杜仲葉免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及驗(yàn)證

崔恩慧，薛玉環(huán)，李辭霞，王 帥，朱曉巖，柴學(xué)軍，趙善廷*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100； 2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，西安 710021)

以往在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，抗生素被廣泛添加于動(dòng)物飼料中，一方面防治疫病，另一方面作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑以提高飼料轉(zhuǎn)化效率和家畜生長(zhǎng)性能，然而動(dòng)物產(chǎn)品中的抗生素殘留對(duì)人類健康構(gòu)成了潛在威脅。加之目前國(guó)家飼料禁抗政策的實(shí)施，有必要開(kāi)發(fā)既安全又高效的新型飼料添加劑替代品，取代抗生素來(lái)改善家畜健康和產(chǎn)品質(zhì)量。

中藥被公認(rèn)為是提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和免疫力的良好飼料添加劑。杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是中國(guó)傳統(tǒng)中藥，資源豐富，應(yīng)用廣泛，其樹(shù)皮、樹(shù)葉、種子和花均可作為生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的原料[1]，是我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)使用的飼料添加劑之一。近年來(lái)大量研究表明，杜仲葉也富含多種天然活性成分，如苯丙烷類、多糖、黃酮、環(huán)烯醚萜和木脂素[2-3]，其化學(xué)成分與杜仲皮相似[4-6]，二者藥用功能基本一致，均具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，可用于治療肝腎不足、腰膝酸痛等[7-9]，在降血脂、降糖、抗菌消炎等方面杜仲葉或可代替杜仲皮使用[10]。同時(shí)，杜仲葉因其產(chǎn)量豐富、易得、易收集、生長(zhǎng)周期快等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。自2005年起，杜仲葉已正式載入《中國(guó)藥典》，2018年被中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生委員會(huì)列為藥食同源物質(zhì)試點(diǎn)名單，突出了其在食品和制藥行業(yè)的開(kāi)發(fā)潛力。一直以來(lái)，杜仲綜合利用率很低，僅杜仲皮化學(xué)成分和藥理研究較為廣泛。因此，基于杜仲葉的優(yōu)勢(shì)，它在藥理研究和飼料添加劑方面具有廣闊的應(yīng)用前景。雖然杜仲葉作為飼料添加劑的研究已經(jīng)屢見(jiàn)不鮮，但是杜仲葉免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和試驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的研究策略，探究杜仲葉的生物活性成分及其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制，為其在飼料添加劑生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/), 人類孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM(https://www. omim.org/), GeneCards綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/), Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.swi sstargetprediction.ch/), String11.5(https://cn.string-db.org/), Cytoscape軟件(3.8.2)。

1.2 藥物活性成分的篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并結(jié)合文獻(xiàn)收集，以口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)為限定條件篩選杜仲葉有效化學(xué)成分，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性化合物的已知靶點(diǎn)，剔除沒(méi)有靶基因的活性成分，然后通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲得基因名。

1.3 疾病靶點(diǎn)篩選

在GeneCards和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索框中輸入“immune dysregulation”，收集與免疫失調(diào)相關(guān)的靶點(diǎn)基因，將挖掘得到的免疫失調(diào)相關(guān)基因與杜仲葉靶點(diǎn)基因篩選出交集基因并以維恩圖形式表示，得到杜仲葉免疫調(diào)節(jié)的作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)String平臺(tái)構(gòu)建上述交集基因的PPI，將蛋白種類設(shè)置為“Homosapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為“medium”(0.400)，其它保持默認(rèn)數(shù)值。將Tsv文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，利用插件CytoNCA進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的打分，篩選打分較高的節(jié)點(diǎn)再次構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，從而得出杜仲葉免疫調(diào)節(jié)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。使用R (3.6.3版本)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG富集分析。

1.5 細(xì)胞體外試驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1 主要儀器與試劑 細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-18AIC)，低溫離心機(jī)(Sigma，1-14K)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo，Varioskan LUX)，DMEM(Gibco，10313021)，胎牛血清(Gibco，10091148)，青鏈霉素混合液(Solarbio，P1400)，二甲基亞砜(DMSO)、中性紅分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；環(huán)磷酰胺(Solarbio, SC5540)，杜仲葉提取物(陜西瑞林帕尼爾生物科技有限公司提供)。

