細胞器之間相互作用在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用

劉天會

首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院 肝病中心， 北京 100050

細胞器可以通過膜接觸位點與其他細胞器相互作用，完成物質(zhì)與信息的交換，形成互作網(wǎng)絡[1]。越來越多的研究[2]證實，細胞器互作網(wǎng)絡的紊亂與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。線粒體功能損傷是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發(fā)病機制中重要的一環(huán)，在非酒精性肝脂肪變進展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的過程中發(fā)揮重要作用[3-6]。肝細胞中異常增多的脂滴是NAFLD的特征性病理表現(xiàn)，近期，脂滴和其他細胞器之間的相互作用成為細胞生物學研究的熱點[7]。本文主要聚焦于NAFLD中線粒體、脂滴與其他細胞器之間的相互作用。

1 細胞器之間相互作用概述

1.1 細胞器之間相互接觸在細胞中廣泛存在 真核細胞中存在多種由單層或雙層膜包圍的亞細胞結(jié)構(gòu)——細胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、脂滴、高爾基體、溶酶體等。細胞器看似相對獨立，各自具有特定的生物學功能。實際上，這些細胞器常常相互接觸，通過精細分工、相互協(xié)作，維持細胞的正常功能[1]。

應用多光譜熒光圖像采集方法，研究者[8]觀察了成纖維細胞中細胞器的大小、位置和相互接觸等信息，對六種細胞器(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、線粒體和脂滴)之間相互接觸的頻率及動態(tài)變化進行了系統(tǒng)描述。結(jié)果顯示：幾乎所有細胞器都可以與其他種類的細胞器形成接觸，且這種接觸呈現(xiàn)高度動態(tài)變化的特點。在細胞生長的不同階段，不同細胞器之間的接觸頻率會隨時間發(fā)生改變。當細胞接受不同外來刺激時，細胞器之間的接觸也會發(fā)生特定的改變。細胞器之間相互作用依賴于完整的由微管組成的細胞骨架，如果應用微管聚合抑制劑破壞正常的細胞骨架，除了高爾基體與溶酶體的接觸增加，其他細胞器之間的相互接觸均顯著減少[8]。

1.2 細胞器之間相互作用通過膜接觸位點實現(xiàn) 細胞器之間的相互作用是通過細胞器之間形成的微小膜連接實現(xiàn)的，這種膜連接被稱為膜接觸位點 (membrane contact sites，MCS)[9]。MCS通常是由細胞器膜上的特定蛋白互相結(jié)合形成的，這些蛋白除了參與形成MCS，通常還具有其他的重要功能。例如，羥甾醇結(jié)合蛋白參與形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體之間的MCS，同時還具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移的功能。

通過形成MCS，細胞器之間的距離被拉近，這一距離可以在一定范圍內(nèi)發(fā)生變化。例如，在哺乳動物細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜之間的距離在19～22 nm發(fā)生動態(tài)變化[10]；而在釀酒酵母中，這一距離變化范圍為17～57 nm[11]。當胞質(zhì)中鈣離子濃度升高時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜之間的距離縮短，提示細胞器之間距離的變化可能具有特殊的意義[10]。另外，根據(jù)細胞功能的需要，MCS可以發(fā)生動態(tài)改變，也可以穩(wěn)定存在。有的MCS持續(xù)時間在10 s以下，有的甚至低于1 s。在胰島素分泌細胞中，胞質(zhì)鈣離子濃度升高促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白TMEM24磷酸化，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與質(zhì)膜之間的MCS解離；而TMEM24蛋白去磷酸化后MCS恢復；上述MCS的動態(tài)變化對于胰島素脈沖式分泌至關重要[12]。在肌肉細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜之間的MCS參與肌肉的興奮收縮耦聯(lián)過程，這種MCS可以持續(xù)存在[13]。

