測(cè)值穩(wěn)定的抗人AMH單克隆抗體制備及應(yīng)用*

何進(jìn)軍，章成龍，葛超坤，鄒繼華，葉邦策

1.美康生物科技股份有限公司，浙江寧波 315104；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310014

抗繆勒氏管激素(AMH)是評(píng)估女性卵巢儲(chǔ)備及指導(dǎo)輔助生殖的主要標(biāo)志物[1]，其臨床應(yīng)用還包括卵巢早衰、絕經(jīng)年齡預(yù)測(cè)和多囊卵巢綜合征輔助診斷等[2-3]。AMH以二聚體表達(dá)，分泌前被酶切為N端與“成熟區(qū)”C端，N端與C端以非共價(jià)鍵結(jié)合[4]。研究表明血清中酶切與未酶切的AMH共存[5]。

1993年REY等[6]用自配的酶聯(lián)免疫試劑檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，-20 ℃保存樣本AMH測(cè)值升高。2012年，RUSTAMOV等[7]用貝克曼AMH Gen Ⅱ試劑檢測(cè)并報(bào)告，樣本在室溫存放7 d及-20 ℃存放5 d測(cè)值分別上升58%、23%，且稀釋樣本測(cè)值與稀釋倍數(shù)不成比例。回顧性研究進(jìn)一步證實(shí)，AMH測(cè)值上升幅度與樣本保存溫度、時(shí)間、保存方式(血清或全血)有關(guān)[8-9]。測(cè)值穩(wěn)定性是診斷試劑的重要指標(biāo)，且臨床上常有樣本運(yùn)輸和檢測(cè)不及時(shí)的情況，上述結(jié)果對(duì)AMH的廣泛應(yīng)用造成了巨大困擾。有研究者推測(cè)樣本保存中AMH構(gòu)象改變致使其與抗體結(jié)合能力上升或出現(xiàn)新的結(jié)合位點(diǎn)[7，9]，貝克曼的科學(xué)家則認(rèn)為補(bǔ)體干擾AMH檢測(cè)，樣本保存后補(bǔ)體失活測(cè)值逐漸升高[10]。

筆者發(fā)現(xiàn)大量AMH單抗檢測(cè)室溫保存樣本測(cè)值升高，根據(jù)已有經(jīng)驗(yàn)，僅少數(shù)抗體的補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)容易暴露而易受干擾，因此推測(cè)AMH測(cè)值不穩(wěn)定非補(bǔ)體干擾而是分子構(gòu)象改變所致，制備結(jié)合能力不受構(gòu)象變化影響的單抗或可解決該問(wèn)題。本文通過(guò)制備結(jié)合AMH不同位點(diǎn)的單抗以驗(yàn)證該推測(cè)，并建立了滿足臨床要求的AMH化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 抗體測(cè)值穩(wěn)定性檢測(cè)的400份樣本取自3天內(nèi)在寧波美康盛德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所體檢的400例12～50歲健康女性，混合分裝并-80 ℃凍存。測(cè)值相關(guān)性檢測(cè)的60份梯度樣本搜集于2021年9—10月。BALB/c小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。研究過(guò)程遵循美康盛德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所倫理委員會(huì)相關(guān)原則，研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 自配化學(xué)發(fā)光試劑，采用美康CL3080免疫分析儀檢測(cè)AMH，對(duì)照試劑盒Elecsys AMH(電化學(xué)發(fā)光法)及配套質(zhì)控品購(gòu)自羅氏公司，使用Roche Cobas e602全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)。用于試劑特異性檢測(cè)的激活素A、抑制素A、促卵泡生成激素(FSH)、促黃體生成激素(LH)均購(gòu)自R&D Systems公司。

1.3方法

1.3.1人AMH抗原和單抗制備 AMH基因由金唯智生物科技有限公司合成，C末端添加8×His標(biāo)簽，分別用 5′-NheⅠ、3′-EcoRⅠ酶切并插入pcDNA3.3質(zhì)粒。電轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后用HisTrap FF柱及分子篩HiPrep Sepha S-300HR純化抗原。以AMH抗原(100 μg/只)免疫小鼠，3周后加強(qiáng)免疫3次(50 μg/只)，間隔2周。取小鼠脾細(xì)胞與SP 2/0細(xì)胞進(jìn)行PEG 3000介導(dǎo)的細(xì)胞融合，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)和篩選單克隆。

