GnIH基因克隆、表達(dá)及對(duì)幼齡公兔生殖激素的影響

桑 雷，陳冬金，孫世坤，高承芳，王錦祥，陳巖鋒，謝喜平*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013； 2.福建省畜禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350013)

閩西南黑兔(Oryctolaguscuniculus)是福建省少數(shù)幾個(gè)進(jìn)入國(guó)家畜禽遺傳資源目錄的地方肉兔品種資源，其毛色全黑，體軀短小，兩耳直立，眼大有神，主要分布于福建省龍巖市和泉州市等地區(qū)的山區(qū)。閩西南黑兔肉質(zhì)鮮美，在閩西和閩南一帶常以白宰和燉酒食用，是民間酒席上的佳肴，深受當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)的歡迎[1]。

促性腺激素抑制素(gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)是最早由Tsutsui等[2]發(fā)現(xiàn)的一種抑制鵪鶉垂體促性腺激素(gonadotropin, GTH)釋放的下丘腦RF-酰胺神經(jīng)肽(SIKPSAYLPLRFa)，由GnIH前體蛋白裂解產(chǎn)生。不同動(dòng)物的GnIH成熟肽均是由GnIH基因編碼的前體蛋白經(jīng)過(guò)酶切加工產(chǎn)生，具有C末端LPXRFa酰胺特征基序[3]。GnIH主要分布于包括鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳動(dòng)物以及魚(yú)類(lèi)在內(nèi)的脊椎動(dòng)物下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG)，其通過(guò)減少脊椎動(dòng)物的GTH的合成和釋放，進(jìn)而影響生殖激素的分泌、性腺的發(fā)育和形成以及性行為的表現(xiàn)[4-9]。鳥(niǎo)類(lèi)GnIH神經(jīng)元細(xì)胞體主要集中在下丘腦室旁核，其神經(jīng)纖維幾乎延伸至整個(gè)前腦、中腦和間腦等區(qū)域，GnIH神經(jīng)元投射最密集區(qū)域?yàn)檎新∑鹜鈱?，在此區(qū)域與促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)、阿片黑皮質(zhì)激素原(proopio-melanocortin， POMC)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)、親吻肽(kisspeptin，Kiss1)和食欲素(orexin，OX)等諸多神經(jīng)元緊密聯(lián)接。哺乳動(dòng)物的GnIH神經(jīng)纖維的細(xì)胞體集中在下丘腦背內(nèi)側(cè)核，神經(jīng)纖維投射到視前核和杏仁核中部、終紋床核、室旁核、弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核以及正中隆起[9-10]。在小鼠、倉(cāng)鼠、綿羊、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的大腦內(nèi)，40%～80%的GnRH細(xì)胞與GnIH纖維緊密聯(lián)系，GnIH可以通過(guò)作用于下丘腦GnRH神經(jīng)元進(jìn)而調(diào)控GTH的合成與分泌[11-16]。除了作用于哺乳動(dòng)物下丘腦外，GnIH被報(bào)道可以通過(guò)結(jié)合垂體上受體G蛋白耦聯(lián)受體147(G-protein coupled receptor 147，GPR147)對(duì)GTH及其下游膽固醇激素進(jìn)行調(diào)控[4, 17-20]。在羊、大鼠、牛的原代垂體細(xì)胞均檢測(cè)到GPR147的存在，添加GnIH都能抑制GnRH刺激的促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的釋放[5, 13, 21-23]。在羊中，GnIH還能直接降低原代垂體細(xì)胞卵泡刺激素β亞基(follicle stimulating hormone subunit beta，F(xiàn)SHβ)和促黃體素β亞基(luteinizing hormone subunit beta，LHβ)的合成，消除GTH細(xì)胞內(nèi)GnRH激活的Ca2+活動(dòng)，中和GnRH刺激的LHmRNA升高[13]。此外，將GnIH過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中會(huì)降低睪酮合成相關(guān)酶-類(lèi)固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory，StAR)、P450側(cè)鏈裂解酶(cytochrome P450 side chain cleavage enzyme，P450 scc)和3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)基因的表達(dá)量進(jìn)而抑制睪酮的分泌[24]。綜上所述，GnIH可以調(diào)控哺乳動(dòng)物下丘腦神經(jīng)元釋放GnRH以及抑制垂體GTH細(xì)胞合成和釋放LH和FSH。