1.5.2 腹腔巨噬細(xì)胞的制備 小鼠處死后，腹腔注射10 mL PBS收集巨噬細(xì)胞，加入高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%熱滅活胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素)適量，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)·mL-1的單細(xì)胞懸液后加入96孔板，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.3 巨噬細(xì)胞的增殖能力 將巨噬細(xì)胞(2×106細(xì)胞·mL-1) 加入96孔板，100 μL·孔-1，試驗(yàn)分組為空白對(duì)照組(巨噬細(xì)胞+培養(yǎng)液)、各濃度藥物組(1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 μg·mL-1杜仲葉提取物+巨噬細(xì)胞)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 h，然后每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后再加入100 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定各孔吸光度。

1.5.4 巨噬細(xì)胞的吞噬能力 每孔加入各濃度(1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 μg·mL-1)杜仲葉提取物100 μL，每個(gè)藥物濃度重復(fù)5孔，另設(shè) LPS 對(duì)照組(LPS+巨噬細(xì)胞+培養(yǎng)基)和空白對(duì)照組(巨噬細(xì)胞+培養(yǎng)液)。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，0.09%中性紅染色4 h，然后用PBS溶液洗滌3次，去除多余的中性紅，每孔加入100 μL DMSO 靜置過(guò)夜，在酶標(biāo)儀570 nm處讀取吸光度。

1.6 體內(nèi)試驗(yàn)

1.6.1 試驗(yàn)材料 杜仲葉水提物：由陜西瑞林帕尼爾生物科技有限公司生產(chǎn)提供，生產(chǎn)批號(hào)RP20210723；環(huán)磷酰胺：購(gòu)自北京索萊寶。

SPF級(jí)雄性ICR小鼠60只，6～8周齡，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(陜)2018-001]。小鼠飼養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，溫度控制在(23±1)℃，相對(duì)濕度為50%～60%，試驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。

1.6.2 動(dòng)物分組 小鼠自由進(jìn)食和飲水適應(yīng)一周后，用苦味酸標(biāo)記，隨機(jī)分為：正常組、模型組、杜仲葉治療組，每組8只。模型組和杜仲葉治療組連續(xù)7 d腹腔注射70 mg·kg-1環(huán)磷酰胺，建立免疫抑制模型，正常組注射生理鹽水。然后分別灌胃21 d不同物質(zhì)：正常組和模型組灌胃生理鹽水，杜仲葉治療組灌胃1.6 g·kg-1杜仲葉提取物。

1.6.3 測(cè)量胸腺和脾臟指數(shù) 小鼠處死后，將免疫器官胸腺和脾通過(guò)手術(shù)分離并稱重，用生理鹽水溫和漂洗干凈，再用濾紙吸取表面水分后稱重，并以小鼠處死前體重為基準(zhǔn)計(jì)算相應(yīng)的脾臟和胸腺指數(shù)。免疫器官指數(shù)以免疫器官重量(mg)/體重(g)表示。

1.6.4 外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的檢測(cè) 小鼠眼球采血，注入無(wú)菌的EDTA抗凝管中，采用邁瑞獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。每組檢測(cè)8個(gè)重復(fù)樣本。

1.6.5 杜仲葉提取物對(duì)小鼠碳廓清能力的影響 小鼠經(jīng)尾靜脈注射稀釋4倍的印度墨水100 μL。在2 min (tA)和10 min (tB)時(shí)間點(diǎn)，取眶后靜脈血樣，20 μL樣品與2 mL 0.1% Na2CO3混合。測(cè)量每個(gè)樣品在600 nm處的吸光度(tA為ODA, tB為ODB)。吞噬指數(shù)(α)計(jì)算如下:

廓清指數(shù)K=(lgODA-lgODB)/(tA-tB)

吞噬指數(shù)α=K(1/3)×WB/(WL+WS)

