小麥飼料中添加木聚糖酶對高原型藏羊胃腸道發(fā)育的影響

周 力，高占紅，張峰碩，桂林生*，侯生珍，韓麗娟，孫勝男，院珍珍

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016； 2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

胃腸道作為哺乳動物主要的消化吸收場所，同時也是體內(nèi)最大的免疫器官。幼齡動物由于消化道發(fā)育不健全，任何外界條件的干擾或酶制劑的改變都會影響機體的生長發(fā)育[1-2]。在實踐生產(chǎn)中，小麥由于產(chǎn)量大、價格低且蛋白質(zhì)與氨基酸的含量都高于玉米，可替代部分玉米作為畜禽能量飼料原料[3]。然而麥類飼料中木聚糖、果膠、纖維素等非淀粉多糖(non-starch polysaccharides, NSP)含量較高，導(dǎo)致反芻動物對小麥中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收利用率降低。據(jù)報道，以小麥、麩皮及豆粕等為基礎(chǔ)的飼糧中添加外源酶制劑能夠破壞植物細胞壁，促進畜禽胃腸道的發(fā)育，改善養(yǎng)分的消化吸收，從而提高機體的生長發(fā)育[4]。

作為一種主要的纖維分解酶[5]，木聚糖酶在破壞植物細胞壁、消除抗營養(yǎng)因子、降低腸道食糜黏度、促進畜禽的生長發(fā)育以及維持腸道健康等方面都發(fā)揮積極作用。在不同類型日糧中添加木聚糖酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5%麩皮日糧補充200 U·g-1木聚糖酶可以提高蛋雞采食量，并增加空腸絨毛高度[6]。以禽類為研究對象，日糧麩皮添加水平達到8%時對肉雞生長性能與盲腸菌群數(shù)量且無負面影響，但補充80 mg·kg-1木聚糖酶可以降低盲腸有害菌數(shù)量，同時能夠改善盲腸短鏈脂肪酸數(shù)量以及提高生長性能[7]。在單胃動物中，木聚糖酶能夠改善仔豬腸道物理屏障和免疫屏障功能，提高體外營養(yǎng)物質(zhì)消化率[8]。在水產(chǎn)動物中，木聚糖酶可以提高草魚的生長性能、促進腸道發(fā)育、改善腸道微生物，并增強腸炎抵抗力[9]。添加含木聚糖酶的復(fù)合酶制劑后，能夠提高青貯飼料的營養(yǎng)價值與飼喂價值[10]，并一定程度上促進犢牛免疫和生長性能的提高[11]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，推測在小麥型飼料中添加適宜的木聚糖酶不僅能夠加強動物對飼料的消化吸收、提高生長性能、節(jié)約成本，同時還可改善消化道發(fā)育。

因此，本試驗旨在探討小麥替代精料補充料中部分玉米并添加木聚糖酶對高原型藏羊消化道發(fā)育是否具有一定的積極作用。以生長期羔羊為研究對象，通過在小麥飼料中添加0.2%木聚糖酶對其消化道發(fā)育的影響，以期為綿羊的健康生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及動物選擇

試驗選擇60只體況良好且體重相近((19.35±2.18)kg)的2～3月齡高原型藏羊公羔作為試驗動物。采用對照試驗設(shè)計，將羔羊隨機分為兩個處理組，每組30只，分別飼喂小麥粉替代精料補充中部分玉米(青海省香咔梅朵牧業(yè)飼料廠，營養(yǎng)物質(zhì)濃度見表1)和小麥粉替代精料補充中部分玉米基礎(chǔ)上添加0.2%木聚糖酶(湖北武漢新華揚生物股份有限公司，活性100 000 U·g-1)。飼養(yǎng)試驗持續(xù)100 d，其中預(yù)飼期10 d 正試期90 d。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(DM basis) %

1.2 飼養(yǎng)管理

羔羊采用單欄飼養(yǎng)，兩組飼養(yǎng)環(huán)境條件(溫度、通風(fēng)、光照等)基本一致。每天上午08:00和下午17:30將精料補充料和粗飼料(燕麥青草+燕麥青貯，按干物質(zhì)1∶1計)混合均勻各飼喂1次，木聚糖酶的終濃度為0.2%，自由采食，自由飲水，按照羊場的規(guī)定進行常規(guī)消毒、驅(qū)蟲等處理。整個試驗根據(jù)羔羊生長特點和常規(guī)飼養(yǎng)管理分為兩個階段，第一個階段：0～30 d(精料∶粗料=60∶40)，第二個階段：31～90 d(精料∶粗料=70∶30)。

