豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白與核糖體蛋白S20相互作用對(duì)病毒復(fù)制的影響

王君君，宋慧敏，李倬偉，姜 平，周雙海，李煥榮*，劉雪威 *

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100096； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210014)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一種單股正鏈RNA病毒，基因變異率高，嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展[1]。目前商品化豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫保護(hù)效力有限，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失[2-3]。近20多年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)該病毒致病和免疫機(jī)制做了廣泛研究，揭示了多種宿主拮抗蛋白分子，但PRRSV感染和致病機(jī)制尚不十分清楚，臨床上尚無有效治療藥物。N蛋白是PRRSV編碼的核衣殼蛋白，在病毒的致病和免疫機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但其與宿主蛋白的相互作用機(jī)制也不十分全面[4-5]。深入研究PRRSV N蛋白與宿主細(xì)胞蛋白相互作用機(jī)制，對(duì)揭示該病毒致病機(jī)制、預(yù)防和控制該病毒感染具有重要理論意義和應(yīng)用前景。

酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system，Y2H)是研究蛋白質(zhì)相互作用的一種重要技術(shù)手段[6-7]。本研究構(gòu)建PRRSV天然靶器官——豬肺酵母雙雜交cDNA文庫，繼而以PRRSV N蛋白為誘餌蛋白，利用 Y2H方法篩選豬肺酵母雙雜交cDNA文庫，研究核糖體蛋白 S20 (ribosomal protein S20， RPS20)與N 蛋白的相互作用，確定RPS20對(duì)PRRSV復(fù)制的影響，為N蛋白在PRRSV感染中的功能及宿主蛋白R(shí)PS20在PRRSV復(fù)制中發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒和肺組織 本試驗(yàn)選用MARC-145細(xì)胞(非洲綠猴腎上皮細(xì)胞)及高致病性PRRSV毒株BB0907(由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授饋贈(zèng))。仔豬肺組織和PAMs(豬肺泡巨噬細(xì)胞)采自4周齡健康仔豬，其PRRSV、PCV2、PRV和CSFV病毒核酸和抗體均為陰性。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；cDNA文庫構(gòu)建試劑盒Make Your Own “mate & plate” Library System kit、酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化試劑盒YeastmakerTMYeast Transformation System 2、LD-PCR試劑盒Advantage 2 Polymerase Mix、文庫質(zhì)粒插入片段檢測試劑Matchmaker Insert Check PCR Mix 2、酵母菌株Y2HGold和 Y187、酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7、pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7-p53(陽性對(duì)照質(zhì)粒，p53蛋白與T蛋白互作)和pGBKT7-Lam(陰性對(duì)照質(zhì)粒，Lam蛋白不與T蛋白互作)以及各種酵母培養(yǎng)基均購自Clontech公司。Flag單抗購自Abmart公司；HA單抗購自巴傲德公司；IRDye 800CW的山羊抗小鼠/兔IgG(H-L)購自LI-COR公司。

本試驗(yàn)所用的三對(duì)siRNA是根據(jù)NCBI中豬源RPS20基因序列(DQ629171.1)基因設(shè)計(jì)，由吉瑪基因公司合成，具體序列如表1。

表1 干擾RPS20序列Table 1 siRNA sequence

1.2 方法

1.2.1 豬肺酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建 采取4周齡健康仔豬(PRRSV、PCV2、PRV和CSFV核酸和抗體均為陰性)肺組織，提取總RNA，以SMART技術(shù)合成第一條cDNA鏈，通過LD-PCR技術(shù)擴(kuò)增成雙鏈DNA，并將純化后的雙鏈DNA和線性化的酵母表達(dá)載體pGADT7載體一起轉(zhuǎn)化入酵母Y187菌株，利用酵母細(xì)胞內(nèi)的同源重組酶活性，完成二者的連接重組。最終收集轉(zhuǎn)化外源基因的酵母菌。對(duì)文庫的插入片段和文庫庫容量進(jìn)行檢測。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù) GenBank中公布的豬源RPS20基因序列(DQ629171.1)和PRRSV BB0907 ORF7(HQ315835.1)的基因序列設(shè)計(jì)引物。利用 TRIzol抽提豬肺泡巨噬細(xì)胞和PRRSV接種細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后，利用 RT-PCR 方法分別擴(kuò)增RPS20基因和ORF7基因，并將其分別克隆至 pcDNA3.1(+)中。