其中WB、WS、WL分別為體重、肝重、脾重。

1.6.6 杜仲葉提取物對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的影響 DTH是評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能的一種方法。第1天腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)后，小鼠腹部剃毛3 cm×3 cm，涂抹5%DNCB的丙酮-麻油溶液20 μL·只-1致敏。5 d后將5%二硝基氟苯10 μL均勻涂于小鼠右耳兩側(cè)進(jìn)行第二次致敏。24 h后處死小鼠，取下8 mm耳片稱重，通過(guò)左右耳重量的變化來(lái)評(píng)價(jià)DTH的程度。

2 結(jié) 果

2.1 杜仲葉活性成分和靶基因的篩選

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為篩選條件，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn)，補(bǔ)充不符合篩選條件，但為藥物主要功效成分的化合物綠原酸，作為最終活性化合物，包括山奈酚、兒茶素、槲皮素、綠原酸，排除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分兒茶素(MOL000492)，共得到3種潛在活性成分。同時(shí)通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出306個(gè)靶點(diǎn)基因，見(jiàn)圖1和表1。

圖1 杜仲葉化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Compound-target network of Eucommia ulmoides leaf

表1 杜仲葉的活性成分及參數(shù)Table 1 Active ingredients and parameters of Eucommia ulmoides leaf

2.2 杜仲葉和免疫調(diào)節(jié)交集基因的篩選

利用GeneCards和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)1 107個(gè)，建立了疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過(guò)R軟件取杜仲葉靶點(diǎn)和免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)交集，共得到105個(gè)既與杜仲葉潛在活性化合物相關(guān)又與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，見(jiàn)圖2。

圖2 藥物與疾病的交集基因Fig.2 Intersection of drug genes and disease targets

2.3 杜仲葉和免疫調(diào)節(jié)核心蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將105個(gè)交集基因經(jīng)STRING進(jìn)行分析，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲞M(jìn)一步篩選核心靶點(diǎn)，篩選條件為連接度(Degree)、介度(Betweenness)、緊密度(Closeness)，最終獲得21個(gè)核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4。

圖3 杜仲葉-免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of targets related to the treatment of immune dysregulation with ELE

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊诵陌悬c(diǎn)Fig.4 Key target of PPI network topology analysis

2.4 杜仲葉和免疫調(diào)節(jié)GO功能富集分析和KEGG富集分析

對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，確定GO條目共2 342 個(gè)，包括2 218條生物學(xué)過(guò)程(biological process, BP)，主要涉及脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌源性分子反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)控、神經(jīng)炎癥反應(yīng)等；13條細(xì)胞成分(cell component，CC)，與RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子、膜筏、膜微區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、血小板α顆粒腔等相關(guān)；111條分子功能(molecular function，MF)，包括細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等，見(jiàn)圖5。KEGG富集到135條通路，主要涉及IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、耶爾森菌感染、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、MAPK信號(hào)通路等，見(jiàn)圖6。

圖5 交集靶點(diǎn)GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of key targets

圖6 核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of key targets

2.5 腹腔巨噬細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證

2.5.1 杜仲葉提取物對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響 按照不同濃度杜仲葉提取物處理巨噬細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，10 000 μg·mL-1濃度的OD值顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明此濃度抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞有毒性；6 000～9 000 μg·mL-1濃度處理的巨噬細(xì)胞與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明這幾個(gè)藥物濃度對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響；2 000～5 000 μg·mL-1濃度處理的巨噬細(xì)胞與空白對(duì)照組相比OD值顯著性升高(P<0.01)，說(shuō)明這幾個(gè)濃度均能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，且隨著濃度增加細(xì)胞增殖越明顯，具有一定劑量依賴性(圖7)。

與空白對(duì)照組比較，**P<0.01, *P<0.05Compared with the blank control group, **P<0.01, *P<0.05圖7 杜仲葉對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖的影響Fig.7 The influence of Eucommia ulmoides leaf in macrophage proliferation of mice

2.5.2 杜仲葉提取物對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 LPS組OD值大于空白對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)，說(shuō)明LPS能促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬作用。3 000、4 000、5 000 μg·mL-1濃度的杜仲葉與LPS相比差異極顯著(P<0.01)，2 000 μg·mL-1濃度的杜仲葉與LPS相比差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明這4個(gè)濃度促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力大于LPS，1 000 μg·mL-1濃度的杜仲葉與LPS相比差異不顯著(P>0.05)，但是1 000～5 000 μg·mL-1濃度的杜仲葉與空白對(duì)照組相比差異都是極顯著(P<0.01)，說(shuō)明這5個(gè)濃度均能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力(圖8)。

