牦牛FHL2基因的克隆、組織表達(dá)與蛋白定位分析

龔三你，蔣旭東，馬 瑤，盧建遠(yuǎn)，字向東

(西南民族大學(xué) 動物科學(xué)國家民委重點試驗室，成都 610041)

四個半LIM結(jié)構(gòu)域蛋白(four and a half LIM domains protein, FHL)家族包含5個成員：FHL1、FHL2、FHL3、FHL4和ACT[1]，它們均含有4個半 LIM結(jié)構(gòu)域，不同的結(jié)構(gòu)域間有24%～39%的氨基酸序列相似性，但組織表達(dá)有特異性[2-3]。FHL2是其家族研究最廣泛的基因，它除了在心上高表達(dá)外，在很多組織中都有表達(dá)[3]。FHL2由279個氨基酸殘基組成，是一種完全由 LIM 結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)[2]，因為其完全單一的LIM 結(jié)構(gòu)域特性，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其參與90多種不同的蛋白相互作用過程，這些蛋白參與不同的信號通路從而參與多種生理功能的調(diào)控[4]。FHL2有很多的生物學(xué)功能，參與細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)化過程[5-6]。小鼠缺失FHL2會導(dǎo)致皮膚、腸、血管、心或缺血性肌肉組織的傷口愈合受損[7-11]；FHL2的表達(dá)水平與多種腫瘤、肝癌和肺癌有密切的聯(lián)系[12]；非小細(xì)胞肺癌中FHL2的高水平表達(dá)會增加腫瘤的體積和重量[13]；FHL2在骨肉瘤細(xì)胞中充當(dāng)癌基因，并通過 Wnt 信號傳導(dǎo)促進(jìn)腫瘤發(fā)生[14]。還有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2對哺乳動物繁殖有重要影響，有研究者敲除小鼠的FHL2基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除型雌鼠卵巢發(fā)育滯后，閉鎖卵泡數(shù)顯著增加，且敲除型雌鼠的5個月總產(chǎn)仔數(shù)顯著低于野生型雌鼠，降低了約43%，窩產(chǎn)仔數(shù)約降低22%[15]。在綿羊上的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2在卵巢中高表達(dá)，定位于卵巢顆粒細(xì)胞，影響顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、周期和類固醇激素(雌二醇和孕酮)的分泌及相關(guān)基因的表達(dá)，可能在綿羊繁殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[16]。

牦牛(Bosgrunniens)是分布于我國海拔2 500～5 500 m青藏高原及其毗鄰國家和地區(qū)的重要畜種，在這樣高海拔低氧條件下很少有其它畜種能夠生產(chǎn)生活。牦牛具有密而長的被毛、汗腺導(dǎo)管少、小腸發(fā)達(dá)、胸腔大(比普通牛多1～2對肋骨)、毛細(xì)血管網(wǎng)發(fā)達(dá)和肺泡數(shù)量多等特征，可以適應(yīng)寒冷、低氧等惡劣的高原環(huán)境條件[17]，是青藏高原畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可替代的重要畜種，對青藏高原經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展具有重要的意義，但其繁殖率低，產(chǎn)肉、乳性能低[18]。在其它物種的研究表明，F(xiàn)HL2具有廣泛的生物功能，其與動物的心功能和繁殖能力也密切相關(guān)[11-13,15-16]，但目前未見有關(guān)牦牛FHL2基因的研究報道。

本研究擬采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)克隆牦牛FHL2基因的CDS區(qū)，并利用生物信息學(xué)分析和預(yù)測所編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能，利用實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)、免疫組化(immunohistochemistry, IHC) 和免疫熒光(immunofluorescence, IF)技術(shù)檢測FHL2基因在不同組織的表達(dá)特性和雌性生殖器官中的定位以及在顆粒細(xì)胞的亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步探討FHL2基因在牦牛低氧生態(tài)適應(yīng)和繁殖活動中的調(diào)控作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 在四川省成都市青白江唐家寺屠宰場選擇無臨床病理表現(xiàn)的成年母牦牛，根據(jù)屠宰后子宮內(nèi)有無胎兒判斷妊娠與否?？諔眩鹤訉m內(nèi)無胎兒；妊娠2個月左右：子宮內(nèi)有頭頸、軀干及四肢可以清楚辨識的胎兒[19]。采集5頭空懷母牦牛的心、肝、脾、肺、腎、卵巢、子宮、輸卵管組織和5頭妊娠2個月左右的牦牛子宮、輸卵管和卵巢組織。采集的組織用生理鹽水沖洗干凈，迅速放入液氮罐中，帶回試驗室-80 ℃保存，用于PCR和RT-qPCR檢測。顆粒細(xì)胞由實驗室前期冷凍保存。同時采集牦牛卵巢、子宮、輸卵管組織樣，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，待固定完成后用于免疫組化試驗。

