白藜蘆醇對(duì)急性熱應(yīng)激條件下鴨肝抗氧化能力和細(xì)胞凋亡的影響

周婉婷，楊 晨，彭翠甜，付新亮，鐘焯華，許丹寧，黃運(yùn)茂，田允波，劉文俊*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225； 2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225；3.廣州市番禺區(qū)畜牧獸醫(yī)站，廣州 511495)

熱應(yīng)激導(dǎo)致家禽生產(chǎn)性能、采食量和日增重下降，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致動(dòng)物的死亡[1-3]。肝是重要的新陳代謝器官，調(diào)節(jié)脂質(zhì)和碳水化合物的代謝[4]。肝受外界壓力的影響會(huì)破壞整個(gè)系統(tǒng)的代謝穩(wěn)態(tài)[5]。研究證實(shí)，熱應(yīng)激會(huì)加速脂肪生成并增加肝系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)，顯著增加肝重量和甘油三酯含量[6-8]。研究表明，急性熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致肝抗氧化酶系統(tǒng)紊亂[3,9-11]，長(zhǎng)期熱應(yīng)激會(huì)降低抗氧化酶活性[12-13]。熱應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞氧化應(yīng)激在促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡和壞死中發(fā)揮著重要作用。提高肝抗氧化能力、減緩肝細(xì)胞的凋亡是緩解家禽養(yǎng)殖過(guò)程中熱應(yīng)激問(wèn)題的重要研究目標(biāo)。

白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌等多種功能，受到廣泛關(guān)注[14-18]。在減抗、替抗的趨勢(shì)下，白藜蘆醇具有良好的應(yīng)用前景。白藜蘆醇是一種天然的沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)信號(hào)通路激活劑[19]。SIRT1信號(hào)通路可直接或間接影響細(xì)胞的氧化還原功能，SIRT1的激活可以促使過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α (PGC-1α) 去乙?；痆20]。PGC-1α作為一種細(xì)胞內(nèi)重要的核受體轉(zhuǎn)錄輔激活因子，通過(guò)激活核呼吸因子1(Nrf1)和結(jié)合線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體生物合成及氧化代謝[21]。研究表明，飼糧中添加白藜蘆醇可以有效改善家禽日增重下降，提高肉品質(zhì)[22]。白藜蘆醇可使促凋亡基因表達(dá)量下降，抗凋亡基因表達(dá)量上升，繼而緩解細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時(shí)，白藜蘆醇具有緩解氧化損傷的作用，可提高機(jī)體抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性，保護(hù)腸道健康[22-23]。

本試驗(yàn)研究了白藜蘆醇對(duì)急性熱應(yīng)激蛋鴨肝中熱休克蛋白70(HSP70)和熱休克蛋白90(HSP90)表達(dá)的影響，并進(jìn)一步檢測(cè)了SIRT1信號(hào)通路基因的表達(dá)水平、血清和肝的抗氧化酶活性及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。本研究結(jié)果有助于了解急性熱應(yīng)激對(duì)肝的影響，明確飼糧中添加白藜蘆醇對(duì)山麻鴨的作用效果，為白藜蘆醇應(yīng)用于緩解家禽熱應(yīng)激問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試驗(yàn)分組

試驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，飼養(yǎng)在仲愷教學(xué)科研基地。選擇120只健康的60日齡雌性山麻鴨，隨機(jī)分為2組，每組60只置于常溫((24±2) ℃)下飼養(yǎng)。對(duì)照組(C組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，白藜蘆醇組(RES組)飼喂添加400 mg·kg-1白藜蘆醇的試驗(yàn)飼糧。分開(kāi)飼喂15 d后，測(cè)得C組體重平均值為(1.03±0.04) kg，RES組體重平均值為(1.13±0.04) kg，兩組鴨體重?zé)o明顯差異，隨后將兩組鴨隨機(jī)分為3組(每組20只)分別放置于39 ℃環(huán)控倉(cāng)中0、30、60 min。熱應(yīng)激處理后采集血清樣本，按試驗(yàn)動(dòng)物的原則處死后，屠宰，解剖后采集肝組織，-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