與空白對(duì)照比較，##P<0.01;與LPS組比較*P<0.05,**P<0.01Compared with blank control group, ##P<0.01; Compared with LPS group, *P<0.05,**P<0.01圖8 杜仲葉對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Fig.8 The influence of Eucommia ulmoides leaf in macrophage phagocytosis of mice

2.6 體內(nèi)試驗(yàn)

2.6.1 小鼠體重的變化 腹腔注射環(huán)磷酰胺造模后小鼠精神不佳，食欲下降，毛色暗，說(shuō)明造模成功。各組小鼠體重變化見(jiàn)表2。在注射環(huán)磷酰胺之前，各組小鼠體重?zé)o差異(P>0.05)，第1～7天連續(xù)注射環(huán)磷酰胺7 d構(gòu)建免疫抑制模型，模型組和杜仲葉組體重顯著下降(P<0.05)。第8天治療組開(kāi)始灌胃杜仲葉提取物，試驗(yàn)結(jié)束后，模型組和杜仲葉治療組之間無(wú)顯著差異，但是有升高趨勢(shì)，說(shuō)明杜仲葉對(duì)小鼠體重有積極作用。

表2 小鼠體重變化Table 2 Change in mice body weight g

2.6.2 杜仲葉提取物對(duì)免疫器官的影響 如圖9所示，模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。同時(shí)，與模型組相比，杜仲葉治療組小鼠脾臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)，胸腺指數(shù)也有增加。這表明，杜仲葉可以一定程度上抵抗環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制。

NC. 正常對(duì)照組；MC. 模型組；ELE. 杜仲葉提取物組。與正常對(duì)照比較，#P<0.05， ##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。下同NC. Normal control group; MC. Model control group; ELE. Eucommia ulmoides leaf extract group. Compared with blank control group, #P<0.05, ##P<0.01; *Compared with MC group, *P<0.05, **P<0.01. The same as below圖9 小鼠免疫器官指數(shù)Fig.9 Immune organ indexes of mice

2.6.3 杜仲葉提取物對(duì)血常規(guī)的影響 如表3所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠外周血白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、和血紅蛋白(HGB)均顯著下降(P<0.05)。杜仲葉治療組小鼠血液中WBC含量顯著高于模型組(P<0.05)，RBC、HGB含量高于模型組但差異不顯著，說(shuō)明杜仲葉可促進(jìn)小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞的生成。

表3 對(duì)小鼠血液指標(biāo)的影響Table 3 Effects on blood routine index in mice

2.6.4 杜仲葉提取物對(duì)小鼠碳廓清能力的影響 單核細(xì)胞的吞噬作用可以通過(guò)碳廓清試驗(yàn)來(lái)評(píng)估見(jiàn)圖10。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠吞噬指數(shù)(α)顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，杜仲葉治療組能顯著提高小鼠的吞噬指數(shù)(α)(P<0.05)。結(jié)果表明，杜仲葉能提高免疫抑制小鼠的碳清除能力。

圖10 小鼠吞噬指數(shù)αFig.10 Phagocytic index α of mice

2.6.5 杜仲葉提取物對(duì)小鼠DTH超敏反應(yīng)的影響 耳廓腫脹表明DTH反應(yīng)的強(qiáng)度，這是由參與細(xì)胞免疫的T細(xì)胞介導(dǎo)的。如圖11所示，與正常組比較，模型組耳廓腫脹明顯減輕(P<0.01)，說(shuō)明DNFB誘導(dǎo)的DTH模型建立成功。與模型組比較，杜仲葉能有效增加小鼠耳廓腫脹(P<0.01)，說(shuō)明杜仲葉能增強(qiáng)環(huán)磷酰胺處理小鼠的DTH反應(yīng)。結(jié)果表明，杜仲葉的免疫調(diào)節(jié)活性可能與細(xì)胞免疫有關(guān)。