將ORF7基因構(gòu)建入酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7中。獲得重組質(zhì)粒經(jīng)序列比對(duì)鑒定正確后命名為 pcDNA3.1-RPS20-HA、pcDNA3.1-N-Flag和pGBKT7-N。所有得到的重組質(zhì)粒均經(jīng)測序驗(yàn)證。所用引物見表2。

表2 重組質(zhì)粒引物Table 2 Primers for recombinant plasmid

1.2.3 文庫篩選 將pGBKT7-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母Y2HGold中，涂布于SD/-Trp瓊脂培養(yǎng)基平板上，挑取形態(tài)規(guī)則的單菌落接種至50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基，過夜，培養(yǎng)液離心去上清，將酵母沉淀用 SD/-Trp 液體培養(yǎng)基重懸，加入豬肺酵母雙雜交cDNA文庫進(jìn)行雜交，顯微鏡下觀察到三葉草形狀酵母菌(酵母菌雜交)時(shí)，將雜交產(chǎn)物涂布在QDO(SD/-His/-Trp/-Leu)培養(yǎng)基上，將QDO培養(yǎng)基上生長出的粉白色菌落，挑取于 QDO/X/A(SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)平板劃線培養(yǎng)，對(duì)生長狀態(tài)良好的藍(lán)色單菌落進(jìn)行提取質(zhì)粒并測序，經(jīng) NCBI 的 BLAST 數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析所得到的基因序列，以確定捕獲的宿主蛋白。

1.2.4 免疫共沉淀 將MARC-145細(xì)胞鋪于24孔板中，37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)80%，共轉(zhuǎn)染0. 5 μg pcDNA3.1(+)-RPS20-HA和0.5 μg pcDNA3.1(+)-N-Flag，24 h后收集蛋白樣品，加入1 μg鼠抗HA單克隆抗體，4 ℃搖床中孵育8 h。加入50 μL的Protein A+G瓊脂糖珠，4 ℃搖床中繼續(xù)緩慢搖動(dòng)孵育3 h。2 500 r·min-1離心5 min， PBST洗滌，重復(fù)該過程4次。加入5×Loading Buffer，沸水煮10 min，進(jìn)行Western blot。

為確定內(nèi)源PRRSV N蛋白與RPS20蛋白的互作。待生長在24孔細(xì)胞板中的MARC-145細(xì)胞的匯合度達(dá)到80%，轉(zhuǎn)染0.5 μg的RPS20-HA真核表達(dá)質(zhì)粒，12 h后接種0.1 MOI PRRSV，接毒24 h后用鼠抗HA單克隆抗體進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)。

1.2.5 激光共聚焦試驗(yàn) 將MARC-145細(xì)胞接種在細(xì)胞爬片上，待匯合度達(dá)到60%時(shí)，轉(zhuǎn)染1 μg pcDNA3.1(+)-N-Flag， 24 h后用4%多聚甲醛固定15 min；0.1% Triton X-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透膜30 min；加入特異性抗體鼠抗Flag(1∶1 000稀釋)和兔抗RPS20(1∶500)，孵育1 h；經(jīng)PBST 充分洗滌后加入對(duì)應(yīng)熒光二抗，37 ℃孵育45 min；棄二抗充分洗滌后，加入終濃度為 1 mmol·L-1DAPI/PBS 孵育10 min，用中性樹脂封片后至共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.6 過表達(dá)RPS20對(duì)PRRSV增殖影響的測定 將MARC-145細(xì)胞以每孔105個(gè)·500 mL-1鋪于24孔板中， 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至70%～80%時(shí)依據(jù)Lipofectamine?3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。37 ℃溫箱培養(yǎng) 36 h后可收取細(xì)胞及上清，分別通過病毒滴度測定、熒光定量PCR或Western blot進(jìn)行檢測。