1.3.2AMH多肽合成 每條多肽長(zhǎng)30個(gè)氨基酸，相鄰有5個(gè)氨基酸重疊，編號(hào)1～21，由吉爾生化(上海)有限公司合成。其中編號(hào)1～17位于AMH N端，編號(hào)18～21位于AMH C端，多肽17長(zhǎng)26個(gè)氨基酸且與18不重疊，多肽21長(zhǎng)39個(gè)氨基酸(見(jiàn)圖1C)。多肽耦聯(lián)BSA并用于抗體識(shí)別位點(diǎn)測(cè)定。

1.3.3發(fā)光試劑配置 發(fā)光試劑：取0.1 mg單抗，以分子數(shù)1∶15標(biāo)記吖啶酯，室溫反應(yīng)2 h，PB緩沖液透析3次，用PBS(1% BSA)稀釋至1 μg/mL備用。固相試劑：取0.1 mg單抗，以分子數(shù)1∶15標(biāo)記生物素，室溫反應(yīng)2 h，PB緩沖液透析3次，用PBS(1% BSA)稀釋至0.5 mg/mL備用。取0.5 mL磁珠，PB清洗3次，稀釋至5 mg/mL，加入等體積生物素標(biāo)記抗體，室溫反應(yīng)2 h，PBS (1% BSA) 清洗3次并稀釋至0.1 mg/mL備用。

1.3.4抗體配對(duì)及測(cè)值穩(wěn)定性測(cè)試 抗體對(duì)同時(shí)檢測(cè)空白對(duì)照(PBS，1% BSA)及陽(yáng)性樣本并計(jì)算比值(信噪比)，信噪比大于10倍為有效配對(duì)。測(cè)試條件：1步法，100 μL發(fā)光試劑、50 μL固相試劑、30 μL樣本，37 ℃孵育15 min，清洗，檢測(cè)并記錄光度值。樣本第1天測(cè)值記為D0并于室溫(約25 ℃)保存，72 h后再次測(cè)試標(biāo)記為D3。

1.3.5補(bǔ)體干擾檢測(cè) C1q從枸櫞酸鈉抗凝血漿中純化，操作按照丁囯英等的方法進(jìn)行[11]，濃度用美康公司補(bǔ)體C1q檢測(cè)試劑盒(免疫比濁法)測(cè)定。搜集AMH陰性樣本測(cè)定C1q水平，分別混合大于220 μg/mL(高)，大于170 μg/mL且小于220 μg/mL(中)及小于170 μg/mL(低)的樣本，各取一半混合樣本53 ℃、10 min滅活補(bǔ)體。滅活及未滅活樣本中均添加10 ng/mL AMH抗原，測(cè)試完成后滅活樣本添加終濃度300 μg/mL的C1q再次測(cè)試對(duì)測(cè)值的影響?？贵wFc段用胃蛋白酶酶切，protein G純化酶切后抗體。

1.3.6發(fā)光試劑分析性能測(cè)試 用PBS(1% BSA)梯度稀釋AMH抗原，羅氏Elecsys AMH試劑盒檢測(cè)并賦值。用抗體對(duì)260/80配置發(fā)光試劑，選擇賦值濃度在0.1～20 ng/mL內(nèi)的5點(diǎn)作為定標(biāo)點(diǎn)，美康CL3080免疫分析儀定標(biāo)及檢測(cè)樣本。分別檢測(cè)最低檢測(cè)線、測(cè)值相關(guān)性及特異度。特異度檢測(cè)分別測(cè)試含激活素A(100 ng/mL)、抑制素A(100 ng/mL)、FSH(200 IU/L)、LH(200 IU/L)的樣本，測(cè)值不高于0.1 ng/mL為無(wú)明顯交叉。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 測(cè)值穩(wěn)定性每個(gè)測(cè)試重復(fù)3次計(jì)算均值及比值，比值計(jì)算：光亮值(X天)/光亮值(0天)×100%，≥10%為顯著上升，<10%為測(cè)值穩(wěn)定。分析性能測(cè)試每個(gè)檢測(cè)重復(fù)2次并計(jì)算均值，相關(guān)性用線性方程擬合。用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本測(cè)值穩(wěn)定性連續(xù)檢測(cè)及補(bǔ)體滅活、添加實(shí)驗(yàn)、AMH抗原添加實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并驗(yàn)證方差齊性，自配試劑與羅氏試劑測(cè)值偏差分析采用成對(duì)樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1AMH抗原及單抗制備 鎳柱純化AMH抗原結(jié)果如圖1A所示，重組表達(dá)AMH包含二聚體及多聚體，還原后均變成單體。分子篩進(jìn)一步純化可分別獲得多聚體及二聚體(圖1B)，二聚體組分用于免疫及克隆篩選。經(jīng)過(guò)4次融合，共獲得單克隆152株，抗體結(jié)合位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1C。共獲得21個(gè)多肽位點(diǎn)中15個(gè)位點(diǎn)的單克隆，6個(gè)位點(diǎn)(3、4、8、9、11、20)未獲得單克隆，3個(gè)位點(diǎn)(2、6、16)僅獲得1株單克隆。大部分單抗只結(jié)合1個(gè)位點(diǎn)，少數(shù)可結(jié)合2個(gè)以上的位點(diǎn)(按反應(yīng)較強(qiáng)的位點(diǎn)計(jì)算)。