目前，鵪鶉(967 bp)[25]、小鼠(818 bp)[26]、人(1 190 bp)[26]、豬(1 124 bp)[27]等物種的GnIHcDNA全長(zhǎng)陸續(xù)被克隆和測(cè)序，家兔方面，只有劉晶[28]獲得了家兔GnIHcDNA部分序列(389 bp)，然而未獲得完整的cDNA序列。因此，本試驗(yàn)以閩西南黑兔為研究對(duì)象，通過(guò)RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)克隆GnIH基因完整cDNA序列，分析其基因功能，再根據(jù)獲得序列信息設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)GnIH基因在各個(gè)組織以及不同發(fā)育階段下丘腦中的表達(dá)水平，確定GnIH基因表達(dá)規(guī)律，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)腹腔注射鵪鶉GnIH相關(guān)肽，研究其對(duì)幼齡公兔血清中生殖激素的影響，以期為下一步探究GnIH對(duì)兔生殖發(fā)育的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)分為兔GnIH基因cDNA全長(zhǎng)克隆與序列分析、GnIH基因mRNA表達(dá)分析以及GnIH相關(guān)肽對(duì)幼齡公兔生殖激素的影響3部分。其中：1)GnIH基因cDNA克隆與序列分析試驗(yàn)主要以90日齡公兔為研究對(duì)象，通過(guò)RACE技術(shù)克隆兔GnIH基因cDNA序列，并對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；2)GnIH基因mRNA表達(dá)分析試驗(yàn)，主要分析該基因在90日齡公兔的不同組織表達(dá)水平以及11～150日齡公兔下丘腦中的表達(dá)水平；3)GnIH相關(guān)肽對(duì)公兔生殖激素的影響試驗(yàn)，主要研究腹腔注射公兔0、0.5、5以及50 μg 鵪鶉GnIH相關(guān)肽后，公兔血清中包括睪酮在內(nèi)的生殖激素以及睪丸睪酮合成相關(guān)酶基因mRNA的變化。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

本次試驗(yàn)的樣品均采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所智能化兔舍試驗(yàn)平臺(tái)的閩西南黑兔群體。樣品包括：1)5只90日齡健康公兔的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、睪丸、下丘腦、垂體、背肌、脂肪；2)同一批次公兔分別在11、30、60、90、120、150日齡時(shí)隨機(jī)選擇6只屠宰，采集下丘腦組織備用；3)同一批次40只公兔隨機(jī)分為4組，在80日齡時(shí)分別腹腔注射0、0.5、5和50 μg的GnIH相關(guān)肽(Quail GnIH related peptide 1， Phoenix Pharmaceuticals, 美國(guó))，連續(xù)注射10 d，第11天早上采集耳靜脈血液，隨后屠宰，剝離睪丸組織備用。

1.3 RNA的提取和cDNA合成

利用總RNA提取試劑盒(Invitrogen, 美國(guó))提取兔各組織的總RNA，加入DNase I(Takara，日本)進(jìn)行消化，RNA的含量和純度使用凝膠電泳和Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，并調(diào)整總RNA質(zhì)量濃度至1 μg·μL-1。取出2 μL總RNA，利用SuperScriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen, 美國(guó))和Oligo (dT)18反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于克隆GnIH全長(zhǎng)cDNA序列的中間片段或熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)檢測(cè)。使用閩西黑兔下丘腦組織RNA，根據(jù)SMARTer RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa，日本)說(shuō)明書(shū)分別合成5′-RACE和3′-RACE的cDNA模板，用于5′和3′末端序列的克隆。