主要試劑：白藜蘆醇購(gòu)自阿拉丁(R107315)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(ABTS快速法)(T-AOC)、總SOD活性檢測(cè)試劑盒(WST-8法)(SOD)、過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒(CAT)、脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒(MDA)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(綠色熒光)均購(gòu)自碧云天；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶測(cè)試盒(GSH-Px)和羥自由基測(cè)定試劑盒(AIHR)均購(gòu)自南京建成有限公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 均購(gòu)自TaKaRa；2×RealStar Green Fast Mixture with ROX II購(gòu)自GenStar；MinuteTM新鮮/冷凍組織胞質(zhì)胞核分離試劑盒、Bcl-2 Rabbit pAb、Caspase-3 Rabbit pAb、Nrf2 Rabbit pAb、Nrf2 Rabbit pAb、PCNA Rabbit pAb、Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)、Donkey Antin-Mouse IgG(H+L)均購(gòu)自萊恩生物科技有限公司。Bax Rabbit pAb購(gòu)自萬(wàn)類生物科技有限公司。

主要儀器：Thermo ScientificTMMultiskanTMFC 酶標(biāo)儀、QuantStudioTM7 Flex 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng)、SorvallTMLegendTMMicro 21R 微量離心機(jī)、VeritiTM96 孔熱循環(huán)儀均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 抗氧化能力和MDA水平檢測(cè)

使用血清樣品和肝組織勻漿上清液檢測(cè)抗氧化指標(biāo)T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px、AIHR和MDA。檢測(cè)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 RNA提取和qRT-PCR分析

采用RNAiso Plus從肝提取總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。所有引物由生工(北京)合成純化(表1)。反應(yīng)體積為20 μL：10 μL 2×RealStar Green Fast Mixture with ROX II，上、下游引物各0.4 μL，1 μL的cDNA模板和8.2 μL的DEPC水。使用QuantStudioTM7 Flex 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。使用β-actin作為內(nèi)參基因，通過(guò)2-ΔΔCT法比較組間mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

提取肝組織的總蛋白，利用MinuteTM新鮮/冷凍組織胞質(zhì)胞核分離試劑盒提取肝組織核蛋白Nrf1及Nrf2，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS變性后，將蛋白上樣于SDS-PAGE膠，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、ECL試劑盒顯色，并在化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行曝光，拍照并保存，利用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.6 TUNEL染色觀察肝細(xì)胞凋亡

用碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定細(xì)胞30～60 min；PBS洗滌2次，每次10 min；加入含碧云天生產(chǎn)的免疫染色強(qiáng)力通透液(P0097)，室溫孵育5 min；用PBS清洗后加入TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min；PBS清洗3次，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 7.1 (GraphPad Software Inc.， USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用雙因素方差分析。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(S.E.M.)”進(jìn)行分析。*表示P<0.05， **表示P<0.01， ***表示P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激鴨肝HSP70和HSP90 mRNA表達(dá)的影響

熱休克蛋白是評(píng)價(jià)動(dòng)物熱應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)，為了驗(yàn)證鴨急性熱應(yīng)激模型的建立和白藜蘆醇在此過(guò)程中的作用，本研究用RT-qPCR檢測(cè)了肝中HSP70和HSP90 mRNA的表達(dá)。如圖1所示，急性熱應(yīng)激刺激了肝組織中HSP70和HSP90 mRNA的表達(dá)。RES組中肝HSP70和HSP90 mRNA的表達(dá)水平相較于對(duì)照組均有所升高，且在熱應(yīng)激60 min時(shí)，RES組中HSP70和HSP90 mRNA的表達(dá)水平相較于對(duì)照組具有極顯著的升高(P<0.001)。

A、B.白藜蘆醇對(duì)熱休克蛋白HSP70、HSP90基因表達(dá)的RT-qPCR結(jié)果。*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001, n=6，下同A, B. RT-qPCR results of resveratrol on the expression of HSP70 and HSP90 genes. *. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001, n=6, the same as below圖1 白藜蘆醇對(duì)HSP70、HSP90 mRNA的影響Fig.1 Effect of resveratrol on HSP70 and HSP90 mRNA levels

2.2 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激鴨肝SIRT1通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

為明確添加白藜蘆醇是否能活化肝細(xì)胞SIRT1途徑，采用RT-qPCR方法檢測(cè)了肝中SIRT1通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，在熱處理時(shí)間相同的情況下，RES組的SIRT1、PGC-1α、Nrf1、TFAMmRNA的表達(dá)量均高于對(duì)照組。熱應(yīng)激增強(qiáng)了SIRT1、PGC-1α、TFAMmRNA的表達(dá)。在熱應(yīng)激30 min時(shí)，RES組中SIRT1 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，RES組中Nrf1 mRNA極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。但是，熒光定量結(jié)果顯示，Nrf2 mRNA變化無(wú)顯著性差異，在熱應(yīng)激條件下，RES組較對(duì)照組的表達(dá)水平低(圖2)。