1.3 細胞器通過相互作用完成重要的生理功能 細胞器之間通過相互作用，可以進行離子、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)等的交換及轉(zhuǎn)移，還可以參與細胞器生物合成及分裂等重要過程[1,9]。MCS中常常富含脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白家族成員(lipid transfer proteins，LTP)，LTP可同時存在于兩個細胞器的膜上，形成連接細胞器的橋梁或通道，完成脂質(zhì)在細胞器之間的轉(zhuǎn)移[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三磷酸肌醇受體與線粒體膜上的電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75之間結(jié)合形成MCS，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的鈣離子傳輸，維持線粒體鈣離子穩(wěn)態(tài)[9]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的肌動蛋白成核因子2和線粒體上的與甲酸結(jié)合的肌動蛋白成核蛋白1C在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸位點結(jié)合，促進肌動蛋白-肌球蛋白復合物形成，將動力相關蛋白1募集至線粒體外膜，促進線粒體收縮并完成裂變[15-16]。Wong等[17]的研究表明，線粒體裂變發(fā)生在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體三種細胞器之間的連接處，溶酶體上的Ras相關GTP結(jié)合蛋白7可促進溶酶體與線粒體接觸，參與線粒體分裂。另有研究[18]顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體相互作用與線粒體的融合也密切相關。

2 線粒體和細胞器之間相互作用與NAFLD

線粒體是細胞中糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所，其功能障礙是NAFLD發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)。越來越多的研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，線粒體可以與多種細胞器相互作用(圖1)，參與鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、胰島素抵抗等NAFLD相關的病理過程。

注：FFA，游離脂肪酸；IP3R，三磷酸肌醇受體；VDAC，電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白；GRP75，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75；IFN2，肌動蛋白成核因子2；Spire1C，與甲酸結(jié)合的肌動蛋白成核蛋白1C；Mfn2，線粒體融合蛋白2；Plin1，脂滴包被蛋白1；Plin5，脂滴包被蛋白5；ECI2，烯酰輔酶A異構(gòu)酶2；TOM20，線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20；RAB7，Ras相關GTP結(jié)合蛋白7。圖中使用的線粒體及高爾基體模式圖來自BioRender網(wǎng)站。

2.1 線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間相互作用與NAFLD 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞中面積最大的膜性細胞器，與大多數(shù)細胞器均存在密切接觸。其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體相互作用在NAFLD中的研究最為深入。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體形成多個接觸位點，這些接觸位點連在一起形成了線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關膜(mitochondria-associated membranes，MAM)，完整的MAM結(jié)構(gòu)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間鈣離子、活性氧及脂質(zhì)轉(zhuǎn)移的基礎[21-22]。

在NAFLD患者的肝臟中，MAM的完整性被破壞，表現(xiàn)為膜之間空間距離的改變及MAM中蛋白組成的變化。MAM中含有多種參與調(diào)控鈣離子轉(zhuǎn)移及糖脂代謝的蛋白，其完整性的破壞可導致鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，引起接下來的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和胰島素抵抗，進而導致凋亡及炎癥等病理改變，促進NAFLD的進展[21-22]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2通過影響磷脂代謝調(diào)控MAM的完整性。在NASH患者肝組織中，Mfn2表達顯著降低。與此相一致，在高脂飲食及膽堿-蛋氨酸缺乏飲食誘導的NASH小鼠肝組織中，Mfn2表達也顯著降低。特異性敲除肝組織Mfn2基因，小鼠出現(xiàn)肝組織慢性炎癥及脂質(zhì)代謝異常，肝細胞凋亡和纖維化相關基因表達增加。通過尾靜脈注射Mfn2重組腺病毒，使基因敲除小鼠重新表達Mfn2，小鼠脂質(zhì)代謝異常得到恢復，纖維化及促炎基因的表達也顯著降低[23]。一些對NAFLD有效的治療藥物，如羅格列酮及二甲雙胍等有助于恢復MAM的完整性[22]。上述研究提示，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的相互作用有可能成為治療NAFLD的新策略。

2.2 線粒體和脂滴之間相互作用與NAFLD 棕色脂肪細胞中存在兩群線粒體，一群與脂滴相互獨立存在，被稱為胞漿線粒體；另一群線粒體與脂滴密切接觸，被稱為脂周線粒體(peridroplet mitochondria，PDM)。進一步的研究[24-27]顯示，PDM與脂滴以緊密錨定的方式穩(wěn)定結(jié)合，用除垢劑或者胰蛋白酶處理后，兩者之間的連接仍未受到破壞。與胞漿線粒體相比，PDM有較強的丙酮酸氧化和ATP合成能力，而脂肪酸β-氧化能力較弱。這些功能特點為甘油三酯(TG)合成提供了ATP，促進脂肪酸以TG的形式儲存在脂滴中，同時減少了脂肪酸氧化[24]。

