盡早啟動抗病毒治療降低慢性HBV感染者肝細(xì)胞癌發(fā)生風(fēng)險

周 召， 阿卜杜熱西提·阿卜來提， 顧智強， 常 靖， 劉 新， 魯鳳民,2

1 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系暨感染病研究中心， 北京 100191； 2 北京大學(xué)人民醫(yī)院 肝病研究所，北京 100044

慢性HBV感染是病毒性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)的主要病因。現(xiàn)階段，全球共有2.96億慢性HBV感染者[1]。我國現(xiàn)有慢性HBV感染者多達(dá)7000～8000萬人，其中慢性乙型肝炎(CHB)患者為2000～3000萬人[2]。原發(fā)性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是全球第三大癌癥致死病因[3]。 HCC為其最常見的組織學(xué)類型[4]。2020年，全球共有新確診HCC患者905 677例，死亡830 180例，其中，近45.3%的新增病例和47.1%的死亡病例發(fā)生在我國，而慢性HBV感染仍然是HCC的第一大病因，HBV相關(guān)HCC約占全球HCC的45%[3]。現(xiàn)有的抗病毒治療藥物包括核苷(酸)類似物(NUC)和聚乙二醇干擾素α(PEG-IFNα)兩類。前者口服方便，副作用小，可通過抑制HBV復(fù)制，減少CHB患者終末期肝病發(fā)生，已成為臨床最常用的抗病毒藥物。但由于大部分CHB患者抗病毒治療啟動較晚，治療率較低，在抗病毒實施近三十年后全球仍未見到HCC年診斷人數(shù)的下降。

大多數(shù)慢性HBV感染者從感染HBV到HCC通常會經(jīng)歷較為漫長的慢性肝炎和肝硬化階段。如何通過優(yōu)化現(xiàn)行抗病毒治療策略，如更早地啟動抗病毒治療、更強地病毒抑制以及合理地聯(lián)合用藥，以減少包括HCC在內(nèi)的終末期肝病的發(fā)生，是目前臨床高度關(guān)注的問題之一。本文就盡早啟動抗病毒治療，以阻止并減少HBV DNA整合和與之相關(guān)的肝細(xì)胞克隆性擴增，進(jìn)而降低HCC的發(fā)生風(fēng)險展開討論。

1 慢性HBV感染的自然病程分期

慢性HBV感染的疾病進(jìn)程是病毒、被感染的肝細(xì)胞及宿主免疫相互作用的博弈過程?；颊咦顬槌Ｒ姷难鍖W(xué)改變是HBeAg的陰轉(zhuǎn)及血清學(xué)轉(zhuǎn)換(抗-HBe抗體出現(xiàn))。該轉(zhuǎn)換可伴隨病毒復(fù)制的抑制、肝臟免疫病理損傷的相對緩解，以及肝損傷生化學(xué)指標(biāo)的復(fù)常等。因此，早在20世紀(jì)80年代，臨床醫(yī)生就已將CHB分為HBeAg陽性和HBeAg陰性兩大類。我國臺灣學(xué)者通過對慢性HBV感染者的隊列研究發(fā)現(xiàn)，存在一類以年齡相對較輕、HBV DNA水平較高、肝生化學(xué)指標(biāo)正常、肝組織學(xué)無或僅有輕微肝臟炎癥損傷為特征的HBeAg陽性感染者，并提出免疫耐受的概念[5]。隨后經(jīng)逐步完善，國際上于2006年正式提出了慢性HBV感染自然進(jìn)程的4個時相：免疫耐受期、免疫清除期、免疫控制期及疾病再活動期，并被廣泛采用[6-7]。近期，筆者團(tuán)隊結(jié)合歐美肝病學(xué)會有關(guān)自然進(jìn)程與患者疾病狀態(tài)的更新描述[8-9]，按照感染者不同疾病階段的病毒學(xué)特征、肝臟免疫病理損傷及臨床表現(xiàn)，進(jìn)一步將該自然病程分為4個免疫時相、5種疾病狀態(tài)：免疫耐受(HBeAg陽性慢性感染)、免疫清除狀態(tài)下的HBeAg陽性CHB和HBeAg陰性CHB、免疫控制(HBeAg陰性慢性感染)、乙型肝炎再活動[10]。目前各大指南均推薦對HBeAg陽性或陰性的CHB患者開展抗病毒治療。