A、B、C、D、E. 白藜蘆醇對(duì)SIRT1、PGC-1α、Nrf1、TFAM、Nrf2基因表達(dá)的RT-qPCR結(jié)果A, B, C, D, E. RT-PCR results of resveratrol on SIRT1, PGC-1α, Nrf1, TFAM, Nrf2 genes expression圖2 白藜蘆醇對(duì)SIRT1通路相關(guān)基因mRNA的影響Fig.2 Effect of resveratrol on related genes mRNA in SIRT1 pathway

2.3 白藜蘆醇對(duì)Nrf1、Nrf2核蛋白表達(dá)的影響

Nrf1、Nrf2活化后，進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)一系列基因的轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步確認(rèn)通路的活化，提取了核蛋白，并通過(guò)Western blot檢測(cè)了Nrf1、Nrf2的核蛋白水平。如圖3所示，以PCNA為內(nèi)參蛋白，在熱應(yīng)激60 min條件下，RES組的Nrf1核蛋白水平顯著高于對(duì)照組，RES組的Nrf2核蛋白水平極顯著高于對(duì)照組。

A.白藜蘆醇對(duì)Nrf2、Nrf1蛋白表達(dá)的Western blot結(jié)果；B、C.白藜蘆醇對(duì)NRF2、NRF1蛋白表達(dá)影響的分析結(jié)果A．Western blot results of resveratrol on the Nrf2 and Nrf1 proteins expression；B, C. Effect of resveratrol on the expression of Nrf2 and Nrf1 proteins圖3 白藜蘆醇對(duì)Nrf1、Nrf2核蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of resveratrol on the expression of Nrf1 and Nrf2 nuclear proteins

2.4 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激鴨血清抗氧化能力的影響

血清抗氧化酶活性是判斷白藜蘆醇對(duì)鴨抗氧化能力影響的重要指標(biāo)，使用ELISA檢測(cè)了血清中抗氧化酶活性和MDA的含量。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激增加了血清中T-AOC；同一熱應(yīng)激條件下，RES組T-AOC、SOD酶活性、AIHR均高于對(duì)照組；熱應(yīng)激60 min時(shí)，RES組SOD酶活性、CAT酶活性、AIHR顯著高于對(duì)照組；對(duì)照組和RES組的GSH-Px酶活性在熱應(yīng)激條件下并無(wú)顯著變化；急性熱應(yīng)激會(huì)造成對(duì)照組MDA含量增加，但同一熱應(yīng)激條件下，RES組MDA含量比對(duì)照組低，特別是熱應(yīng)激60 min RES組MDA含量顯著低于對(duì)照組(圖4)。

A.血清中的總抗氧化能力；B.血清中的超氧化物歧化酶活性；C.血清中過(guò)氧化氫酶活性；D.血清中谷胱氨肽過(guò)氧化物酶活性；E.血清中抑制羥自由基能力；F.血清中丙二醛含量A． The T-AOC level in serum；B. The SOD activity in serum；C. The CAT activity in serum；D. The GSH-Px activity in serum； E. The AIHR activity in serum；F. The MDA content in serum圖4 白藜蘆醇對(duì)不同時(shí)長(zhǎng)急性熱應(yīng)激血清氧化指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of resveratrol on serum oxidative indices under different duration of acute heat stress

2.5 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激鴨肝抗氧化能力的影響

為了進(jìn)一步探究白藜蘆醇對(duì)鴨肝抗氧化能力的影響，檢測(cè)了肝勻漿的抗氧化酶活性和MDA含量。結(jié)果如圖5所示，熱應(yīng)激會(huì)降低對(duì)照組肝中T-AOC含量和CAT酶活性。SOD的活性在熱應(yīng)激 30 min有所增加，但在熱應(yīng)激 60 min時(shí)降低。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以提高肝GSH-Px酶活性。在熱應(yīng)激30 min時(shí)，白藜蘆醇顯著提高了AIHR。此外，相比對(duì)照組，RES組T-AOC、CAT的水平在熱應(yīng)激狀態(tài)下恢復(fù)更為迅速。急性熱應(yīng)激條件下，白藜蘆醇降低了鴨肝中MDA的含量。