肝臟脂肪變性時線粒體功能的改變與棕色脂肪中PDM的功能特點有很強的相似性[28]。電鏡下可以觀察到高脂飲食的小鼠肝臟中線粒體與脂滴相互接觸[29]，提示PDM也存在于脂肪變的肝組織中。Plin5可以促進線粒體和脂滴相互接觸，形成PDM[24,30]，將脂肪酸以TG的形式儲存于脂滴中，緩沖多余的FFA，保護肝細胞免于脂毒性[31]。Plin5可以通過促進脂滴與線粒體接觸，上調(diào)線粒體功能相關基因，降低細胞活性氧水平，保護肝細胞免受氧化應激[32]。如果敲除Plin5，肝臟脂變減輕，但脂肪分解產(chǎn)生的FFA增加，引起脂毒性損傷[33]。另一方面，當胞漿中脂肪酸含量增加時，線粒體與脂滴接觸位點的Plin5增加，介導脂肪酸直接從脂滴進入線粒體，促進脂肪酸的氧化利用，減少胞漿中高濃度脂肪酸產(chǎn)生的脂毒性[34-35]。上述研究提示，PDM在NAFLD的發(fā)病過程中可能發(fā)揮保護作用。

2.3 線粒體和其他細胞器之間相互作用與NAFLD 線粒體與其他細胞器之間也存在相互作用，參與調(diào)控鈣離子傳輸、線粒體分裂及脂代謝等重要過程，提示其在NAFLD發(fā)生過程中可能也發(fā)揮相應的作用。線粒體與高爾基體之間的相互作用參與了鈣離子及ATP向高爾基體傳遞的過程[20]。上文中提到，溶酶體可以通過與線粒體相互作用，參與線粒體的分裂過程[17]。最近的證據(jù)[36-37]還表明，線粒體通過膜上的外膜轉(zhuǎn)位酶和過氧化物酶體上的ECI2與過氧化物酶體相互作用，調(diào)控類固醇生物合成。另外，過氧化物酶體還負責將長鏈脂肪酸運送至線粒體中完全氧化分解，提示線粒體與過氧化物酶體相互作用在脂代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用[20]。

3 脂滴和細胞器之間相互作用與NAFLD

脂滴是一種具有中性脂質(zhì)核心的多功能膜性細胞器，可以與多種細胞器相互作用[7,38-39]，發(fā)揮重要的代謝調(diào)控功能[40-41]。肝細胞中脂滴積聚引起的大泡脂變是NAFLD的主要病理學特征，脂滴與細胞器之間的相互作用成為NAFLD新的研究熱點(圖2)[42-43]。

注：UBXD8，泛素調(diào)節(jié)X結(jié)構(gòu)域蛋白8；TGN，高爾基體反面囊膜；VPS13B，液泡蛋白分選相關蛋白13B；DGAT2，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶2；CCTα，磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶α；ATGL，脂肪甘油三酯脂肪酶。圖中使用的細胞核及高爾基體模式圖來自BioRender網(wǎng)站。

3.1 脂滴和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間相互作用與NAFLD 脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的相互作用存在兩種方式：第一種稱為膜橋，由連續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與脂滴膜共同組成，常存在于脂滴生成的過程中；Seipin蛋白是促進膜橋穩(wěn)定結(jié)合的關鍵蛋白，干預Seipin表達可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡及脂質(zhì)異常累積。第二種是經(jīng)典的MCS，由分別定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及脂滴膜上的蛋白形成復合體連接而成，常發(fā)生于成熟的脂滴離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后；如果干預復合體的形成，脂滴的擴增及TG的儲存受到影響[7,44-45]。

肝臟中的脂肪來源于脂肪組織分解產(chǎn)生的FFA、脂肪酸從頭合成及飲食攝入，而肝臟中合成的脂肪主要以極低密度脂蛋白(VLDL)的形式分泌，脂肪來源的增加及脂肪分泌障礙是引起NAFLD患者肝臟中脂質(zhì)增多的主要原因[46]。脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用在脂肪分解及VLDL合成分泌的過程中均發(fā)揮重要作用。成熟的脂滴會通過出芽的方式形成并釋放出微小的脂滴，此時脂滴中磷脂比例降低，表面張力增加；這種增加的表面張力會誘導脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間形成膜橋，并將ATGL從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)募集到脂滴上，促進脂肪分解[44]。在肝細胞中，載脂蛋白B(ApoB)是組裝分泌VLDL的關鍵分子；脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用通過調(diào)控ApoB降解影響VLDL的組裝。ApoB在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔側(cè)結(jié)合脂質(zhì)后在脂滴上積聚，接下來，ApoB從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔側(cè)轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)側(cè)，被泛素化后與脂滴胞質(zhì)側(cè)的UBXD8結(jié)合，運送至蛋白酶體降解。在UBXD8基因缺陷小鼠中，血清VLDL水平降低，肝臟脂肪變性增加[44]。在高脂飲食喂養(yǎng)的NAFLD小鼠肝組織中，脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的相互接觸增多，提示其可能影響脂肪的儲存及輸出過程[47]。