注：A為鎳柱純化AMH電泳，lane 1表示分子marker，lane 2表示非還原，lane 3表示還原(DTT)；B為分子篩純化AMH電泳，lane 1表示分子marker，lane 2表示過(guò)柱前，lane 3表示組分1(多聚體)，lane 4表示組分2(二聚體)；C為單抗位點(diǎn)檢測(cè)，橫軸表示多肽編號(hào)及氨基酸位點(diǎn)。圖1 AMH抗原及單抗制備

2.2室溫保存樣本測(cè)值穩(wěn)定的抗體對(duì)篩選 首先，挑選抗原反應(yīng)較強(qiáng)的N端及C端抗體各20個(gè)，分別以C(捕獲)/N(檢測(cè))及N(捕獲)/C(檢測(cè))方式配對(duì)并檢測(cè)樣本測(cè)值穩(wěn)定性。結(jié)果C(捕獲)/N(檢測(cè))方式可配對(duì)，除了1對(duì)抗體260(19)/152(14)測(cè)值穩(wěn)定，其他配對(duì)測(cè)值均顯著上升。N(捕獲)/C(檢測(cè))方式未獲得有效配對(duì)。其次，以260(19)為包抗與所有N端抗體(檢抗)配對(duì)并檢測(cè)樣本測(cè)值穩(wěn)定性，結(jié)果如表1所示。14號(hào)位點(diǎn)(351～380氨基酸)的10個(gè)克隆測(cè)值均穩(wěn)定，17號(hào)位點(diǎn)(426～541氨基酸)5個(gè)克隆測(cè)值穩(wěn)定，5個(gè)克隆顯著上升。以152(14)為檢抗與所有C端抗體(包抗)配對(duì)并檢測(cè)樣本測(cè)值穩(wěn)定性，結(jié)果19號(hào)位點(diǎn)(477～501氨基酸)2個(gè)克隆測(cè)值穩(wěn)定，其余13個(gè)克隆均顯著升高。N端其他位點(diǎn)克隆作檢抗及C端其他位點(diǎn)克隆作包抗測(cè)值均顯著升高，部分結(jié)果如表2所示?？寺?0(1)、133(12)同時(shí)作包抗及檢抗分別與260(19)及152(14)配對(duì)(表2)，兩個(gè)克隆作包抗或檢抗測(cè)值均顯著上升。最后，用4對(duì)測(cè)值穩(wěn)定且信噪比較高的抗體對(duì)260/361、260/45、260/80、260/152及測(cè)值顯著上升的抗體對(duì)260/56、260/33(對(duì)照)，分別在樣本保存第1、3、5、7天檢測(cè)測(cè)值穩(wěn)定性。結(jié)果如圖2所示，7 d后(D7)4對(duì)抗體測(cè)值均穩(wěn)定，對(duì)照抗體分別上升至155.5%及181.2%,與D0測(cè)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：Dx測(cè)值與D0比值(3次檢測(cè)平均值，x=1、3、5、7)，260-80、260-33測(cè)值比值標(biāo)于柱狀圖頂端；橫軸為樣本室溫保存時(shí)間。與D0測(cè)值比較，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；#為對(duì)照抗體對(duì)。圖2 抗體對(duì)測(cè)值穩(wěn)定性驗(yàn)證Dx/D0(%)

