迫處理條件下,和突變體的植株總生物量則顯著低于野生型ZH11 (圖8-C), 表明突變體水稻幼苗受PEG抑制的程度較野生型ZH11更為嚴重, 突變體變得對干旱脅迫更敏感, 苗期長勢較容易受到環(huán)境干旱影響。

圖5 osnac2d突變體與野生型植株中的OsNAC2d基因序列比對分析

藍色字母表示靶點序列, 黃色高亮為PAM序列, 刪除線代表缺失堿基, 紅色小寫字母為插入堿基, -表示缺失, +表示插入, WT代表野生型(中花11)。

The blue letters are the target genome sequence, the yellow highlighted letters denote PAM, dashes strikethrough indicate the deleted bases, and insertion nucleotides are shown in red lowercase letters. -: deletion; +: insertion; WT: wild type (ZH11).

表2 不同類型osnac2d突變體植株及其野生型水稻(WT)的農(nóng)藝性狀

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤; 同列數(shù)據(jù)后相同字母表示在0.05水平上差異不顯著, 不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

Data in the table are presented as average values ± standard deviation; values followed by the same letter within the same column are not significantly different at the 0.05 probability level, and values followed by the different letter within the same column are significantly different at the 0.05 probability level.

2.7 osnac2d突變體中OsNAC2d響應干旱脅迫的表達情況

進一步對的表達量檢測發(fā)現(xiàn), 在完全營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下,與突變體中的表達量顯著低于野生型ZH11, 當處于PEG脅迫條件下時,與突變體中的表達量較其在完全營養(yǎng)液培養(yǎng)時未發(fā)生顯著變化, 表達水平維持在較低水平, 并顯著低于野生型ZH11, 而野生型ZH11中的表達量則被PEG脅迫誘導增強, 較其在完全營養(yǎng)液中的表達水平顯著提升(圖9)。

圖6 osnac2d突變體與野生型水稻在含15%的PEG-6000營養(yǎng)液脅迫下的表型

A和D為野生型水稻中花11, B和E為突變體, C和F為突變體, 對照組為完全營養(yǎng)液培養(yǎng), PEG-6000處理時長為14 d。

A and D denote wild type ZH11, B and E denotemutant, C and F denotemutant. The control group is the seedlings incubated in the complete nutrient solution. The duration of PEG-6000 treatment is 14 days.

圖7 osnac2d突變體與野生型ZH11在含15%的PEG-6000營養(yǎng)液中的長勢情況

A為根系長度, B為地上部長度, C為植株總長度, 對照組為完全營養(yǎng)液培養(yǎng), PEG-6000處理時長為14 d, 不同字母表示在< 0.05水平的顯著性差異。

A: the length of root; B: the length of seedling; C: the length of whole plant. The control group is the seedlings incubated in the complete nutrient solution. The duration of PEG-6000 treatment is 14 d. Different lowercase letters above the columns are significantly different at the 0.05 probability level.

3 討論

隨著水資源短缺與全球降雨不均勻分布, 干旱已成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最大、最廣泛的非生物脅迫因子, 嚴重影響農(nóng)作物的生長和發(fā)育, 限制農(nóng)作物增產(chǎn), 并造成嚴重的產(chǎn)量損失, 制約著農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的有效產(chǎn)出[4,20]。農(nóng)作物耐旱性研究與抗旱品種選育, 是在有限水資源條件下緩解農(nóng)作物產(chǎn)量損失, 并保障農(nóng)作物產(chǎn)量穩(wěn)定的有效途徑之一。作物耐旱性相關(guān)新基因的發(fā)掘及功能研究, 對通過分子標記輔助育種、新種質(zhì)資源的精確設(shè)計選育等具有積極的實踐指導價值。

圖8 osnac2d突變體與野生型ZH11在含15%的PEG-6000營養(yǎng)液中的生物量

A為根系生物量, B為地上部生物量, C為植株總生物量, 對照組為完全營養(yǎng)液培養(yǎng), PEG-6000處理時長為14 d, 不同字母表示在< 0.05水平的顯著性差異。

A: the root biomass; B: the above-ground biomass; C: the total biomass of whole plant. The control group is the seedlings incubated in the complete nutrient solution. The duration of PEG-6000 treatment is 14 days. Different lowercase letters above the columns are significantly different at the 0.05 probability level.

CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)是近十多年來發(fā)展的對靶基因進行快速、準確剪切修復的編輯技術(shù), 能快速高效地對目標性狀基因進行編輯突變, 獲得性狀改良并可穩(wěn)定遺傳的純合突變株系, 極大地縮短了育種周期, 已在多種作物突變體種質(zhì)資源創(chuàng)建中得到應用[21-25]。在本研究中, 為探索的生物功能, 借助CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng), 設(shè)計雙編輯靶點, 突變粳稻ZH11中的基因, 共獲得10株T0代陽性轉(zhuǎn)化再生植株(圖4), 通過對T2代植株進行測序分析, 得到6種在2個靶點區(qū)域均產(chǎn)生純合突變的后代分離植株(圖5), 并獲得了在靶點1區(qū)域呈短片段堿基缺失的、、等3個純合突變體, 其中突變體與是T0代雜合突變體在T2代的分離純合后代。此外, 突變體、、在靶點1處插入1個A堿基, 但在靶點2處分別缺失1或3個堿基, 其中和突變體在T0代即為純合突變株系, 在T2代未檢測到新的分離后代。與單靶點編輯方式多產(chǎn)生單堿基插入或缺失突變相比[26-27],雙靶點編輯植株的突變類型較為豐富, 增加了基因突變頻率, 較易從后代分離植株中篩選到呈片段化缺失的突變類型, 并且通過對T2代分離后植株目標基因直接進行擴增測序, 消除了T0代植株中的雜合突變、雙等位突變等的干擾, 能快速獲得可穩(wěn)定遺傳的純合突變植株。

圖9 osnac2d-6、osnac2d-4-2突變體和野生型ZH11中OsNAC2d基因在15%的PEG-6000脅迫下的表達水平

對照組為完全營養(yǎng)液培養(yǎng), 不同字母表示在< 0.05水平的顯著性差異。

The control group is the seedlings incubated in the complete nutrient solution. Different letters above the columns are significantly different at the 0.05 probability level.

NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物響應干旱、高低溫和高鹽等非生物逆境脅迫過程中起重要調(diào)節(jié)作用[28], 尤其在干旱條件下, NAC轉(zhuǎn)錄因子能顯著影響植株對干旱脅迫的耐受性[29], 如轉(zhuǎn)錄因子ANAC19、ANAC55和ANAC72的基因過量表達能改善擬南芥的耐旱性[30]; 番茄轉(zhuǎn)錄因子SINAC35依賴于ABA途徑調(diào)控生長素代謝關(guān)鍵響應因子ARF1、ARF2、ARF8 (auxin response factor, ARF)的表達水平, 促進根系生長發(fā)育,進而提高番茄的抗旱性[31]; 在水稻中, 轉(zhuǎn)錄因子OsNAC3[16]、OsNAC5[15]、OsNAC6[32]、OsNAC9[13]、OsNAC22[33]等的調(diào)控基因過表達均能提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力, 是干旱脅迫的正調(diào)控響應因子; 相反, 轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2表達量則受干旱脅迫抑制, 并且RNAi植株表現(xiàn)出較強的抗干旱能力, 而基因過表達則未改善植株的抗旱性, 表明OsNAC2是一個干旱脅迫的負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[34]。在本研究中,突變體株系在田間正常種植條件下的株高、有效穗、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重、單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀均與野生型ZH11無顯著差異(表2), 表明轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d并未對植株正常種植調(diào)節(jié)下的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。在干旱脅迫條件下,-和--突變體幼苗的生長發(fā)育受到顯著抑制, 植株變得矮小、瘦弱(圖6), 突變體植株的根長、苗長、根系生物量、地上部生物量等均顯著低于其在正常營養(yǎng)液中的長勢(圖7和圖8), 突變體植株中表達量較低, 且未被干旱脅迫誘導, 而野生型的表達水平則被干旱誘導提高到約2.5倍(圖9), 表明水稻基因表達被抑制后, 植株的耐干旱能力下降, 轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d以正調(diào)控方式響應環(huán)境干旱脅迫。圖7-A結(jié)果表明, 干旱脅迫顯著抑制和突變體的根系延伸, 而野生型ZH11的根系伸長未受到抑制, 但干旱脅迫引起、突變體和野生型ZH11的根系生物量均較其在完全營養(yǎng)液中顯著降低(圖8-A), 表明根系作為感受土壤水分的直接器官, 更易遭受干旱脅迫損傷, 其中基因變異導致突變體水稻根系的伸長生長與物質(zhì)積累均被抑制, 而野生型水稻為保持植株生長發(fā)育的水分需求, 根系維持缺水脅迫下的伸長生長, 以提升對水分的吸收。饒玉春等[35]認為, 在遭受干旱脅迫時, 水稻根系加速伸長生長以促進水分吸收, 但根系伸長生長消耗較多的碳氮同化物質(zhì), 而隨著干旱脅迫程度加劇, 必然導致根系的生物量積累減少。此外, 田間干旱試驗表明, 水稻早期遭遇干旱脅迫, 會導致秧苗質(zhì)量下降, 分蘗發(fā)生推遲; 在分蘗至開花期遭遇干旱脅迫, 引起根系對土壤肥料吸收減少, 葉片擴展減緩, 并降低葉片的光合作用, 減少有效分蘗數(shù)和有效穗, 最終影響稻谷產(chǎn)量[36]。本研究通過水培試驗進一步證實, 在秧苗期干旱脅迫時,、突變體等干旱脅迫敏感水稻根系的伸長和干物質(zhì)積累受到抑制, 并影響了地上部組織生長。