1.3 組織樣品采集及切片制作

飼養(yǎng)試驗結(jié)束時，羔羊屠宰后立即打開腹腔，結(jié)扎各胃室(瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃)和腸道(十二指腸、空腸和回腸)分解處，利用無菌剪刀采集各部位1 cm2組織，將其浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，按常規(guī)方法制作石蠟切片，進行蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色，同時采集瘤胃和空腸的內(nèi)容物，置于液氮中帶回實驗室。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 胃腸道切片測定指標與方法 運用Olympus BX51(奧林巴斯有限責(zé)任公司，日本)顯微鏡觀察胃腸道黏膜組織形態(tài)，再使用Image-Pro Express 6.0圖像分析軟件觀察并測量前胃(瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃胃)的角質(zhì)層厚度、顆粒層厚度、乳頭長度、乳頭寬度、肌層厚度、中央肌層厚度，真胃(皺胃)的角質(zhì)層厚度、黏膜層厚度、黏膜下層厚度肌層厚度以及小腸的絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度、肌層厚度、黏膜厚度、絨毛高度/隱窩深度。每個樣品觀察3張非連續(xù)的切片，每張切片隨機選取5個典型視野，每個視野分別測定4組數(shù)據(jù)，取其平均值作為1個測定數(shù)據(jù)。

1.4.2 瘤胃和血清LPS濃度 在正試期第90 d，每組隨機選取5只羔羊于晨飼前進行頸靜脈采血，每只羊采血10 mL，靜置30 min后，在4 ℃條件下3 500 r·min-1離心15 min，分裝1.5 mL離心管中，置于-20 ℃冰箱保存。血清和瘤胃中脂多糖/內(nèi)毒素(lipopolysaccharide, LPS)含量采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定。

1.4.3 瘤胃和空腸消化酶活性 糜蛋白酶(chymotrypsin)、胰蛋白酶(TPS)、脂肪酶(lipase)、纖維素酶(CE)和α-淀粉酶(α-amylase)活性的檢測均嚴格按照試劑盒(江蘇酶標生物科技有限公司)說明書進行。

1.4.4 瘤胃和空腸抗氧化指標 谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)、總抗氧化能力(total antioxygentic capacity, T-AOC)含量的測定均嚴格按照試劑盒(南京建成生物工程有限公司)說明書進行。

1.4.5 瘤胃和空腸pH 羔羊屠宰后立即取其瘤胃和空腸的內(nèi)容物，并用便攜式pH計(PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)插入胃腸道內(nèi)進行檢測，每個部分測定5次，結(jié)果取其平均值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019初步整理后，使用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并利用Duncan氏法進行多重比較，數(shù)據(jù)表示為平均值和標準誤，以P<0.05表示為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 日糧中添加木聚糖酶對高原型藏羊胃腸道形態(tài)發(fā)育的影響

從表2和圖1可知，對照組瘤胃的角質(zhì)層厚度、顆粒層厚度顯著低于試驗組(P<0.05)，兩組間瘤胃的乳頭長度、乳頭寬度、肌層厚度和中央肌層厚度差異均不顯著(P>0.05)。試驗組網(wǎng)胃的乳頭長度、乳頭寬度、角質(zhì)層厚度、顆粒層厚度、肌層厚度和中央肌層厚度均高于對照組，但未達到顯著水平(P>0.05)。試驗組瓣胃的乳頭長度、乳頭寬度、角質(zhì)層厚度及顆粒層厚度均顯著高于對照組(P<0.05)，但兩組間肌層厚度和中央肌層厚度差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，試驗組皺胃的黏膜厚度顯著提高(P<0.05)，兩組間角質(zhì)層厚度、肌層厚度及黏膜下層差異均不顯著(P>0.05)。這說明在日糧中添加0.2%木聚糖酶有益于高原型藏羊復(fù)胃的形態(tài)發(fā)育。

表2 木聚糖酶對羔羊復(fù)胃形態(tài)發(fā)育的影響Table 2 Effects of xylanase on morphological development of compound stomach in lambs μm

a.瘤胃(200×)；b.網(wǎng)胃(200×)；c.瓣胃(200×)；d.皺胃(400×)a. Rumen (200×); b. Reticulum(200×); c. Omasum(200×); d. Abomasum (400×)圖1 木聚糖酶對羔羊復(fù)胃形態(tài)發(fā)育的影響Fig.1 Effects of xylanase on morphological development of ruminant stomach in lambs