2 擴大抗病毒治療漸成共識

一般認(rèn)為HBV感染通常不會對肝細(xì)胞造成直接損傷。CHB患者的肝損傷多為宿主免疫所致，特別是抗HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞通過殺傷作用清除感染肝細(xì)胞而導(dǎo)致的免疫病理損傷[11]。而宿主免疫介導(dǎo)的持續(xù)的肝臟炎癥不僅與肝纖維化、肝硬化密切相關(guān)，也是HBV相關(guān)HCC發(fā)生發(fā)展的主要驅(qū)動因素。此外，宿主肝細(xì)胞基因組中HBV DNA的整合是CHB致癌的另一重要機制。一系列研究[12-14]結(jié)果顯示，整合事件可發(fā)生于上述各個時期。對CHB患者廣泛開展抗病毒治療，以控制炎癥和減少HBV DNA整合，可顯著降低HCC的發(fā)生風(fēng)險。因此，我國學(xué)者[15]提出了“擴大慢性乙型肝炎抗病毒治療的專家意見”，推薦對所有30 歲以上的慢性HBV感染者進(jìn)行抗病毒治療。同時，筆者團(tuán)隊[16]也提出了“擴大慢性乙型肝炎抗病毒治療應(yīng)重視ALT正常、年齡≤30歲的HBeAg陰性慢性HBV感染者”的建議。

3 擴大抗病毒治療重點或在于盡早

最近，韓國Choi等[17]的一項多中心隊列研究結(jié)果促使我們重新思考對慢性HBV感染者啟動抗病毒治療的最佳時機問題。該研究共納入了2073例接受一線NUC治療的CHB患者。所有患者的基線HBV DNA均不低于 5.00 log10IU/mL，隨訪中共有47例患者發(fā)生HCC (0.39 每百人/年) 。對HCC發(fā)生風(fēng)險的Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)：基線病毒載量是患者發(fā)生HCC的獨立危險因素。而在著名的中位隨訪時間為11.4年、觀察人數(shù)為3653例的REVEAL-HBV前瞻性研究[18]中，作者探究了慢性HBV感染者中病毒載量與HCC發(fā)生風(fēng)險的生物劑量關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高水平血清HBV DNA是獨立于患者HBeAg狀態(tài)、ALT異常升高及是否有肝硬化的危險因素，血清HBV DNA水平越高其發(fā)生HCC的風(fēng)險越大。然而Choi等[17]的研究卻顯示，患者的HCC發(fā)生風(fēng)險隨患者治療前的基線病毒載量降低而升高。高基線病毒載量組(≥ 8.00 log10IU/mL)患者為最低，以5.00～5.99 log10IU/mL組為高 (P<0.001) 。

在慢性HBV感染的疾病進(jìn)程中，隨著免疫“耐受”的打破，進(jìn)入免疫清除期患者的血清HBV DNA水平隨宿主抗HBV特異性細(xì)胞免疫對感染肝細(xì)胞的清除而下降，而這一過程往往伴隨著肝組織的免疫病理損傷。據(jù)此，上述矛盾現(xiàn)象或可解釋為：與同齡的病毒載量仍高(≥8.00 log10IU/mL)的患者相比，其DNA水平的下降提示這些患者因更早、更強的宿主免疫造成更嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷，以及殘余肝細(xì)胞的選擇性克隆性增殖和病毒及宿主基因突變的積累，從而導(dǎo)致其HCC風(fēng)險的增加。著名的REVEAL-HBV研究及其他眾多的研究均觀察到抗病毒治療抑制病毒復(fù)制可降低HCC發(fā)生風(fēng)險，為此Choi等[17]提議對這些高病毒載量(≥8.00 log10IU/mL)的患者應(yīng)盡早開展抗病毒治療。這與現(xiàn)有主流指南[8-9]及我國“擴大慢性乙型肝炎抗病毒治療的專家建議”[15]中有關(guān)HCC風(fēng)險增加的患者應(yīng)啟動抗病毒治療的精神相契合。但需要注意的是，高病毒載量的慢性HBV感染者更多處于“免疫耐受”狀態(tài)，該類患者對抗病毒治療應(yīng)答往往相對欠佳。未來亟需研發(fā)有更強病毒抑制作用的抗HBV藥物。