水稻OsNAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)干旱脅迫響應的作用機制存在一定差異, 如轉(zhuǎn)錄因子OsSNAC1調(diào)控葉片氣孔關(guān)閉, 以減少葉片細胞的水分丟失[10]; OsNAC3能清除干旱、高溫等脅迫引起的組織細胞內(nèi)活性氧積累, 維持逆境脅迫下的細胞內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài)[14]; OsNAC5通過啟動植株耐旱基因表達, 并調(diào)控根皮層與中柱細胞數(shù)目, 促使根系變粗, 提高抗旱能力[12-13]; OsNAC9則通過調(diào)節(jié)根系的中柱與通氣組織結(jié)構(gòu), 進而改善植株的根型構(gòu)造, 以維持植株的耐旱性[11]。在本研究中,基因主要在籽粒中大量表達, 其次為葉片和花藥, 在根系與莖中表達量則顯著低于籽粒、葉片和花藥(圖1-A), 并且受干旱脅迫誘導(圖1-B)。Zhang等[37]報道玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmNAC128和ZmNAC130在種子胚乳中高表達, 調(diào)節(jié)灌漿期種子中的淀粉和蛋白質(zhì)積累過程; 水稻轉(zhuǎn)錄因子OsNAC127和OsNAC129在籽粒中特異性表達, 通過調(diào)控碳水化合物轉(zhuǎn)運和鈣信號途徑而調(diào)節(jié)籽粒在干旱、高溫等逆境脅迫下的灌漿過程[38], 本研究發(fā)現(xiàn)籽粒中高表達的轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d可能在籽粒灌漿階段的逆境響應與種子成熟脫水過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。此外, 在干旱脅迫下,突變體株系的地上部生物量顯著低于野生型(圖8-B), 而根系生物量與野生型并無顯著差異(圖8-A), 表明轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d通過參與調(diào)控葉片的組織活動與生理代謝而響應環(huán)境干旱脅迫。研究結(jié)果對水稻干旱逆境適應性品種的分子改良與選育具有積極意義, 并為進一步揭示OsNAC2d響應干旱脅迫的生物學調(diào)控機制提供了合理的突變種質(zhì)資源, 我們將在后續(xù)研究中進一步探究轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d的生物學功能及其在籽粒灌漿階段的逆境響應作用。

4 結(jié)論

借助CRISPR/Cas9編輯與測序技術(shù), 得到6種基因型純合突變植株。突變體植株與野生型相比, 在田間正常生長條件下的株高、有效穗、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重和單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀無顯著差異。在干旱脅迫時,突變體植株的根系與幼苗生長、以及植株生物量積累均受到抑制, 且轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d的基因表達維持在較低水平, 而野生型水稻中的表達量則因干旱誘導而增加, 植株的生長與生物量積累未被顯著抑制, 表明轉(zhuǎn)錄因子OsNAC2d正調(diào)控水稻的干旱脅迫響應過程。

[1] 張海淼, 李洋, 劉海峰, 孔令廣, 丁新華. 水稻重要農(nóng)藝性狀調(diào)控基因及其育種利用研究進展. 生物技術(shù)通報, 2020, 36(12): 155–169.