A.肝中的總抗氧化能力；B.肝中的超氧化物歧化酶活性；C.肝中過(guò)氧化氫酶活性；D.肝中谷胱氨肽過(guò)氧化物酶活性；E.肝中抑制羥自由基能力；F.肝中丙二醛含量A. The T-AOC level in the liver；B. The SOD activity in the liver；C. The CAT activity in the liver；D. The GSH-Px activity in the liver； E. The AIHR activity in the liver；F. The MDA content in the liver圖5 白藜蘆醇對(duì)急性熱應(yīng)激肝氧化指標(biāo)的影響Fig.5 Effect of resveratrol on liver oxidative indices under different duration of acute heat stress

2.6 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激條件下蛋鴨肝細(xì)胞凋亡的影響

為了驗(yàn)證白藜蘆醇在急性熱應(yīng)激條件下緩解肝細(xì)胞凋亡的作用，采用TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡的情況。如圖6所示，在對(duì)照組中，急性熱應(yīng)激組較無(wú)熱應(yīng)激組肝細(xì)胞凋亡數(shù)有極顯著增加；在急性熱應(yīng)激條件下，與對(duì)照組相比，白藜蘆醇組的肝細(xì)胞凋亡數(shù)極顯著下降。

A.肝細(xì)胞TUNEL檢測(cè)結(jié)果(50 μm),綠色熒光表示細(xì)胞凋亡，藍(lán)色熒光表示正常細(xì)胞;B.TUNEL染色細(xì)胞與正常細(xì)胞比例A. Liver cell TUNEL assay results(50 μm), green fluorescence indicates cell apoptosis, blue fluorescence indicates normal cells; B. Proportion of TUNEL-stained cells to normal cells圖6 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of resveratrol on hepatocyte apoptosis induced by heat stress

2.7 白藜蘆醇對(duì)蛋鴨肝細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探究急性熱應(yīng)激及白藜蘆醇對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響，采用RT-qPCR檢測(cè)了肝中Bcl-2、Bax、Caspase3、Bak1、Cytc、Bax/Bcl-2mRNA的表達(dá)。如圖7所示，熱應(yīng)激促進(jìn)了Caspase-3的mRNA的表達(dá)；在同一熱應(yīng)激條件下，RES組的Bax、Bak1和Bax/Bcl-2的mRNA的表達(dá)量低于對(duì)照組；在急性熱應(yīng)激條件下，RES組Bcl-2和Caspase3 mRNA的表達(dá)量高于對(duì)照組。

A、B、C、D、E. 白藜蘆醇對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的RT-qPCR結(jié)果; F. 白藜蘆醇對(duì)Bax/Bcl-2基因表達(dá)的影響A, B, C, D, E. RT-qPCR results of resveratrol on the expression of apoptosis related genes; F. Effect of resveratrol on Bax/Bcl-2 gene expression圖7 白藜蘆醇對(duì)肝細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.7 Effect of resveratrol on mRNA expression of apoptosis related genes in hepatocytes

2.8 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激蛋鴨肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

本研究用Western blot檢測(cè)了肝組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量。如圖8所示，同一熱應(yīng)激條件下，RES組Bax、Caspase3、Bax/Bcl-2的蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組；熱應(yīng)激30及60 min條件下，RES組Bcl-2蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組。

A. 白藜蘆醇對(duì)Bax、Bcl-2、caspase3 蛋白表達(dá)的Western blot 結(jié)果；B、C、D.白藜蘆醇對(duì)Bcl-2、Bax、caspase3蛋白表達(dá)的影響；E. 白藜蘆醇對(duì)Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響A．Western blot results of resveratrol on the Bax, Bcl-2 and caspase3 proteins expression；B, C, D. Effect of resveratrol on the expression of Bcl-2, Bax and caspase3 proteins; E. Effect of resveratrol on Bax/bcl-2 protein expression圖8 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激蛋鴨肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of resveratrol on the expression of apoptosis related proteins in heat stressed duck hepatocytes