1.4 兔GnIH基因全長(zhǎng)cDNA序列克隆

參考兔GnIH基因預(yù)測(cè)序列(GenBank：XM_002713827.2)設(shè)計(jì)保守區(qū)段的擴(kuò)增引物(表1)，以兔下丘腦cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得其中間序列。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：模板(cDNA原液)1 μL、2×PCR Buffer 25 μL、20 μmol·L-1上、下游引物各1 μL、1.25 U·μL-1DNA聚合酶1 μL，滅菌超純水21 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中檢測(cè)，然后送上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)所獲得兔GnIH基因的中間序列，設(shè)計(jì)5′-RACE和3′-RACE特異引物(表1)。5′-RACE和3′-RACE PCR反應(yīng)按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa，日本)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將擴(kuò)增的片段分別切膠純化回收后，連接到T-Vector pMDTM20載體(TaKaRa，日本)，經(jīng)菌落PCR篩選后挑取克隆送上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

用DNAStar 8.0中的SeqMan拼接5′-RACE、3′-RACE和中間序列，得到GnIH基因的cDNA全長(zhǎng)，并根據(jù)獲得cDNA全長(zhǎng)序列重新設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增后測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系(50 μL)：模板2 μL、2×PCR Buffer 25 μL、20 μmol·L-1上、下游引物各1 μL、1.25 U·μL-1DNA聚合酶1 μL,滅菌超純水20 μL。驗(yàn)證PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。

1.5 兔GnIH生物信息學(xué)分析

使用Expasy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/)在線軟件ProtParam和Protscale分別分析兔GnIH前體蛋白的理化性質(zhì)和親-疏水性。利用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)預(yù)測(cè)GnIH前體蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。使用MegAlign軟件對(duì)閩西南黑兔、人(NP_071433.3)、獼猴(ACF58053.1)、黑猩猩(PNI40345.1)、馬(XP_001498898.1)、虎鯨(XP_004265697.1)、熊貓(XP_002912906.2)、樹(shù)鼩(XP_006162460.1)、灰海豹(XP_035953085.1)、九帶犰狳(XP_004447617.1)、北極熊(XP_008684635.1)、犬(NP_001279989.1)、綿羊(NP_001120740.1)、大鼠(NP_076442.1)、雞(BAC87781.1)、豬(ADM12803)、日本鵪鶉(BAB15932.1)以及斑馬魚(yú)(NP_001076418.1)的GnIH前體蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，應(yīng)用MEGA-X軟件中的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建GnIH前體蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并基于Ubuka和Parhar(2017)[29]報(bào)道現(xiàn)有脊椎動(dòng)物的GnIH前體蛋白分解產(chǎn)生的RF-酰胺相關(guān)肽(RFamide-related peptide，RFRPs)和GnIH序列，預(yù)測(cè)閩西南黑兔相關(guān)RFRPs序列。

1.6 GnIH在公兔不同組織的表達(dá)譜

根據(jù)克隆獲得的GnIH基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)，使用qPCR方法檢測(cè)GnIH基因在90日齡健康公兔的不同組織(心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、睪丸、下丘腦、垂體、背肌、脂肪)以及不同日齡(11、30、60、90、120、150日齡)健康公兔下丘腦組織中的表達(dá)水平。以兔GAPDH基因(NM_001082253.1)為內(nèi)參基因，引物表見(jiàn)表1。qPCR擴(kuò)增體系：模板cDNA 1 μL，Power SYBR?Green PCR Master Mix(ABI，美國(guó))10 μL，上、下游引物各0.5 μL，滅菌超純水8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火25 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為55 ～95 ℃，每10 s增加0.5 ℃。每個(gè)樣本重復(fù)3次，各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt法進(jìn)行后續(xù)分析。

1.7 GnIH對(duì)公兔生殖激素分泌的調(diào)控

將采集的耳靜脈血4 ℃ 3 000 r·min-1離心20 min后取其上清，-20 ℃貯存。采用上海紀(jì)寧兔促性腺激素釋放激素(GnRH)試劑盒(ELISA)、兔促卵泡素(FSH)試劑盒(ELISA)、兔黃體生成素(LH)試劑盒(ELISA)、兔睪酮(T)試劑盒(ELISA)和兔抑制素B(INHB)試劑盒(ELISA)檢測(cè)血清中GnRH、FSH、LH、睪酮(testosterone，T)和抑制素B亞基(inhibin β subunit，INHB)的含量。