Zhang H M, Li Y, Liu H F, Kong L G, Ding X H. Research progress on regulatory genes of important agronomic traits and breeding utilization in rice., 2020, 36(12): 155–169 (in Chinese with English abstract).

[2] 張洪程, 胡雅杰, 楊建昌, 戴其根, 霍中洋, 許軻, 魏海燕, 高輝, 郭保衛(wèi), 邢志鵬, 胡群. 中國特色水稻栽培學發(fā)展與展望. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2021, 54: 1301–1321.

Zhang H C, Hu Y J, Yang J C, Dai Q G, Huo Z Y, Xu K, Wei H Y, Gao H, Guo B W, Xing Z P, Hu Q. Development and prospect of rice cultivation in China., 2021, 54: 1301–1321 (in Chinese with English abstract).

[3] Bernier J, Atlin G, Serraj R, Kumar A, Spaner D. Breeding upland rice for drought resistance., 2008, 88: 927–939.

[4] 王英, 張浩, 馬軍韜, 張麗艷, 鄧凌偉, 王永力, 高晶, 張國民.水稻抗旱研究進展與展望. 熱帶作物學報, 2018, 39: 1038–1043.

Wang Y, Zhang H, Ma J T, Zhang L Y, Deng L W, Wang Y L, Gao J, Zhang G M. Advances in drought tolerance of rice., 2018, 39: 1038–1043 (in Chinese with English abstract).

[5] Zhang Q F. Strategies for developing green super rice., 2017, 104: 16402–16409.

[6] 郭韜, 余泓, 邱杰, 李家洋, 韓斌, 林鴻宣. 中國水稻遺傳學研究進展與分子設(shè)計育種. 中國科學: 生命科學, 2019, 49: 1185–1212.

Guo T, Yu H, Qiu J, Li J Y, Han B, Lin H X. Advances in rice genetics and breeding by molecular design in China., 2019, 49: 1185–1212 (in Chinese with English abstract).

[7] Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M. Genes involved in organ separation in: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant., 1997, 9: 841–857.

[8] Souer E, Houwelingen A V, Kloos D, Mol J, Koes R. The no apical meristem gene of Petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries., 1996, 85: 159–170.

[9] 柳展基, 邵鳳霞, 唐桂英. 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)功能及其表達調(diào)控研究進展. 西北植物學報, 2007, 27: 1915–1920.

Liu Z J, Shao F X, Tang G Y. The research progress of structure, function and regulation of plant NAC transcription factors., 2007, 27: 1915–1920 (in Chinese with English abstract).

[10] 李鵬, 黃耿青, 李學寶. 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子. 植物生理學通訊, 2010, 46: 294–300.

Li P, Huang G Q, Li X B. Plant NAC transcription factors., 2010, 46: 294–300 (in Chinese).

[11] Nuruzzaman M, Manimekalai R, Sharoni A M, Satoh K, Kondoh H, Ooka H, Kikuchi S. Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice., 2010, 465: 30–44.

[12] Hu H H, Dai M Q, Yao J L, Xiao B Z, Li X H, Zhang Q F, Xiong L Z. Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcrition factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice., 2006, 103: 12987–12992.

[13] Redillas M C, Jeong J S, Kim Y S, Jung H, Bang S W, Choi Y D, Ha S H, Reuzeau C, Kim J K. The overexpression ofalters the root architecture of rice plants enhancing drought resistance and grain yield under field conditions., 2012, 10: 792–805.

[14] Takasaki H, Maruyama K, Kidokoro S, Ito Y, Fujita Y, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, Nakashima K. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factorregulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice., 2010, 284: 173–183.

[15] Jeong J S, Kim Y S, Redillas M C Jang G, Jung H, Bang S W, Choi Y D, Ha S H, Reuzeau C, Kim J K.overexpression enlarges root diameter in rice plant leading to enhanced drought tolerance and increased grain yield in the field., 2013, 11: 101–114.

[16] Fang Y J, Liao K F, Du H, Xu Y, Song H Z, Li X H, Xiong LZ. A stress-responsive NAC transcription factorconfers heat and drought tolerance through modulation of reactive oxygen species in rice., 2015, 66: 6803–6817.

[17] Li Z, Pan X, Guo X, Fan K, Lin W. Physiological and transcriptome analyses of early leaf senescence formutant rice (L.) during the grain-filling stage., 2019, 20: 1098.