1.2.7 siRNA轉(zhuǎn)染及篩選 參照Lipofectamine?2000說明書轉(zhuǎn)染48 pmol·L-1干擾片段至MARC-145細(xì)胞中，于24和36 h收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定RPS20的表達(dá)水平，篩選效果最好的沉默基因進(jìn)行Western blot，驗(yàn)證其對(duì)內(nèi)源性RPS20蛋白的干擾效果。

1.2.8 相對(duì)熒光定量PCR 每孔MARC-145細(xì)胞加入200 μL TRIzol收集細(xì)胞，按照總RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，依據(jù) HiScript II 1stStrand cDNA Synthesis進(jìn)行 RNA 反轉(zhuǎn)錄，以得到的 cDNA 為模板，依據(jù)qPCR SYBE Green Master Mix說明書配制反應(yīng)體系及設(shè)置反應(yīng)程序。設(shè)定陰性對(duì)照，獲得Ct值。目的基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)采用2-ΔΔCt法分析[8]。所有處理組均重復(fù)檢測 3 次。所用引物見表3。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 豬肺酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及篩選

為了篩選與PRRSV N蛋白互作的宿主蛋白，本試驗(yàn)通過采取4周齡健康仔豬(PRRSV、PCV2、PRV和CSFV核酸和抗體均為陰性)肺組織構(gòu)建cDNA文庫。將所構(gòu)建文庫稀釋涂布于SD/-Leu平板(圖1A)，經(jīng)兩次稀釋涂板計(jì)算得到文庫滴度為 5 × 106CFU·mL-1， cDNA文庫容量為7.5×107CFU，符合酵母雙雜交篩選要求。進(jìn)一步挑取15個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示：擴(kuò)增產(chǎn)物長度大小主要集中在 300～2 000 bp(圖1B)，平均長度約為500 bp，且同源重組率達(dá)到87%。上述結(jié)果表明，cDNA文庫質(zhì)量合格，可用于后續(xù)酵母雙雜交試驗(yàn)。

A.酵母雙雜交文庫總?cè)萘繑?shù)的測定；B. 隨機(jī)挑選15個(gè)菌落PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果(1～15. 隨機(jī)挑取的15個(gè)菌落的PCR產(chǎn)物；M1. DS2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2. DL10000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))；C. 電子顯微鏡觀察下的三葉草結(jié)構(gòu)；D. 在 QDO和QDO/X/A平板上酵母雙雜交結(jié)果電子顯微鏡觀察結(jié)果A. Determination of the total volume number of yeast two-hybrid libraries；B. Agarose gel electrophoresis of PCR products from 15 colonies randomly selected(1-15. Normalized effect of 15 PCR products randomly selected； M1. DS2000 DNA marker；M2. DL10000 DNA marker)；C. The structure of a cloverleaf under electron microscopic observation；D. Results of yeast two-hybridization on QDO and QDO/X/A plates圖1 豬肺酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建及篩選Fig.1 Construction and screening of porcine lung yeast two hybrid cDNA library

以PRRSV N蛋白作為誘餌，與豬肺cDNA酵母文庫進(jìn)行雜交，在顯微鏡下觀察到三葉草型二倍體酵母菌，表明誘餌酵母Y2HGold與文庫酵母Y187發(fā)生了雜交融合(圖1C)。將Y2HGold [pGBKT7-p53]和 Y187[pGADT7-T]的混合菌液分別涂布于QDO(SD/-His/-Trp/-Leu)及QDO/X/A(SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)培養(yǎng)基，并將Y2HGold[pGBKT7-Lam]和 Y187[pGADT7-T]的混合菌株設(shè)為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組及陰性對(duì)照組在 QDO培養(yǎng)基上生長均呈現(xiàn)粉白色，試驗(yàn)組在 QDO/X/A培養(yǎng)基中生長呈現(xiàn)藍(lán)色而陰性對(duì)照組在 QDO/X/A培養(yǎng)基上無菌落生長，證明本雜交系統(tǒng)成立。將試驗(yàn)組在QDO平板上生長出的粉白色菌落進(jìn)一步接種于QDO/X/A平板上，生長出三個(gè)藍(lán)色菌落并將其擴(kuò)大培養(yǎng)，提取酵母質(zhì)粒進(jìn)行測序，其中兩個(gè)菌落內(nèi)質(zhì)粒包含片段與40S核糖體蛋白 S20(RPS20)的第87—357位氨基酸序列相似性達(dá)到100%(圖1D)。初步判定PRRSV N蛋白能夠與RPS20第87—357位氨基酸在酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生互作關(guān)系。