3.2 脂滴和高爾基體之間相互作用與NAFLD 脂滴與高爾基體相互作用可能參與了高爾基體分泌功能的調(diào)控。TGN是分選蛋白和脂質(zhì)到細胞特定部位的關鍵結(jié)構(gòu)，VPS13B可以介導TGN與脂滴之間形成膜接觸位點，是維持TGN完整性和功能的關鍵蛋白，VPS13B功能異常會導致蛋白質(zhì)分泌功能紊亂和脂質(zhì)代謝失衡[7]。

Krahmer等[47]通過免疫熒光雙染方法觀察了高爾基體與脂滴之間的相互作用，在正常小鼠肝組織中，高爾基體特異性蛋白僅存在于少數(shù)較大的脂滴上；在高脂飲食喂養(yǎng)12周的NAFLD小鼠肝組織中，高爾基體特異性蛋白與脂滴包被蛋白Plin2存在廣泛的共定位；進一步的體外研究也證實，在油酸處理的細胞中，高爾基體與脂滴的接觸增加；上述結(jié)果提示，脂質(zhì)負荷的增加促進高爾基體與脂滴的相互作用。在嚴重脂肪變性的小鼠肝組織中，高爾基體在細胞內(nèi)的分布發(fā)生改變，大量高爾基體的膜結(jié)構(gòu)碎片包裹在脂滴周圍；分離脂變肝組織中的原代肝細胞，結(jié)果顯示細胞的蛋白分泌能力顯著降低，提示嚴重脂肪變性時高爾基體與脂滴相互接觸增加，但TGN的完整性和功能可能受損[47]。

3.3 脂滴和其他細胞器之間相互作用與NAFLD 與細胞核相互接觸的脂滴被稱為核脂滴，核脂滴上含有TG和磷脂酰膽堿合成所需的DGAT2和CCTα，提示其可能參與脂代謝的調(diào)控。在產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的肝細胞中，內(nèi)核膜中核脂滴的數(shù)量顯著增多，提示NAFLD發(fā)病過程中核脂滴的形成可能存在異常[7,43]。溶酶體與脂滴相互作用形成自噬小體，分解脂滴中的中性脂肪，提供FFA進入能量代謝，這一過程被稱為脂自噬。在肝臟中，脂自噬是脂質(zhì)分解的主要途徑，而NAFLD患者肝組織中常常存在脂自噬的異常[48]。氧化應激和脂質(zhì)過氧化與NAFLD的發(fā)生密切相關，過氧化物酶體中富含抗氧化酶和負責產(chǎn)生活性氧的酶，在脂肪酸β-氧化及氧化還原穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。在油酸處理的細胞中，過氧化物酶體與脂滴形成穩(wěn)定的膜接觸位點，過氧化物酶體的內(nèi)膜可延伸至脂滴中[7]；對提取純化的脂滴進行蛋白組分析，發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體中的β-氧化酶在脂滴中富集[47]。上述結(jié)果提示，過氧化物酶體可以通過與脂滴相互作用影響氧化還原穩(wěn)態(tài)。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，細胞器之間相互作用在細胞中廣泛存在，通過離子、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)等的交換，完成細胞的各種功能；細胞器互作網(wǎng)絡的紊亂在鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、脂毒性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、胰島素抵抗、脂肪分解及輸出等NAFLD相關病理過程中發(fā)揮重要作用。目前，細胞器之間相互作用在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用還有許多未知的領域有待探索。以細胞器之間相互作用為切入點，進一步闡明NAFLD的發(fā)病機制，將為NAFLD藥物研發(fā)提供新的方向。

利益沖突聲明：作者聲明不存在利益沖突。