表1 測(cè)值穩(wěn)定的單抗篩選

表2 不同位點(diǎn)單抗的測(cè)值穩(wěn)定性

2.3保存樣本測(cè)值升高由AMH構(gòu)象改變而非補(bǔ)體干擾導(dǎo)致 由于補(bǔ)體干擾起始于C1q與抗體結(jié)合并激活補(bǔ)體系統(tǒng)，滅活A(yù)MH陰性樣本補(bǔ)體(圖3A)并向滅活前后樣本中添加AMH抗原，用測(cè)值上升的抗體對(duì)260/295、260/60檢測(cè)補(bǔ)體滅活對(duì)測(cè)值的影響。結(jié)果如圖3B所示，滅活后260/295測(cè)值無(wú)明顯改變，260/60測(cè)值下降且中、高補(bǔ)體樣本下降超過(guò)20.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。滅活樣本中添加C1q再次檢測(cè)，260/295測(cè)值沒(méi)有明顯改變，260/60測(cè)值上升至200.00%以上，與添加前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明260/60易受補(bǔ)體干擾導(dǎo)致測(cè)值升高，可預(yù)見(jiàn)樣本保存后補(bǔ)體失活其測(cè)值將下降，而260/295測(cè)值基本不受補(bǔ)體干擾，因此兩對(duì)抗體檢測(cè)室溫保存樣本測(cè)值升高均與補(bǔ)體干擾無(wú)關(guān)。

注：A為混合樣本補(bǔ)體滅活，表示為2次檢測(cè)均值，統(tǒng)計(jì)分析與滅活前比較；B為補(bǔ)體滅活及添加C1q對(duì)測(cè)值的影響滅活(-)表示未添加C1q，統(tǒng)計(jì)分析與未滅活比較；滅活(C1q)表示添加C1q，統(tǒng)計(jì)分析與滅活(-)比較；C為酶切抗體電泳,lane 1表示相對(duì)分子質(zhì)量marker；lane 2、4、6表示抗體295、49、60；lane 3、5、7表示酶切295、49、60；D為抗體酶切對(duì)測(cè)值穩(wěn)定性的影響(均值用“-”顯示)；E為AMH抗原對(duì)樣本測(cè)值上升的影響，血清表示陽(yáng)性樣本；AMH表示重組AMH抗原；血清(AMH)表示陽(yáng)性樣本添加AMH抗原。D3/D0表示第3天測(cè)值與第0天比值；B、D、E均為3次檢測(cè)均值;*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。圖3 樣本AMH測(cè)值升高原因

由于C1q結(jié)合位點(diǎn)在抗體Fc區(qū)，切除3對(duì)抗體260/295、260/49、260/60的檢抗Fc區(qū)(由2.2的結(jié)果可知3對(duì)抗體測(cè)值上升均由檢抗所致，見(jiàn)圖3C)并用未酶切及酶切的抗體檢測(cè)20份樣本的測(cè)值穩(wěn)定性。結(jié)果如圖3D所示，未酶切及酶切的295測(cè)值平均分別上升至209.70%、181.90%，抗體49及60測(cè)值分別上升至132.50%、132.80%及128.40%、129.30%，說(shuō)明抗體測(cè)值上升不受Fc區(qū)影響，進(jìn)一步證明保存樣本AMH測(cè)值上升非補(bǔ)體干擾導(dǎo)致。

另一方面，抗體對(duì)260/295檢測(cè)室溫存放AMH抗原測(cè)值并不上升(99.43%)，添加同樣濃度的抗原至陽(yáng)性樣本并檢測(cè)測(cè)值穩(wěn)定性，未添加及添加抗原的樣本光度值分別上升267 022及210 788(圖3E)，偏差無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.104)。說(shuō)明僅樣本中天然AMH分子在測(cè)值上升中起作用，重組AMH不能引起測(cè)值上升，且證明AMH測(cè)值升高并非樣本中干擾物如補(bǔ)體引起，雖然兩種來(lái)源的蛋白序列一樣但構(gòu)象并不相同，樣本測(cè)值升高與AMH分子構(gòu)象改變有關(guān)。

2.4抗體對(duì)260/80在人AMH化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑中的應(yīng)用 選擇測(cè)值穩(wěn)定且信噪比較高的抗體對(duì)260/80進(jìn)行化學(xué)發(fā)光試劑配置及分析性能測(cè)試。以空白檢測(cè)限LoB評(píng)估，自配發(fā)光試劑的檢測(cè)靈敏度達(dá)0.08 ng/mL(表3)。自配試劑與羅氏電化學(xué)發(fā)光試劑同時(shí)檢測(cè)60份(0～30 ng/mL)樣本，兩種試劑測(cè)值有良好的相關(guān)性(圖4)，R2= 0.997 9，且測(cè)值偏差無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.264)。用TGF-β家族的激活素A、抑制素A及性激素FSH、LH檢測(cè)試劑特異度，自配試劑對(duì)4種干擾物均無(wú)明顯交叉反應(yīng)(表4)?？贵w對(duì)260/80配置的化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)靈敏度、相關(guān)性、特異度均達(dá)到臨床要求。