4 致癌的HBV DNA整合事件在慢性HBV感染早期階段即已存在

20世紀(jì)80年代，Nature雜志連續(xù)發(fā)表了3篇有關(guān)HBV整合與HCC相關(guān)性的研究報道，后續(xù)一系列的研究基本闡明了HBV整合的致癌機制，即HBV DNA片段通過整合到宿主相關(guān)癌基因，影響染色體穩(wěn)定性，形成融合病毒蛋白來發(fā)揮促癌作用。Fox Chase癌癥研究所已故的Mason教授等[19]研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA整合在免疫耐受(HBeAg陽性慢性感染)階段即已發(fā)生。與筆者團(tuán)隊[20]早期依據(jù)肝癌組織整合HBV DNA所攜帶病毒突變的頻率所做的推斷一致，Larsson等[21]也發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性感染者的肝組織中均可檢測到HBV DNA的整合。

Tu等[22]的研究報道了帶有整合的肝細(xì)胞往往具有選擇性增殖優(yōu)勢，且克隆性擴增現(xiàn)象存在于慢性感染疾病進(jìn)程的各個時相。在Mason等[19]的前述研究中，作者也特別強調(diào)了攜帶整合HBV DNA片段的肝細(xì)胞存在克隆性擴增現(xiàn)象，且HBeAg陰性患者的最大肝細(xì)胞克隆大小遠(yuǎn)大于HBeAg陽性患者。這一現(xiàn)象提示，部分?jǐn)y帶了HBV DNA整合片段的肝細(xì)胞在反復(fù)的炎性壞死與代償性增殖過程中獲得了選擇性增殖優(yōu)勢。前文提到，活躍的肝細(xì)胞增殖有利于突變隨時間積累并最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。在肝硬化增生結(jié)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)結(jié)節(jié)性增生，即noduel in nodule,視為癌前病變或不典型增生結(jié)節(jié)[23]。與公認(rèn)的突變隨時間積累并最終導(dǎo)致肝癌發(fā)生的認(rèn)知相符合，筆者團(tuán)隊早期研究[19]的確發(fā)現(xiàn)癌組織的整合片段攜帶的突變相對于配對的癌旁組織更低。這提示癌組織的整合事件發(fā)生更早，有著更長時間的克隆性擴增歷程。綜上，應(yīng)強調(diào)及早開展干預(yù)治療，以減少或阻止整合事件的發(fā)生，這對于降低慢性HBV感染者HCC發(fā)生風(fēng)險至關(guān)重要。

5 抗病毒治療或可減少整合并降低HBV相關(guān)HCC發(fā)病風(fēng)險

HBV整合，即HBV DNA片段通過非同源末端連接或微同源末端連接重組的方式，連接到宿主基因組染色體DNA內(nèi)，形成病毒-宿主DNA連接[24]，被認(rèn)為是慢性HBV感染的主要致癌機制之一[20]。在感染肝細(xì)胞內(nèi)，HBV基因組共有3種存在形式：以微小染色體形式存在的共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)、正鏈不完整的松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)及HBV復(fù)制過程中出現(xiàn)的副產(chǎn)物雙鏈線性DNA(double strand linear DNA, dslDNA)[25]。顯而易見，雙末端均游離的dslDNA更易于通過微同源末端重組或非同源末端連接的方式插入宿主基因組斷裂處[26]。

現(xiàn)行最常用的NUC通過與內(nèi)源性dNTP競爭，抑制rcDNA、dslDNA的生成，并間接減少cccDNA池的補充。以PEG-IFNα為基礎(chǔ)的免疫調(diào)節(jié)藥物通過直接抑制病毒復(fù)制和增強宿主的抗病毒免疫，清除感染肝細(xì)胞并直接減少cccDNA的水平[27]。理論上講，NUC治療下dslDNA也會顯著減少。此外，筆者團(tuán)隊前期研究[28]發(fā)現(xiàn)， NUC治療下新合成的HBV“病毒顆粒”大多數(shù)存在復(fù)制性缺陷，無法建立新的感染。因此推測由于不可逆的NUC摻入終止，其入核后也難以被修補成完整的雙鏈線性病毒DNA插入宿主基因組。如圖1所示，以NUC為主的抗病毒治療能夠從源頭上抑制HBV復(fù)制、減少dslDNA的產(chǎn)生和整合事件的發(fā)生；而PEG-IFN α不僅可以抑制病毒復(fù)制，其對患者的免疫調(diào)節(jié)作用還能夠抑制甚至清除既存的攜帶整合DNA片段的克隆性擴增肝細(xì)胞。與筆者團(tuán)隊的預(yù)期一致，近期有研究[29-30]顯示，在經(jīng)過長期NUC治療的人群中，含有整合DNA片段的最大肝細(xì)胞克隆大小的確有所減小。這可能與長期NUC抑制病毒復(fù)制使dslDNA產(chǎn)生減少，從而從源頭上阻止整合事件的發(fā)生有關(guān)。