2.2 確定N蛋白與RPS20互作關(guān)系

為進(jìn)一步驗(yàn)證N蛋白與RPS20蛋白之間的相互作用，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RPS20-HA 和 pcDNA3.1-N-Flag，共轉(zhuǎn)染至MARC-145細(xì)胞，進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)。結(jié)果顯示N蛋白與RPS20蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在互作(圖2A)。同時(shí)將pcDNA3.1-RPS20-HA轉(zhuǎn)染至MARC-145細(xì)胞，感染0.1 MOI PRRSV， 24 h后收集蛋白樣品進(jìn)行免疫共沉淀，結(jié)果顯示RPS20蛋白可以與病毒感染后的細(xì)胞內(nèi)的N蛋白相互結(jié)合(圖2B)。

A. RPS20與PRRSV N蛋白互作的鑒定；B. RPS20與內(nèi)源性PRRSV N蛋白互作的鑒定；C. 激光共聚焦試驗(yàn)檢測過表達(dá)的 N和細(xì)胞內(nèi)源RPS20亞細(xì)胞定位A. Identification of the interaction between RPS20 and N；B. Identification of interaction between RPS20 and endogenous PRRSV N protein; C. Detection of the subcellular localization of exogenous RPS20 and N protein圖2 RPS20與PRRSV N蛋白互作的驗(yàn)證Fig.2 The interaction between RPS20 and PRRSV N protein was identified

采用激光共聚焦檢測 N蛋白與 RPS20 蛋白在 MARC-145細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位。在轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-N-Flag細(xì)胞中，N蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；RPS20 定位在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，N與內(nèi)源性 RPS20 共定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖2C)。

2.3 過表達(dá)RPS20對(duì)PRRSV在MARC-145中復(fù)制的影響

為驗(yàn)證RPS20蛋白對(duì)PRRSV復(fù)制的影響，首先將不同劑量pcDNA3.1-RPS20-HA轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞， 24 h后檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量≤1 μg時(shí)對(duì)MARC-145細(xì)胞并無細(xì)胞毒性(圖3A)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RPS20-HA和pcDNA3.1-HA空載后24 h感染PRRSV(0.1 MOI)，分別于感染后24和36 h收集細(xì)胞和上清，分別測定病毒滴度和ORF7 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RPS20-HA的細(xì)胞組病毒滴度低于空載組(圖3B)，ORF7 mRNA表達(dá)量低于空載組(圖3C)。進(jìn)而將0、0.5、1.0 μg pcDNA3.1-RPS20-HA 轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，24 h后感染0.1 MOI PRRSV，通過熒光定量PCR、Western blot、TCID50方法檢測RPS20蛋白對(duì)PRRSV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，隨著pcDNA3.1-RPS20-HA轉(zhuǎn)染量的增加，病毒滴度(圖3D)、PRRSV ORF7 mRNA表達(dá)量(圖3E)和N蛋白表達(dá)水平(圖3F)均顯著降低，表明過表達(dá)RPS20降低PRRSV在MARC-145中的復(fù)制水平，且呈劑量依賴性。