[18] 李兆偉, 零東蘭, 孫聰穎, 曾慧玲, 劉凱基, 藍穎珊, 范凱, 林文雄. 利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向編輯水稻. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2021, 54: 2699–2709.

Li Z W, Ling D L, Sun C Y, Zeng H L, Liu K J, Lan Y S, Fan K, Lin W X. CRISPR/Cas9 targeted editing ofin rice., 2021, 54: 2699–2709 (in Chinese with English abstract).

[19] Ma X L, Zhang Q, Zhu Q, Liu W, Chen Y, Qiu R, Wang B, Yang Z, Li H, Lin Y, Xie Y, Shen R, Chen S, Wang Z, Chen Y, Guo J, Chen L, Zhao X, Dong Z, Liu Y G. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants., 2015, 8: 1274–1284.

[20] 沈少炎, 吳玉香, 鄭玉善. 植物干旱脅迫響應機制研究進展——從表型到分子. 生物技術(shù)進展, 2017, 7(3): 169–176.

Shen S Y, Wu Y X, Zheng Y S. Review on drought response in plants from phenotype to molecular., 2017, 7(3): 169–176 (in Chinese with English abstract).

[21] Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Patron N J, Nekrasov V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9., 2015, 32: 76–84.

[22] Bhatta B P, Malla S. Improving horticulture cropsCRISPR/ Cas9: current successes and prospects.(Basel), 2020, 9: 1360.

[23] Yimam Y T, Zhou J, Akher S A, Zheng X, Qi Y, Zhang Y. Improving a quantitative trait in rice by multigene editing with CRISPR-Cas9., 2021, 2238: 205–219.

[24] Rao MJ, Wang L. CRISPR/Cas9 technology for improving agronomic traits and future prospective in agriculture., 2021, 254: 68.

[25] Ren C, Liu Y, Guo Y, Duan W, Fan P, Li S, Liang Z. Optimizing the CRISPR/Cas9 system for genome editing in grape by using grape promoters., 2021, 8: 52.

[26] 黃忠明, 周延彪, 唐曉丹, 趙新輝, 周在為, 符星學, 王凱, 史江偉, 李艷鋒, 符辰建, 楊遠柱. 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的水稻溫敏不育基因突變體的構(gòu)建. 作物學報, 2018, 44: 844–851.

Huang Z M, Zhou Y B, Tang X D, Zhao X H, Zhou Z W, Fu X X, Wang K, Shi J W, Li Y F, Fu C J, Yang Y Z. Construction ofmutants in rice based on CRISPR/Cas9 technology., 2018, 44: 844–851 (in Chinese with English abstract).

[27] 季新, 李飛, 晏云, 孫紅正, 張靜, 李俊周, 彭廷, 杜彥修, 趙全志. 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的水稻光敏色素互作因子基因編輯. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2017, 50: 2861–2871.

Ji X, Li F, Yan Y, Sun H Z, Zhang J, Li J Z, Peng T, Du Y X, Zhao Q Z. CRISPR/Cas9 system-based editing of phytochrome- interacting factor., 2017, 50: 2861–2871 (in Chinese with English abstract).

[28] 黃前量, 徐慶國, 殷緒明. 水稻NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與功能初步分析. 分子植物育種, 2022, 20: 5229–5235.

Huang Q L, Xu Q G, Yin X M. Cloning and functional analysis of, a NAC transcription factor gene from rice., 2022, 20: 5229–5235.

[29] 王春雨, 張茜. 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子功能研究進展. 生物技術(shù)通報, 2018, 34(11): 8–14.

Wang C Y, Zhang Q. Research progress on plant NAC transcription factors., 2018, 34(11): 8–14 (in Chinese with English abstract).

[30] 張慧珍, 白雪芹, 曾幼玲. 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的生物學功能. 植物生理學報, 2019, 55: 915–924.

Zhang H Z, Bai X Q, Zeng Y L. Biological functions of plant NAC transcription factors., 2019, 55: 915–924 (in Chinese with English abstract).

[31] Tran L S, Nakashima K, Sakuma Y, Simpson S D, Fujita Y, Maruyama K, Fujita M, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Isolation and functional analysis ofstress inducible NAC transcription factors that bind to a drought responsive-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter., 2004, 16: 2481–2498.

[32] Wang G, Zhang S, Ma X, Wang Y, Kong F, Meng Q. A stress-associated NAC transcription factor (SlNAC35) from tomato plays a positive role in biotic and abiotic stresses., 2016,158: 45–64.