表3 自配試劑檢測(cè)靈敏度

圖4 自配試劑與羅氏試劑測(cè)值相關(guān)性

表4 自配試劑檢測(cè)特異性(ng/mL)

3 討 論

AMH主要用于女性卵巢儲(chǔ)備及輔助生殖的診斷評(píng)估，具有廣闊的應(yīng)用前景。AMH Gen Ⅱ試劑一度作為該指標(biāo)的參考標(biāo)準(zhǔn)。2012年RUSTAMOV等[7]發(fā)現(xiàn)，AMH Gen Ⅱ試劑測(cè)值不穩(wěn)定的問(wèn)題，推測(cè)樣本保存中非共價(jià)結(jié)合的N、C端逐漸解離并暴露新的抗體結(jié)合位點(diǎn)。2013年貝克曼在AMH Gen Ⅱ試劑中增加樣本稀釋步驟，認(rèn)為補(bǔ)體干擾導(dǎo)致測(cè)值不穩(wěn)定，而樣本稀釋可以加速補(bǔ)體失活。隨后的研究證明，稀釋樣本致使AMH測(cè)值升高但明顯改善存放樣本的測(cè)值穩(wěn)定性[12-13]。自動(dòng)化AMH檢測(cè)已進(jìn)入臨床應(yīng)用，貝克曼Access AMH通過(guò)整合樣本稀釋步驟，羅氏Elecsys AMH采用貝克曼的抗體，其解決測(cè)值穩(wěn)定性問(wèn)題的方法尚不清楚[14]。雖然樣本檢測(cè)及時(shí)性及測(cè)值穩(wěn)定性都得到了較大改善，但從上游抗體原料解決AMH測(cè)值穩(wěn)定性問(wèn)題對(duì)簡(jiǎn)化檢測(cè)流程及AMH檢測(cè)的廣泛應(yīng)用都具有重要意義。

本文的結(jié)果表明，包抗和檢抗均可導(dǎo)致樣本測(cè)值升高，切除引起測(cè)值上升抗體的Fc段后抗體對(duì)測(cè)值同樣升高，補(bǔ)體滅活及C1q添加試驗(yàn)表明AMH測(cè)值升高與補(bǔ)體無(wú)關(guān)。AMH抗原測(cè)值并不升高與AMH Gen Ⅱ混合質(zhì)控測(cè)值穩(wěn)定的結(jié)果一致，添加至陽(yáng)性樣本也沒(méi)有導(dǎo)致測(cè)值上升幅度增加[10]。這些結(jié)果均表明AMH測(cè)值不穩(wěn)定與其構(gòu)象變化有關(guān)而非補(bǔ)體干擾引起。補(bǔ)體與抗體結(jié)合如果干擾抗原抗體結(jié)合將引起測(cè)值假性降低，如果把包抗與檢抗直接連在一起將導(dǎo)致測(cè)值假性升高，AMH Gen Ⅱ試劑可能屬于前者，但也可能稀釋樣本時(shí)AMH構(gòu)象已經(jīng)改變。樣本AMH構(gòu)象改變的機(jī)制需進(jìn)一步研究，將有利于AMH功能調(diào)控的闡明。

本研究獲得了人AMH蛋白15個(gè)位點(diǎn)的單抗，其中14號(hào)位點(diǎn)全部克隆及17、19號(hào)位點(diǎn)部分克隆用于檢測(cè)室溫存放樣本測(cè)值穩(wěn)定，說(shuō)明這3個(gè)位點(diǎn)全部或部分結(jié)構(gòu)不易受AMH構(gòu)象改變影響。有研究中并未測(cè)試所有可能的配對(duì)，也許沒(méi)有篩選出所有測(cè)值穩(wěn)定的配對(duì)；且有6個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有獲得抗體，部分位點(diǎn)單抗較少，不排除這些位點(diǎn)的抗體也可用于AMH檢測(cè)且不受樣本保存影響。但本文的結(jié)果證明通過(guò)篩選特定位點(diǎn)單抗以解決AMH測(cè)值穩(wěn)定性問(wèn)題的方法是可行的。本研究采用抗體對(duì)260/80制備的化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)靈敏度、相關(guān)性、特異度均滿足臨床要求，為AMH廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。