A. CCK-8法測定質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的毒力影響；B. TCID50法測定RPS20對(duì)PRRSV毒力的影響；C. qPCR法測定RPS20對(duì)PRRSV復(fù)制的影響；D. 不同劑量RPS20對(duì)PRRSV滴度的影響；E. qPCR法測定不同劑量RPS20對(duì)PRRSV復(fù)制的影響；F、G. Western blot法及蛋白灰度值統(tǒng)計(jì)測定不同劑量RPS20對(duì)PRRSV復(fù)制的影響。*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001；****.P<0.000 1A. The effect of RPS20 on cell viability was detected by CCK-8 method; B. The effect of RPS20 on PRRSV virulence was detected by TCID50 method; C. The effect of RPS20 on PRRSV replication was detected by qPCR method; D. The effect of different doses of RPS20 on PRRSV virulence; E. The effect of different doses of RPS20 on PRRSV replication was detected by qPCR method; F, G. The effect of different doses of RPS20 on PRRSV replication determined was detected by Western blot method and statistics of protein band gray value. *.P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ****. P<0.000 1圖3 過表達(dá)RPS20對(duì)PRRSV在MARC-145中復(fù)制的影響Fig.3 Effect of overexpression of RPS20 on replication of PRRSV in MARC-145

2.4 干擾RPS20對(duì)PRRSV在MARC-145中復(fù)制的影響

將48 pmol·L-1的siRPS20和無關(guān)對(duì)照NC轉(zhuǎn)染至MARC-145細(xì)胞中，分別在24和36 h收集細(xì)胞，通過qPCR測定細(xì)胞中的RPS20 mRNA表達(dá)量。圖4A結(jié)果顯示，siRNA-129在24和36 h均能降低RPS20 mRNA表達(dá)量。轉(zhuǎn)染siRPS20-129后36 h收集細(xì)胞蛋白，結(jié)果顯示siRNA-129可有效降低細(xì)胞內(nèi)RPS20蛋白表達(dá)量(圖4B、C)。

A. 通過熒光定量PCR篩選出有效的siRPS20；B、C. 使用siRNA-129后RPS20的蛋白質(zhì)表達(dá)及蛋白灰度值統(tǒng)計(jì)圖；D.通過qPCR檢測siRNA-129對(duì)PRRSV復(fù)制的影響；E.通過TCID50試驗(yàn)檢測siRNA-129對(duì)PRRSV的影響；F～H.通過Western blot及蛋白灰度值統(tǒng)計(jì)檢測siRNA-129對(duì)PRRSV復(fù)制的影響。*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001；****.P<0.000 1A. Screening of the effective siRPS20 by fluorescence quantitative PCR; B,C. Protein expression of RPS20 after using siRNA-129 and statistical diagram of protein band gray value; D. The effect of siRNA-129 on PRRSV replication was detected by qPCR; E. The effect of siRNA-129 on PRRSV was detected by TCID50assay; F-H. The effect of siRNA-129 on PRRSV replication was detected by Western blot and statistics of protein band gray value. *.P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ****. P<0.000 1圖4 干擾RPS20對(duì)PRRSV在MARC-145中復(fù)制的影響Fig.4 Effect of siRPS20 on PRRSV replication in MRAC-145

為了驗(yàn)證干擾RPS20蛋白對(duì)PRRSV復(fù)制的影響，將siRNA-129 轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA-NC為對(duì)照組； 24 h后感染0.1 MOI PRRSV，36 h后分別收取核酸及蛋白樣品。通過熒光定量PCR、病毒滴度測定和Western blot檢測病毒的復(fù)制水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-129可以顯著增多PRRSV感染細(xì)胞內(nèi)ORF7的mRNA拷貝數(shù)(圖4D)、病毒蛋白的表達(dá)量(圖4F～H)，并增高病毒的滴度(圖4E)。以上結(jié)果說明干擾細(xì)胞內(nèi)RPS20蛋白的表達(dá)，可以促進(jìn)PRRSV在MARC-145中的復(fù)制。

2.5 RPS20對(duì)PRRSV在PAMs中復(fù)制的影響

豬是PRRSV的天然宿主，PAMs是其天然靶細(xì)胞，通過對(duì)NCBI公布的豬源(NP_001123426.1)與猴源(XP_007998872.1)RPS20蛋白的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)， RPS20蛋白在豬與非洲綠猴的相似性高達(dá)99.16%。提示在PAMs內(nèi)RPS20可能對(duì)PRRSV復(fù)制發(fā)揮作用。首先探究PRRSV增殖是否影響PAMs內(nèi)RPS20蛋白的表達(dá)，試驗(yàn)采用0.01MOI、0.1MOI和1MOI PRRSV感染PAMs，24 h后收集細(xì)胞蛋白，通過Western blot方法及灰度值統(tǒng)計(jì)分析測定RPS20的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示PAMs中不同劑量PRRSV感染并不改變細(xì)胞內(nèi)RPS20的蛋白表達(dá)(圖5A～C)。