[33] Nakashima K, Tran L P, Nguyen D V, Fujita M, Maruyama K, Todaka D, Ito Y, Hayashi N, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice., 2007, 51: 617–630.

[34] Hong Y, Zhang H, Huang L, Li D, Song F. Overexpression of a stress-responsive NAC transcription factor geneimproves drought and salt tolerance in rice., 2016, 7: 4.

[35] 羅莉瓊, 呂波, 陳旭, 李捷, 明鳳.通過ABA依賴途徑負調(diào)控水稻的多種非生物脅迫反應. 復旦學報(自然科學版), 2016, 55(1): 89–96.

Luo L Q, Lyu B, Chen X, Li J, Ming F.negatively regulates various abiotic stress through ABA-dependent pathway in rice.(Nat Sci Edn), 2016, 55(1): 89–96 (in Chinese with English abstract).

[36] 饒玉春, 戴志俊, 朱怡彤, 姜嘉驥. 水稻抗干旱脅迫的研究進展. 浙江師范大學學報(自然科學版), 2020, 43(4): 417–429.

Rao Y C, Dai Z J, Zhu Y T, Jiang J J. Advances in research of drought resistance in rice.(Nat Sci Edn), 2020, 43(4): 417–429 (in Chinese with English abstract).

[37] 梅德勇, 王士梅, 朱啟升, 陳秀晨, 龔存力, 韓云芳, 于智坤. 水稻抗旱性遺傳生理機制及育種研究進展. 安徽農(nóng)學通報, 2016, 22(22): 10–14.

Mei D Y, Wang S M, Zhu Q S, Chen X C, Gong C L, Han Y F, Yu Z K. Progress on the genetic and physiological mechanism of rice drought resistance and breeding strategies., 2016, 22(22): 10–14 (in Chinese with English abstract).

[38] Zhang Z, Dong J, Ji C, Wu Y, Messing J. NAC-type transcription factors regulate accumulation of starch and protein in maize seeds., 2019, 116: 11223–11228.

[39] Ren Y, Huang Z, Jiang H, Wang Z, Wu F, Xiong Y, Yao J. A heat stress responsive NAC transcription factor heterodimer plays key roles in rice grain filling., 2021, 72: 2947–2964.

Construction of rice mutants by gene editing ofand their response to drought stress

LI Zhao-Wei1,2, MO Zu-Yi1,2, SUN Cong-Ying1,2, SHI Yu1,2, SHANG Ping2,3, LIN Wei-Wei1,2, FAN Kai2,3, and LIN Wen-Xiong1,2,*

1College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;2Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;3College of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

The main objective of this study is to explore the biological function of transcription factor OsNAC2d and its effect on drought resistance in rice. The sequence ofwas firstly edited invariety Zhonghua 11 through the CRISPR/Cas9 technology. The agronomic traits ofmutants were investigated in normal field cultivation, and the growth status and relative expression level ofgenes were performed in the young mutant seedlings under the drought condition. There was the higher expression level ofin grain, leaf, and anther than those in root and stem, and the relative expression ofwas enhanced by drought stress. Six homozygous T2lines were identified in two editing target sites ofgenomic sequence through the nucleotide sequencing technology. There was no significant difference betweenmutants and wild type in the agronomic traits including plant height, effective panicle number per plant, panicle length, grain number per panicle, seed setting rate, 1000-grain weight, and grain yield per plant. Under the drought condition, the growth of roots and seedling ofmutants were depressed, and the biomass of roots and above-ground were also decreased. Meanwhile, the relative expression ofin themutant retained as extremely low level as those in the normal cultivating condition. However, the relative expression ofin wild type was enhanced by drought stress, and the growth and biomass accumulation of wild type were not evidently hindered by drought stress. These results indicated that OsNAC2d positively regulated the drought response in rice. Themutants in this present study provided a precious genetic resource for deeply revealing the biological function of OsNAC2d and its fine regulating mechanism in response to drought stress.

rice; drought stress; gene editing;gene

10.3724/SP.J.1006.2023.12076

本研究由福建省自然科學基金項目(2021J01098, 2022J01142)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province (2021J01098, 2022J01142).

林文雄, E-mail: wenxiong181@163.com

E-mail: lizw197@163.com

2021-11-05;

2022-06-07;

2022-07-08.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220707.1349.008.html

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