那么，攜帶了具有轉(zhuǎn)錄活性和完整S基因的HBV DNA整合片段的肝細(xì)胞克隆如何逃避宿主抗HBsAg特異性免疫清除呢？近期的一些對CHB患者抗病毒治療不同階段的肝活檢組織的RNA測序結(jié)果顯示，由來自整合的SP1、SP2啟動子所啟動的轉(zhuǎn)錄本往往在其458 nt的位置與宿主基因組發(fā)生剪接融合[31]。該剪接理論上可導(dǎo)致大、中、小表面抗原羧基端125個氨基酸缺失，并導(dǎo)致部分跨膜結(jié)構(gòu)域和羧基端抗原表位缺失。據(jù)此推測，盡管攜帶了HBV DNA的整合，但由于轉(zhuǎn)錄后的剪接帶來的病毒蛋白表達(dá)缺失，將有利于這些克隆性擴增肝細(xì)胞免疫逃逸?？紤]到整合主要是通過影響宿主整合到相關(guān)HCC基因的功能與活性[20]，上述現(xiàn)象將有利于HCC的最終發(fā)生。

6 問題與展望

對處于免疫耐受期的慢性HBV感染者進(jìn)行NUC治療，患者HBV DNA仍可普遍檢出。盡管按照擴大抗病毒治療共識對這些感染者啟動抗病毒治療或許并不能夠完全阻止核衣殼內(nèi)HBV DNA負(fù)鏈的合成，但筆者團(tuán)隊的研究[28]結(jié)果顯示，NUC的摻入不可逆地終止逆轉(zhuǎn)錄過程中負(fù)鏈DNA的合成，可以在一定程度上阻止新發(fā)整合事件的發(fā)生，長遠(yuǎn)看將降低患者的HCC發(fā)生風(fēng)險(圖1)。此外，Kim等[32]通過建立Markov模型闡明，對于CHB患者，在免疫耐受期開始接受抗病毒治療更具有成本效益，且在藥品成本降低等因素的影響下，免疫耐受期抗病毒治療的成本效益將進(jìn)一步提高。因此，建議對免疫耐受期的慢性HBV感染者盡早開展抗病毒治療，以減少整合和克隆性擴增的發(fā)生,并降低HCC發(fā)生風(fēng)險。

注：HBV感染細(xì)胞后，HBV DNA可整合到宿主DNA上，若攜帶整合HBV DNA的肝細(xì)胞增殖速度遠(yuǎn)超正常肝細(xì)胞的自我更新速度，克隆性擴增細(xì)胞出現(xiàn)選擇性優(yōu)勢。若增殖速度并不明顯大于正常肝細(xì)胞的自我更新速度，則不會出現(xiàn)選擇優(yōu)勢，難以形成大的克隆增生。NUC抑制HBV復(fù)制，新合成的rcDNA及dslDNA顯著減少，間接減少了整合發(fā)生；PEG-IFNα則主要通過激活HBV特異性CD8+ T淋巴細(xì)胞的殺傷反應(yīng)抑制有選擇性優(yōu)勢的整合細(xì)胞，促進(jìn)對克隆擴增的免疫清除。NUC及PEG-IFNα聯(lián)用時，在阻止新整合事件的發(fā)生的同時，使已有克隆在數(shù)量和大小有所減少，HCC發(fā)生風(fēng)險進(jìn)一步下降。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：魯鳳民、周召、阿卜杜熱西提·阿卜來提、顧智強、常靖負(fù)責(zé)撰寫論文；魯鳳民、顧智強、劉新負(fù)責(zé)修改論文；魯鳳民負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章。