1.8 GnIH多肽對(duì)睪酮合成相關(guān)酶基因mRNA表達(dá)的影響

檢測(cè)兔StAR、p450scc和3β-HSD基因在睪丸中的mRNA表達(dá)量。根據(jù)NCBI提供的兔StAR(XM_017350352.1)、p450scc(XM_008253734.2)和3β-HSD(XM_002715682.3)基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)，并以兔GAPDH基因(NM_001082253.1)為內(nèi)參基因，引物表見(jiàn)表1。qPCR擴(kuò)增體系：模板cDNA 1 μL，Power SYBR?Green PCR Master Mix(ABI，美國(guó))10 μL，上、下游引物各0.5 μL，滅菌超純水8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，63 ℃退火25 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為55 ℃～95 ℃，每10 s增加0.5 ℃。每個(gè)樣本重復(fù)3次，各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt法進(jìn)行后續(xù)分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

用SAS 9.4軟件GLM模型分析qPCR和激素檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P<0.05表示差異顯著，以P<0.01和P<0.001表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 兔GnIH cDNA全長(zhǎng)序列克隆

克隆獲得的cDNA序列片段經(jīng)DNAMAN拼接后，得到兔GnIHcDNA全長(zhǎng)序列為904 bp，其中5′UTR、cDNA和3′UTR分別為41、606和227 bp，還有一個(gè)poly(A)尾巴；編碼201個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA。序列已提交到GenBank，登錄號(hào)為MK403675.1。

2.2 兔GnIH前體蛋白氨基酸序列理化性質(zhì)分析

兔GnIH前體蛋白的理化性質(zhì)和親-疏水性分析結(jié)果顯示，蛋白分子式為C995H1 592N294O305S11，分子量為22.9 ku，共編碼201個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為9.1。帶正電荷殘基總數(shù)(精氨酸+賴(lài)氨酸，Arg+Lys)為29個(gè)，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(天冬氨酸+谷氨酸，Asp+Glu)為24個(gè)。在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞體外半衰期為30 h。不穩(wěn)定系數(shù)為74.85，親水性平均系數(shù)為-0.838，脂肪系數(shù)為61.89。

2.3 GnIH前體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，GnIH前體蛋白只含有α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲2種二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1)。預(yù)測(cè)GnIH前體蛋白潛在的Sec信號(hào)肽(Sec/SPI)概率分值為0.686 2，裂解位點(diǎn)在第26位半胱氨酸和27位天冬氨酸之間，概率分值在0.400 5，此位置恰好在α螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲連接處(圖2)。

A.二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B.三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A. Secondary structure prediction; B. Tertiary structure prediction圖1 兔GnIH前體蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structure analysis of rabbit GnIH precursor

圖2 兔GnIH前體蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted signal peptide of rabbit GnIH precursor

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和一致性分析

在進(jìn)化上，兔GnIH前體蛋白與嚙齒目大鼠的關(guān)系最近，與雞、日本鵪鶉以及九帶犰狳和斑馬魚(yú)關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。與大鼠、人、獼猴、馬以及鵪鶉和雞等動(dòng)物GnIH前體蛋白中RFRPs和GnIH短肽氨基酸序列比較，發(fā)現(xiàn)兔GnIH前體蛋白中可能存在RFRP1(RFamide-related peptide 1，RF氨基相關(guān)肽1)、RFRP2(RFamide-related peptide 2，RF氨基相關(guān)肽2)和RFRP3(RFamide-related peptide 3，RF氨基相關(guān)肽3)3種GnIH同源類(lèi)似物，其氨基酸序列分別為MPHAAATLPLRF、SPQPVANLPLRF和IPNLPQRF(圖4)。

方框表示已知的RFRPs和GnIHs氨基酸序列；虛線表示預(yù)測(cè)閩西南黑兔RFRPs氨基酸序列The identified amino-acid sequences of RFRPs and GnIHs are boxed in solid lines；The predicted amino-acid sequences of RFRPs from Minxinan black rabbits are boxed in dashed lines圖4 兔GnIH前體蛋白的RFRPs氨基酸序列預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of amino-acid sequences of rabbit RFRPs in GnIH precursor