A.通過Western blot方法測定不同感染劑量PRRSV對(duì)PAMs內(nèi)RPS20蛋白表達(dá)的影響；B、C.圖A蛋白條帶灰度值統(tǒng)計(jì)圖；D.通過Western blot檢測siRNA-129對(duì)PRRSV復(fù)制的影響;E、F.圖D蛋白條帶灰度值統(tǒng)計(jì)圖。*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001；****.P<0.000 1A. The effect of different infection doses of PRRSV on the expression of RPS20 protein in PAMs was determined by Western blot; B,C. statistical diagram of protein band gray value in Figure A; D. The effect of siRNA-129 on PRRSV replication was detected by Western blot; E,F. statistical diagram of protein band gray value in Figure D. *.P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ****. P<0.000 1圖5 RPS20對(duì)PRRSV在PAMs中復(fù)制的影響Fig.5 Effect of RPS20 on PRRSV replication in PAMs

為了進(jìn)一步驗(yàn)證RPS20蛋白對(duì)PRRSV在PAMs中復(fù)制的影響，將siRNA-129 轉(zhuǎn)染PAMs，同時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA-NC為對(duì)照組； 24 h后感染0.1 MOI PRRSV，24 h后收取蛋白樣品。通過Western blot方法及灰度值統(tǒng)計(jì)分析測定PRRSV N蛋白和RPS20蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，干擾RPS20會(huì)增強(qiáng)PRRSV在PAMs的復(fù)制(圖5D～F)。以上結(jié)果說明干擾細(xì)胞內(nèi)RPS20蛋白的表達(dá)，可以促進(jìn)PRRSV在PAMs中的復(fù)制。

3 討 論

PRRSV在病毒的傳播和進(jìn)化過程中易發(fā)生變異，傳統(tǒng)的疫苗保護(hù)效果不佳，迫切需要新的研究思路來降低該病毒對(duì)養(yǎng)殖行業(yè)的影響[2, 9]。以宿主蛋白為靶向的抗病毒藥物能夠避免病毒耐藥性的發(fā)生，因此針對(duì)PRRSV復(fù)制的互作宿主蛋白的篩選至關(guān)重要。PRRSV核衣殼蛋白N的基本功能是形成病毒衣殼，并封裝病毒基因組，其在動(dòng)物體內(nèi)具有高度的免疫原性，是病毒感染后產(chǎn)生水平最高且最久的蛋白[10]。它與多種宿主細(xì)胞蛋白相互作用，如原纖維蛋白[11]、PARP-1[12]、S100A9[13]、TRIM25[14]和TSG101[15]，通過與以上細(xì)胞因子互作能夠調(diào)節(jié)PRRSV感染。繼續(xù)篩選與N蛋白互作的宿主蛋白，將為PRRSV的感染機(jī)制及宿主靶向的PRRSV藥物提供新的理論基礎(chǔ)。

Y2H是一種蛋白互作的研究方法，在建立宿主細(xì)胞或組織酵母 cDNA 文庫的基礎(chǔ)上，構(gòu)建表達(dá)目的蛋白誘餌質(zhì)粒，使其與文庫雜交，通過在選擇培養(yǎng)基上的不斷篩選，篩選出能夠與目的蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)互作的宿主蛋白[16]。PRRSV 感染后，首先入侵肺泡巨噬細(xì)胞，經(jīng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞后，激活炎癥因子的釋放，并在巨噬細(xì)胞內(nèi)迅速增殖繁衍，最終導(dǎo)致其破裂、溶解[17]。感染豬呈現(xiàn)出典型的間質(zhì)性肺炎，肺是豬最重要的靶器官[18]。因此選擇仔豬肺組織構(gòu)建酵母cDNA文庫更容易篩選到與病毒蛋白互作且與病毒致病性相關(guān)的宿主蛋白。本研究篩選PRRSV、PCV2、PRV和CSFV核酸和抗體均為陰性的4周齡健康仔豬，無菌采取其肺組織，使用 Make Your Own “Mate&PlateTM” Library System cDNA 文庫構(gòu)建系統(tǒng)，利用 SMART 技術(shù)和同源重組技術(shù)，構(gòu)建了豬肺酵母cDNA文庫，所構(gòu)建文庫插入片段和文庫庫容量均符合SMART建庫要求。