從表3和圖2可知，對照組十二指腸的肌層厚度顯著低于試驗組(P<0.05)，兩組間絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度、黏膜厚度、絨毛高度/隱窩深度差異均不顯著(P>0.05)。相較于對照組，試驗組空腸的絨毛高度和黏膜厚度顯著提高(P<0.05)，絨毛寬度、隱窩深度、肌層厚度及絨毛高度/隱窩深度差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，試驗組回腸的絨毛高度、絨毛寬度、肌層厚度、黏膜厚度和絨毛高度/隱窩深度在數(shù)值上均有所提高，而隱窩深度有所下降，其中肌層厚度差異顯著(P<0.05)。這表明在日糧中添加0.2%木聚糖酶有助于高原型藏羊小腸的形態(tài)發(fā)育。

表3 木聚糖酶對羔羊腸道形態(tài)發(fā)育的影響Table 3 Effects of xylanase on intestinal morphology and development of lambs μm

a. 十二指腸(100×)；b. 空腸(100×)；c. 回腸(100×)a. Duodenum (100×); b. Jejunum (100×); c. Ileum (100×)圖2 木聚糖酶對羔羊小腸形態(tài)發(fā)育的影響Fig.2 Effects of xylanase on the morphological development of small intestine of lambs

2.2 日糧中添加木聚糖酶對高原型藏羊瘤胃和血清LPS濃度的影響

由圖3可知，相較于對照組，試驗組瘤胃和血清的LPS含量均顯著下降(P<0.05)。這提示在日糧中添加0.2%木聚糖酶能夠明顯減少高原型藏羊瘤胃和血清的LPS含量。

*. 差異顯著；ns. 差異不顯著，下圖同*. Means significant difference; ns. Means insignificant difference, the same as below圖3 木聚糖酶對羔羊瘤胃(a)和血清(b)LPS含量的影響Fig.3 Effects of xylanase on rumen(a) and serum(b) LPS content of lambs

2.3 日糧中添加木聚糖酶對高原型藏羊胃腸道消化酶活性的影響

從表4可知，試驗組瘤胃的糜蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)，同時試驗組瘤胃的纖維素酶、α-淀粉酶活性亦高于對照組，但未達到顯著水平(P>0.05)。這提示在日糧中添加0.2%木聚糖酶能夠增強高原型藏羊瘤胃的消化酶活性。

表4 木聚糖酶對羔羊瘤胃消化酶活性的影響Table 4 Effects of xylanase on rumen digestive enzyme activity of lambs (U·L-1)

從表5可知，與對照組相比，試驗組空腸的糜蛋白酶、α-淀粉酶活性顯著上升(P<0.05)，此外空腸的胰蛋白酶、脂肪酶及纖維素酶活性也有所上升，但差異不顯著(P>0.05)。由此可知，在日糧中添加0.2%木聚糖酶能夠提高高原型藏羊空腸的消化酶活性。

表5 木聚糖酶對羔羊空腸消化酶活性的影響Table 5 Effects of xylanase on jejunum digestive enzyme activity of lambs (U·L-1)

2.4 日糧中添加木聚糖酶對高原型藏羊胃腸道抗氧化特性的影響

從表6可知，相較于對照組，試驗組瘤胃的谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性及總抗氧化能力水平均顯著提高(P<0.05)，兩組間瘤胃的超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量差異不顯著(P>0.05)。由此可見，在日糧中添加0.2%木聚糖酶能夠提升高原型藏羊瘤胃的抗氧化能力。

表6 木聚糖酶對羔羊瘤胃抗氧化能力的影響Table 6 Effects of xylanase on rumen antioxidant capacity of lambs

從表7可知，試驗組空腸的谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活性及總抗氧化能力水平均顯著高于對照組(P<0.05)，而試驗組空腸的丙二醛含量略低于對照組(P>0.05)。據(jù)此可知，在日糧中添加0.2%木聚糖酶能夠加強高原型藏羊空腸的抗氧化能力。

表7 木聚糖酶對羔羊空腸抗氧化能力的影響Table 7 Effect of xylanase on antioxidant capacity of jejunum of lambs