3 討 論

熱應(yīng)激造成細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致組織損傷，致使家禽生產(chǎn)性能下降[24-29]。白藜蘆醇具有極強(qiáng)的抗氧化和抗炎能力，是具有潛力的抗熱應(yīng)激藥物。本試驗(yàn)以雌性山麻鴨為研究對(duì)象，旨在揭示白藜蘆醇對(duì)鴨急性熱應(yīng)激狀態(tài)下抗氧化能力及抗細(xì)胞凋亡的影響和調(diào)控機(jī)制，為白藜蘆醇緩解家禽熱應(yīng)激的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

熱休克蛋白是熱應(yīng)激的關(guān)鍵指標(biāo)，并在緩解壓力中起重要作用[30]。HSP70和HSP90是重要的分子伴侶，前者在蛋白穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，后者參與促進(jìn)幾種受體和激酶的成熟[31]。白藜蘆醇顯著增加了HSP70和HSP90 mRNA的表達(dá)[12]，這提示白藜蘆醇可能通過(guò)誘導(dǎo)HSPs的表達(dá)保護(hù)家禽因急性熱應(yīng)激引起的肝損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇顯著升高了急性熱應(yīng)激下肝中SIRT1、PGC-1α、Nrf1和TFAMmRNA的表達(dá)水平，也顯著升高了Nrf1、Nrf2的核蛋白水平。白藜蘆醇被認(rèn)為是SIRT1的天然化學(xué)激活劑。有研究表明，白藜蘆醇可以提高家禽腎SIRT1、PGC-1α、Nrf1和TFAM的表達(dá)，調(diào)節(jié)和保護(hù)線粒體功能[32]。TFAM的表達(dá)可以增加在抗氧化機(jī)制中至關(guān)重要的mtDNA[33]。此外，SIRT1具有調(diào)控HSF1的作用，研究發(fā)現(xiàn)抑制SIRT1還可以降低HSP70和HSP90的表達(dá)[34]。這些結(jié)果說(shuō)明，白藜蘆醇可以通過(guò)促使SIRT1通路活化增強(qiáng)肝抗氧化能力，緩解熱應(yīng)激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。

家禽暴露在高溫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致線粒體損傷產(chǎn)生過(guò)量活性氧，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷，導(dǎo)致氧化應(yīng)激破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[9,35-36]。肝是家禽氧化代謝和脂肪合成的重要器官[1-8]。SOD、CAT和GSH-Px是重要的抗氧化系統(tǒng)，它們可以將自由基和過(guò)氧化氫最終分解為水和分子氧[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn)，急性熱應(yīng)激可以造成血清T-AOC、GSH-Px活性增加和和肝T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性降低。MDA含量在受到熱應(yīng)激后均增加。這說(shuō)明急性熱應(yīng)激會(huì)破壞自由基和過(guò)氧化氫產(chǎn)生和清除間的平衡。有趣的是，白藜蘆醇可以有效改善熱應(yīng)激導(dǎo)致的家禽氧化應(yīng)激，提高T-AOC、GSH-Px、CAT和AIHR，并降低MDA[9,22-25,30-35,39]。有研究表明，白藜蘆醇可以上調(diào)HO-1表達(dá)，激活Nrf-2，從而減輕心肌缺血再灌注和缺氧缺血性腦損傷引起的氧化應(yīng)激和炎癥[40]。因此，將白藜蘆醇作為飼料添加劑具有顯著的抗氧化效果。

內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的過(guò)程是由Bax等線粒體蛋白介導(dǎo)的，有研究表明，Bax/Bcl-2兩蛋白的比例決定了細(xì)胞凋亡的強(qiáng)弱[39,41]，本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加白藜蘆醇會(huì)使Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)量下降，同時(shí)也會(huì)使促凋亡蛋白Bak1、Cytc、Caspase3 mRNA的表達(dá)量有所減少，這表明白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激條件下的肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

綜上所述，急性熱應(yīng)激對(duì)山麻鴨肝的氧化-抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面影響，引起氧化應(yīng)激。飼糧中添加400 mg·kg-1白藜蘆醇可以通過(guò)上調(diào)HSP70和HSP90 mRNA，激活SIRT1信號(hào)通路，減少促凋亡基因，增加抗凋亡基因表達(dá)，增強(qiáng)肝的抗氧化及抗細(xì)胞凋亡的能力。研究結(jié)果說(shuō)明，白藜蘆醇可以提高鴨肝的抗氧化能力和抗細(xì)胞凋亡的能力，有效改善急性熱應(yīng)激條件下鴨肝的氧化損傷。