圖3 GnIH前體蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of GnIH precursor

2.5 GnIH基因在公兔不同組織中的表達(dá)分析

使用qPCR法檢測(cè)GnIH基因在90日齡公兔不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5A所示，GnIH在下丘腦、脾、腎、垂體、背肌、肝、肺和小腸中均有表達(dá)，其中，下丘腦中的相對(duì)表達(dá)量最高，并且極其顯著高于其他組織(P<0.001)，表示GnIH基因可能在下丘腦中發(fā)揮重要的生理作用。

*.表示差異顯著(P<0.05)，**、***.表示差異極顯著(P<0.01,P<0.001)，下同。A. GnIH基因在不同組織中的表達(dá)；B. GnIH基因在出生后不同發(fā)育階段下丘腦中的表達(dá)*. indicate significant differences (P<0.05), **, ***. indicate extremely significant differences (P<0.01, P<0.001), the same as below. A. Expression pattern of GnIH gene in different tissues; B. Expression pattern of GnIH gene at different developmental phases of hypothalamus圖5 GnIH基因在公兔不同組織和不同發(fā)育階段下丘腦中表達(dá)Fig.5 Expression patterns of GnIH gene in different tissues and hypothalamus at different developmental phases from male rabbits

2.6 GnIH基因在公兔出生后下丘腦中的表達(dá)

使用qPCR法檢測(cè)GnIH基因在不同日齡公兔下丘腦中的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖5B，出生后GnIH基因的表達(dá)量隨著日齡增長(zhǎng)而降低，在90日齡GnIH的表達(dá)量降至最低(P<0.01)，隨后出現(xiàn)拐點(diǎn)，表達(dá)量隨著日齡增長(zhǎng)極顯著增加(P<0.001)。

2.7 GnIH多肽對(duì)公兔體內(nèi)生殖激素分泌的影響

通過(guò)檢測(cè)血清中生殖激素的濃度發(fā)現(xiàn)，GnRH濃度各劑量組間差異不顯著(P>0.05，圖6A)；FSH濃度，5和50 μg劑量組均高于0.5 μg劑量組(P<0.05)，其中50 μg劑量組和0.5 μg劑量組差異極顯著(P<0.01，圖6B)；LH濃度，50 μg劑量組顯著高于對(duì)照組(P<0.05，圖6C)；INHB濃度，各劑量組間差異不顯著(P>0.05，圖6D)；T濃度，50 μg劑量組極顯著低于對(duì)照組和0.5 μg劑量組(P<0.001)，5 μg劑量組顯著低于對(duì)照組和0.5 μg劑量組(P<0.05，圖6E)。

A.GnIH對(duì)GnRH濃度的影響；B.GnIH對(duì)FSH濃度的影響；C.GnIH對(duì)LH濃度的影響；D.GnIH對(duì)INHB濃度的影響；E.GnIH對(duì)T的影響A. Effect of GnIH on the concentration of GnRH; B. Effect of GnIH on the concentration of FSH; C. Effect of GnIH on the concentration of LH; D. Effect of GnIH on the concentration of INHB; E. Effect of GnIH on the concentration of T圖6 不同注射劑量GnIH相關(guān)肽對(duì)生殖激素濃度的影響Fig.6 Effects of different injected doses of GnIH related peptide on the concentrations of reproductive hormones

2.8 GnIH相關(guān)肽對(duì)睪丸組織睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)量的影響

經(jīng)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，5 μg劑量組的p450scc mRNA表達(dá)量極其顯著高于其他劑量組(P<0.001)，而注射GnIH相關(guān)肽并未引起StarR和3β-HSD這兩個(gè)基因mRNA表達(dá)量發(fā)生顯著變化(P>0.05，圖7)。