2.5 日糧中添加木聚糖酶對高原型藏羊胃腸道pH的影響

由圖4可知，相較于對照組，試驗組瘤胃的pH有所下降，但未達到顯著水平(P>0.05)。兩組間空腸的pH差異不顯著(P>0.05)。由此可以看出，在日糧中添加0.2%木聚糖酶對高原型藏羊瘤胃和空腸的pH影響較小。

圖4 木聚糖酶對羔羊瘤胃(a)和空腸(b)pH的影響Fig.4 Effects of xylanase on rumen(a) and jejunum(b) pH of lambs

3 討 論

3.1 日糧中添加木聚糖酶對高原型藏羊胃腸道形態(tài)發(fā)育的影響

幼齡反芻動物各胃室的發(fā)育情況直接影響成年后的采食量與消化能力。前胃的乳頭長度、乳頭寬度、角質(zhì)層、顆粒層、肌層、中央肌層厚度和真胃的角質(zhì)層、黏膜層、黏膜下層以及肌層厚度等是評價動物消化道對養(yǎng)分消化吸收的主要指標[12]。由此可見，發(fā)育良好的胃腸道對于提高飼料消化吸收以及發(fā)揮動物生產(chǎn)潛力具有一定的促進作用。木聚糖酶在自然界分布廣泛，從動物、植物和微生物中均可獲得，在日糧中添加木聚糖酶可能有利于畜禽胃腸道的發(fā)育。以生長豬為試驗對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小麥基礎(chǔ)日糧中添加木聚糖酶能夠提高其胃和后腸對膳食纖維的消化率，并改善能量水平[13]。然而，當(dāng)前木聚糖酶與反芻動物消化器官發(fā)育的相關(guān)研究較少。本試驗以生長期羔羊為研究對象，結(jié)果表明，木聚糖酶對羔羊各胃室組織形態(tài)學(xué)指標的發(fā)育呈促進作用。說明日糧中添加0.2%木聚糖酶可改善高原型藏羊復(fù)胃的生長發(fā)育。

小腸由十二指腸、空腸和回腸3部分組成，其形態(tài)結(jié)構(gòu)的完善是養(yǎng)分被充分消化吸收的物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。Luo等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在木聚糖酶添加量(600～1 200 U·kg-1)一定時能夠改善幼年大黃魚的生長性能，優(yōu)化腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和微生物群組成，并提高對碳水化合物利用能力。以尼羅羅非魚為試驗對象[16]，結(jié)果表明，在含高葵花籽粕的日糧中添加外源木聚糖酶可改善其生長性能、消化酶活性、營養(yǎng)物質(zhì)消化率、肝和腸道的組織學(xué)形態(tài)。從本試驗來看，日糧中添加0.2%木聚糖酶可有效提高羔羊小腸的絨毛高度、寬度、黏膜厚度、肌層厚度，降低隱窩深度，同時增大V/C比值。推測可能是小麥細胞壁被木聚糖酶溶解后，使更多的淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)素被釋放出來，更好地被宿主利用，進而完善腸道黏膜結(jié)構(gòu)，這與上述人員研究結(jié)果基本一致。

3.2 日糧中添加木聚糖酶對高原型藏羊瘤胃和血清LPS濃度的影響

正常情況下，消化道上皮屏障能夠有效阻止脂多糖易位進入外周循環(huán)系統(tǒng)，一旦胃腸道上皮遭受損傷時，脂多糖便會發(fā)生易位，繼而引起機體炎癥反應(yīng)，也是機體多種并發(fā)癥的致病因子[17]。因此，通過檢測瘤胃與血清中LPS濃度能夠間接衡量羔羊日糧中添加木聚糖酶是否會改善胃腸道的炎癥反應(yīng)。研究表明，奶牛持續(xù)飼喂高精料飼糧會顯著提高其回腸與盲腸中LPS含量[18]。另有研究證實[19]，與健康牛相比，病牛瘤胃液和糞便樣品中LPS濃度顯著提高，并將其作為鑒別亞急性瘤胃酸中毒重要的診斷方法。黃淑成等[20]研究亦發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激組中肉雞血清內(nèi)毒素與Toll樣受體4(TLR4)基因mRNA在肝中的表達差異均極顯著高于對照組?；谏鲜鲅芯康慕Y(jié)論可以看出，LPS濃度能夠在一定程度上反映機體的健康狀況。在本試驗中，試驗組瘤胃和血清的LPS濃度均顯著低于對照組。進一步表明木聚糖酶能夠緩解多種因素導(dǎo)致的炎癥損傷，并提高機體清除LPS的能力。