圖11 小鼠DTH耳腫脹度Fig.11 Ear swelling in DTH of mice

3 討 論

杜仲葉提取物和活性成分可以增強(qiáng)動(dòng)物的機(jī)體免疫力。杜仲葉乙醇提取物能顯著增強(qiáng)小鼠免疫力[11]，綠原酸是杜仲葉中主要有效成分之一，具有提高犬抗氧化能力和體液免疫的功能[12]。杜仲葉及其提取物如綠原酸、黃酮等對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、免疫、肉質(zhì)及抗氧化能力等方面也具有促進(jìn)作用[13-16]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了杜仲葉在免疫失調(diào)中起調(diào)節(jié)作用的活性成分、藥物靶點(diǎn)和關(guān)鍵途徑。結(jié)果顯示，杜仲葉免疫調(diào)節(jié)的主要化合物為山奈酚、槲皮素、綠原酸，這些有效成分主要作用于TNF、IL-6、VEGFA、IL-1β等關(guān)鍵靶點(diǎn)，然后通過(guò)IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

隨后，本研究對(duì)杜仲葉免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了體內(nèi)、體外試驗(yàn)驗(yàn)證。體外試驗(yàn)研究了杜仲葉水提物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖及對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物在1 000～5 000 μg·mL-1劑量范圍內(nèi)能夠促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖和細(xì)胞吞噬作用。

體內(nèi)試驗(yàn)通過(guò)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制模型研究了杜仲葉對(duì)免疫抑制的影響。環(huán)磷酰胺作為一種有效的免疫抑制劑，可影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)并誘導(dǎo)免疫功能失衡，表現(xiàn)為體重、免疫器官指標(biāo)和免疫球蛋白的下降[17-19]。本研究中，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬活性均顯著降低，WBC、RBC和HGB也明顯下降。以上結(jié)果表明，試驗(yàn)小鼠處于免疫抑制狀態(tài)，說(shuō)明免疫抑制小鼠模型是成功的。

體重是小鼠生長(zhǎng)狀況的指標(biāo)，可以反映環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠的免疫狀態(tài)[20-21]。本試驗(yàn)中，杜仲葉可以改善環(huán)磷酰胺引起的機(jī)體損傷并一定程度恢復(fù)小鼠體重。免疫系統(tǒng)由免疫分子、免疫細(xì)胞和免疫器官組成。胸腺和脾是免疫系統(tǒng)的重要器官，它們的器官指數(shù)可以反映免疫功能和預(yù)后。與模型組相比，杜仲葉治療組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)顯著增加，減輕了環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制。

WBC、RBC和HGB等臨床血液參數(shù)是監(jiān)測(cè)化療不良反應(yīng)的常規(guī)標(biāo)志物[22]。WBC由粒細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞組成。WBC計(jì)數(shù)是免疫激活和可能感染的生物標(biāo)志物[23]。RBC在支持組織代謝方面發(fā)揮重要作用。高效的紅細(xì)胞是維持組織氧合和酸堿平衡所必需的[24]。紅細(xì)胞能夠與內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和巨噬細(xì)胞相互作用，參與維持血栓形成和止血，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[25]。紅細(xì)胞中的HGB負(fù)責(zé)人體內(nèi)氧氣的運(yùn)輸。環(huán)磷酰胺可以影響骨髓的造血功能，導(dǎo)致外周血WBC、RBC、HGB等減少[26]。杜仲葉可以恢復(fù)外周血WBC、RBC和HGB的計(jì)數(shù)。說(shuō)明杜仲葉能促進(jìn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠造血功能恢復(fù)，這可能與促進(jìn)骨髓造血功能有關(guān)。

巨噬細(xì)胞可以通過(guò)先天免疫作用進(jìn)行吞噬[27]。杜仲葉治療組吞噬指數(shù)(α)增加表明，杜仲葉可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。DNFB誘導(dǎo)的DTH是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，其特點(diǎn)是非特異性炎癥細(xì)胞的高度聚集[28]。本研究中，杜仲葉提取物可以通過(guò)增加小鼠耳部腫脹來(lái)增強(qiáng) DTH。該結(jié)果表明杜仲葉可能在細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)杜仲葉免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制，并結(jié)合體外、體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證了杜仲葉的免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)其免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制做了初步探討，為杜仲葉作為飼料添加劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。