A.GnIH對(duì)StAR 基因mRNA表達(dá)量的影響；B.GnIH對(duì)3β-HSD基因mRNA表達(dá)量的影響；C.GnIH對(duì)p450scc基因mRNA表達(dá)量的影響A. Effect of GnIH on the relative StAR mRNA levels; B. Effect of GnIH on the relative 3β-HSD mRNA levels; C. Effect of GnIH on the relative p450scc mRNA levels圖7 不同注射劑量GnIH對(duì)睪酮合成相關(guān)酶基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of different injected doses of GnIH on the relative mRNA levels of testosterone synthetic enzyme genes

3 討 論

劉晶[28]通過(guò)RT-PCR方法克隆得到了新西蘭兔GnIH基因389 bp的 cDNA序列，且核苷酸序列與綿羊、牛、獼猴、人、豬、小鼠有較高的同源性(>75%)，可見(jiàn)GnIH基因在不同物種間具有一定的保守性，然而，該報(bào)道僅僅上傳了GnIH基因部分cDNA序列，影響了后續(xù)驗(yàn)證。本研究以閩西南黑兔為試驗(yàn)材料，利用RACE技術(shù)克隆得到了兔GnIH基因的cDNA全長(zhǎng)(904 bp)，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，一部分序列與前人上傳的序列完全一致，這填補(bǔ)了兔GnIH基因cDNA不完整的缺陷，從而為后續(xù)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。GnIH前體蛋白有較高的同源性，本研究根據(jù)已知的人、獼猴、大鼠、馬以及鳥(niǎo)類(lèi)GnIH相關(guān)肽及RFRPs序列[29]，預(yù)測(cè)兔GnIH前體上可能存在3種同源蛋白，分別為RFRP1、RFRP2和RFRP3。

本研究通過(guò)qPCR檢測(cè)了GnIH基因在閩西南黑兔公兔不同組織中的表達(dá)，組織表達(dá)譜分析顯示，該基因在下丘腦、脾、腎、垂體、背肌、肝、肺和小腸中均有表達(dá)，在下丘腦中表達(dá)最高，與鳥(niǎo)類(lèi)、豬及小鼠[7, 9, 12, 30-31]中的研究結(jié)果相類(lèi)似。鵪鶉、家雀等鳥(niǎo)類(lèi)免疫組化和原位雜交結(jié)果顯示，GnIH神經(jīng)元主要分布于下丘腦室旁核[28, 31-32]，小嚙齒類(lèi)動(dòng)物下丘腦也是GnIH陽(yáng)性細(xì)胞高度分布區(qū)域[4-5, 11, 16, 31, 33-37]，此外，綿羊的室旁核和恒河猴的視上核、室旁核和弓狀核以及下丘腦背側(cè)區(qū)均發(fā)現(xiàn)GnIH陽(yáng)性纖維[13, 15]。本試驗(yàn)檢測(cè)到GnIH基因在閩西南黑兔公兔下丘腦中表達(dá)水平呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，表達(dá)量隨著出生后日齡的增加逐漸降低，直至90日齡后才逐漸升高。根據(jù)《福建省地方畜禽品種資源志》上的記載，閩西南黑兔公兔在3月齡有性行為表現(xiàn)，通常3.5～4.5月齡達(dá)到性成熟[1]。豬和倉(cāng)鼠GnIH表達(dá)量與發(fā)育狀態(tài)顯著相關(guān)[38-39]，小丑魚(yú)成熟期下丘腦GnIHmRNA表達(dá)量遠(yuǎn)高于發(fā)育期[40]。因此，GnIH的表達(dá)量可能與閩西南黑兔公兔生殖發(fā)育有一定的相關(guān)性。