3.3 日糧中添加木聚糖酶對高原型藏羊胃腸道消化酶活性的影響

日糧中含有大量的抗營養(yǎng)因子，通過添加酶制劑可以降解飼料中抑制因子，同時能夠激活胃腸道內(nèi)源酶的分泌并提高其活性[21]。研究表明，在肉雞飼糧中添加木聚糖酶，小腸糜蛋白酶和脂肪酶的活性顯著提高[22]。同樣以肉雞為研究對象，進一步證實復(fù)合酶制劑有利于增強其消化器官內(nèi)源酶的活性，適合在小麥替代玉米的小麥-豆粕型飼糧中使用[23]。飼料中添加木聚糖酶也能明顯增加幼參腸道消化酶活力，蛋白酶和脂肪酶活力隨著木聚糖酶添加水平的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗組瘤胃的糜蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶及空腸的糜蛋白酶、α-淀粉酶活性均顯著高于對照組。這提示在日糧中添加0.2%木聚糖酶可增強羔羊瘤胃和空腸消化酶的活性。其原因可能是由于酶制劑的添加能夠優(yōu)化羔羊消化道微生物平衡，抑制致病菌的生長，促進有益菌的繁殖，刺激體內(nèi)多種消化酶的分泌，因而增強其消化酶活性。

3.4 日糧中添加木聚糖酶對高原型藏羊胃腸道抗氧化特性的影響

當(dāng)機體受到各種因素刺激時，會打破體內(nèi)氧陰離子自由基動態(tài)平衡狀態(tài)，產(chǎn)生大量自由基，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。余婕等[25]研究發(fā)現(xiàn)，肉鴨飼糧中添加3%亞麻籽+200 mg·kg-1茶多酚可顯著提高總抗氧化能力活力，并顯著降低丙二醛含量。另外，在熱應(yīng)激狀態(tài)下，西門塔爾牛血清中丙二醛含量相比于熱應(yīng)激恢復(fù)期顯著升高，但總抗氧化能力顯著降低[26]，進一步揭示了熱應(yīng)激可以導(dǎo)致機體產(chǎn)生過多的自由基，降低抗氧化能力。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗組瘤胃與空腸的丙二醛含量均有所下降，但總抗氧化能力卻顯著提高。提示在日糧中添加0.2%木聚糖酶可降低脂質(zhì)過氧化對機體的損傷，同時有助于提高羔羊胃腸道抗氧化能力。本試驗亦證實，對照組瘤胃的谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性以及空腸的谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性均顯著低于試驗組。由此可見，木聚糖酶能夠促進機體清除自由基，緩解氧化損傷，并增強抗氧化酶的活性。

3.5 日糧中添加木聚糖酶對高原型藏羊胃腸道pH的影響

胃腸道內(nèi)適宜的pH是維持機體內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡以及調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡的關(guān)鍵因素[27]。適宜的酸性環(huán)境是保障斷奶羔羊發(fā)揮正常消化、吸收功能的基礎(chǔ)。當(dāng)pH升高時，表明消化道的環(huán)境有益于有害微生物增殖，反之則有利于有益微生物的生長[28]。斷奶羔羊由于消化器官尚未成熟，胃酸分泌不足，成年動物也常因遺傳、營養(yǎng)以及環(huán)境等因素的改變導(dǎo)致消化道pH升高，影響消化酶活性，從而難以發(fā)揮其最佳的作用效果，有益菌群的生長也會受到抑制，因此可以依靠酶制劑來改善消化道中pH值。在本試驗中，試驗組瘤胃的pH低于對照組，且兩組瘤胃的pH值均處于正常范圍內(nèi)[29]。說明在日糧中添加0.2%木聚糖酶在一定程度上改善藏羊瘤胃酸性環(huán)境，可能達到促進優(yōu)勢菌群(如：乳酸桿菌、雙歧桿菌等)繁殖的目地。除此之外，本試驗發(fā)現(xiàn)，兩組間空腸的pH差異不顯著，但試驗組略高于對照組。表明在日糧中添加0.2%木聚糖酶對藏羊空腸的酸性環(huán)境作用效果不佳。

4 結(jié) 論

綜上，在本試驗中，小麥粉添加0.2%木聚糖酶能明顯促進高原型藏羊胃腸道組織的形態(tài)發(fā)育，增強其消化酶活性、提高抗氧化能力，并有效降低瘤胃與血清LPS含量。