本試驗(yàn)通過Y2H系統(tǒng)篩選出在酵母細(xì)胞中與N蛋白相互作用的宿主蛋白——RPS20，并通過免疫共沉淀證明RPS20蛋白與PRRSV感染細(xì)胞內(nèi)的N蛋白存在互作。通過激光共聚焦證實(shí)N蛋白與內(nèi)源RPS20蛋白存在亞細(xì)胞共定位。RPS20在PRRSV復(fù)制過程中的作用尚未明確，故本試驗(yàn)采用熒光定量PCR、Western blot、TCID50等方法檢測干擾或過表達(dá)RPS20對(duì)ORF7 mRNA、N蛋白和病毒滴度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RPS20能夠降低PRRSV的復(fù)制水平，反之，干擾RPS20后病毒的復(fù)制水平提高，說明RPS20對(duì)PRRSV的復(fù)制過程存在一定的影響。

核糖體蛋白(ribosomal protein，RP)是核糖體的重要組成部分，對(duì)蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的分裂、增殖、分化和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用[19]。核糖體蛋白被病毒“策反”會(huì)導(dǎo)致功能異常，因此核糖體蛋白已經(jīng)成為許多疾病治療中的潛在宿主靶點(diǎn)[18]。RPS20 屬于核糖體蛋白S10P家族，是細(xì)胞核糖體蛋白的重要組成部分。研究表明RPS20與豬腦心肌炎病毒VP1蛋白存在互作[20]，與草魚呼腸孤病毒VP7蛋白相互作用[21]；RPS20可以減少早期的細(xì)胞凋亡，其在乙型流感病毒的復(fù)制過程中起到重要的作用[22]。另有研究者發(fā)現(xiàn)在缺乏干擾素應(yīng)答的細(xì)胞系中RPS20參與痘病毒的復(fù)制和特異性蛋白的合成[23]。在本研究中，RPS20不僅能夠與PRRSV N蛋白相互作用，還影響PRRSV的天然靶細(xì)胞內(nèi)的PRRSV的增殖?？梢奟PS20在PRRSV復(fù)制過程中起著重要作用。另外在激光共聚焦試驗(yàn)中，在轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-N-Flag的細(xì)胞中，N蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；RPS20 定位在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，N蛋白與內(nèi)源性 RPS20 共定位于細(xì)胞質(zhì)中，推測RPS20對(duì)PRRSV增殖的影響可能與其蛋白質(zhì)的合成有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。RPS20能夠參與細(xì)胞的增殖并與細(xì)胞凋亡有關(guān)[24]。而在PRRSV體外感染的PAM細(xì)胞中，前期PRRSV趨向于抗凋亡，后期趨向于促進(jìn)凋亡[25]。PRRSV感染仔豬的肺組織和胸腺中也能夠檢測到細(xì)胞凋亡[26]。因此，RPS20是否參與到PRRSV對(duì)豬體的凋亡調(diào)控，也有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究通過構(gòu)建豬肺酵母cDNA文庫，采用酵母雙雜交、免疫共沉淀、激光共聚焦、過表達(dá)試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)等手段，證實(shí)PRRSV N蛋白與宿主蛋白R(shí)PS20蛋白相互作用，且RPS20對(duì)PRRSV的復(fù)制存在明顯影響。提示RPS20可作為潛在宿主靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究，為PRRSV抗病毒研究提供新思路和新方向。

4 結(jié) 論

本研究通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)了與PRRSV N蛋白互作的宿主蛋白R(shí)PS20，并確定RPS20對(duì)PRRSV的增殖具有抑制作用。