GnIH對(duì)HPG軸抑制或刺激作用取決于動(dòng)物生殖發(fā)育階段和內(nèi)源性膽固醇激素水平[3]。在小鼠電生理研究中，GnIH對(duì)41%的成年小鼠GnRH神經(jīng)元放電有抑制作用以及對(duì)12%的GnRH神經(jīng)元放電有刺激效果，其中，對(duì)發(fā)情前期18%小鼠GnRH神經(jīng)元有刺激作用，但是對(duì)發(fā)情期的GnRH小鼠神經(jīng)元沒(méi)有刺激作用[41]。GnRH神經(jīng)元和GTH細(xì)胞上的GnRH和GnIH受體及雌激素膜受體(membrane estrogen receptor,mER)均屬于A類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體(class A GCPRs，G-protein coupled receptor)，它們除了在細(xì)胞膜上以單體或者同源二聚體的形式存在，還能與其他GPCR組成異聚體，但是會(huì)導(dǎo)致與配體結(jié)合的親和力、信號(hào)傳導(dǎo)及受體內(nèi)化發(fā)生改變[3, 42-43]。研究表明，發(fā)育前的閹割母鼠經(jīng)過(guò)E2處理后，注射GnIH引起血液中LH濃度的降低；而給未經(jīng)E2處理的閹割母鼠注射GnIH，血液中LH濃度則未發(fā)生變化[44]。此外，據(jù)Iqbal等[45]報(bào)道，低濃度E2能阻止GnRH誘導(dǎo)的綿羊垂體細(xì)胞內(nèi)自由Ca2+濃度上升及LH的釋放，Rudolf和Kadokawa[46]在牛腺垂體促性腺細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象。長(zhǎng)期注射GnRH或其拮抗劑會(huì)使金錢(qián)魚(yú)和鯧參魚(yú)垂體GTH細(xì)胞產(chǎn)生耐受性，下調(diào)GnRH受體，抑制血清中LH、FSH和類(lèi)固醇激素的水平[47-48]。在魚(yú)類(lèi)中，GnIH對(duì)垂體的刺激作用可能與給藥時(shí)間、濃度或不同種類(lèi)LPXRFa多肽的拮抗作用有關(guān)[49]。長(zhǎng)期注射GnIH的短日照西伯利亞倉(cāng)鼠公鼠的睪丸重量和血清中的睪酮濃度會(huì)逐漸恢復(fù)到正常值，可能也是因?yàn)橄虑鹉X和垂體中GnIH受體下調(diào)引起的[50]。本試驗(yàn)通過(guò)給發(fā)情前期公兔注射GnIH相關(guān)肽后發(fā)現(xiàn)，5和50 μg劑量組血清中T濃度顯著低于對(duì)照組和0.5 μg劑量組(P<0.05)，可能是GnIH在E2的配合下短時(shí)間內(nèi)對(duì)GnRH神經(jīng)元和GTH細(xì)胞負(fù)調(diào)控導(dǎo)致的。連續(xù)10 d給藥后，外周血中的50 μg劑量組LH濃度和5 μg劑量組睪酮合成限速酶p450scc基因的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，可能由于長(zhǎng)期注射GnIH會(huì)下調(diào)GnRH神經(jīng)元和GTH細(xì)胞上的GnIH受體數(shù)量，導(dǎo)致GnRH神經(jīng)元和GTH細(xì)胞對(duì)GnIH不敏感。此外，外周血中T濃度顯著降低后，腦部芳香化酶神經(jīng)元合成的E2減少，導(dǎo)致GnIH抑制效果顯著減弱。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到兔GnIH基因cDNA序列，全長(zhǎng)904 bp，編碼201個(gè)氨基酸，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守性。GnIH基因在大部分組織均有表達(dá)，其中在下丘腦中表達(dá)最高，出生后隨著日齡增加逐漸減少，90日齡后則逐漸增加。在鵪鶉GnIH相關(guān)肽注射幼齡公兔后，短時(shí)間促使外周血中T濃度顯著下降，同時(shí)由于長(zhǎng)期注射藥物，公兔對(duì)GnIH不敏感，血液中的LH濃度和睪丸中睪酮合成相關(guān)酶基因p450scc的mRNA表達(dá)量顯著上升，基于以上結(jié)果推測(cè)，GnIH基因可能與兔LH和睪酮的分泌與合成有關(guān)，并參與公兔的生殖發(fā)育調(diào)控，長(zhǎng)期注射GnIH相關(guān)肽會(huì)導(dǎo)致公兔對(duì)藥物不敏感，其具體調(diào)控機(jī)制還需后續(xù)研究。