1.1.2 主要試劑 RTIzol Reagent和瓊脂糖(美國Invitrogen)， cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker(GenStAR)，PowerUp SYBR Green預(yù)混液(美國Thermo Scientific)，膠回收試劑盒(成都擎科梓熙生物)，F(xiàn)HL2抗體(DF13015, Affinity Biosciences)，RBITC二抗(上海生工生物)。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像系統(tǒng)(美國Invitrogen)，PCR儀(ETC811，蘇州東盛興業(yè))，熒光定量PCR儀(CFX96, 美國Bio Rad)，激光共聚焦顯微鏡(LSM880, 德國ZISS)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA合成 根據(jù)RTIzol RNA提取試劑盒的說明書提取RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA(OD260 nm/OD280 nm)的濃度和純度，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計及合成 由于未見牦牛FHL2基因序列報道，所以根據(jù)NCBI中普通牛(Bostaurus)的FHL2基因序列(NM_001046046.2)，使用PrimerPrimer 5.0軟件設(shè)計克隆引物；再根據(jù)克隆獲得的序列設(shè)計FHL2基因的熒光定量PCR引物(表1)，熒光定量內(nèi)參基因DAPDH引物參照劉宇等[20]設(shè)計的引物。引物由成都擎科生物公司合成。

表1 基因克隆與定量PCR引物Table 1 Primer pairs for gene cloning and RT-qPCR

1.2.3 牦牛FHL2基因克隆與測序 以牦牛卵巢合成的cDNA為模板，根據(jù)劉宇等[20]的方法克隆FHL2基因，但是本研究采用的退火溫度為54 ℃，循環(huán)數(shù)為30個，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 牦牛FHL2基因生物信息學(xué)分析 使用ORF Finder、BLAST、ExPASy ProtParam、Signal P 5.0、PSIPRED、SWISS-MODEL、TMHMM、NetPhos3.1 Server、STRING和MEGA11.0等在線生物信息學(xué)軟件[20]分析牦牛FHL2基因及其編碼蛋白質(zhì)特性。

1.2.5 牦牛FHL2基因的RT-qPCR 采用RT-qPCR技術(shù)測定FHL2基因在母牦牛各組織中的mRNA表達(dá)水平。PCR體系為15 μL：cDNA 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，PowerUp SYBR Green預(yù)混液 7.5 μL，ddH2O 4.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，40個循環(huán)；讀取熔解曲線。

1.2.6 免疫組化分析 參照鄔建飛等[21]的免疫組化方法進(jìn)行牦牛卵巢、輸卵管和子宮組織的FHL2蛋白定位分析，最后采用共聚焦顯微鏡采集圖片。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光染色 培養(yǎng)48 h的牦牛原代顆粒細(xì)胞(融合率為80%)，取出細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定細(xì)胞， PBS輕洗3次，每次5 min；然后用0.5% TritonX-100透化處理細(xì)胞20 min；隨后以5% BSA封閉30 min；在爬片上滴加一抗(1∶250稀釋)，4 ℃過夜孵育；二抗(1∶1 000稀釋)避光孵育2 h；最后用DAPI (1∶1 000 PBS稀釋)染核，室溫避光15 min；清洗后封片，共聚焦顯微鏡采集熒光圖片。

1.2.8 統(tǒng)計分析 每個樣品重復(fù)檢測3次，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算FHL2基因的相對表達(dá)量。使用SPSS26.0軟件對空懷母牦牛不同組織中FHL2基因表達(dá)量進(jìn)行單因子方差分析。采用t檢驗對空懷期與妊娠期的基因表達(dá)差異進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛FHL2基因克隆

以牦牛卵巢cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得的產(chǎn)物片段與目的基因大小相符(圖1)，表明成功擴(kuò)增了牦牛FHL2基因。測序表明，F(xiàn)HL2基因全長1 041 bp，其中CDS區(qū)長840 bp，共編碼279個氨基酸。NCBI的基因序列登錄號為ON456866。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2. FHL2引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL2000 DNA marker;1-2. PCR amplification products of FHL2 primer圖1 牦牛FHL2基因PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of yak FHL2 PCR products

2.2 牦牛與黃牛FHL2基因的核苷酸序列比較

使用DNAMAN6.0軟件將所擴(kuò)增FHL2基因的CDS區(qū)與黃牛FHL2基因的CDS區(qū)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了2個堿基突變，其中第98位點堿基差異(G>C)導(dǎo)致了氨基酸的改變(E>D)，但第641位點堿基差異(C>T)沒有導(dǎo)致氨基酸的改變。牦牛與黃牛FHL2基因的CDS區(qū)同源性為99.76%。

2.3 FHL2基因編碼氨基酸序列的同源性

使用DNAMAN6.0軟件分析不同物種FHL2基因編碼氨基酸序列的同源性，結(jié)果顯示，牦牛與黃牛(NP_001039511.1)、綿羊(XP_004006164.1)、豬(XP_013851352.2)、馬(XP_005599839.1)、人(NP_001305824.1)、鼠(NP_034342.1)和倭蛙(XP_018418626.1)的氨基酸序列相似性分別為99.64%、98.57%、94.27%、93.55%、90.32%、88.17%和79.57%，說明FHL2基因在進(jìn)化過程中的保守性較高(圖2)。

2.4 牦牛FHL2蛋白的理化性質(zhì)

使用ExPASY-ProtParam在線工具分析牦牛FHL2蛋白，發(fā)現(xiàn)FHL2蛋白的分子式為C1386H2118N390O414S38，分子質(zhì)量為32 086.71，F(xiàn)HL2蛋白是弱堿性蛋白，理論等電點為7.59；FHL2蛋白的氨基酸組成中半胱氨酸(Cys)、賴氨酸(Lys)和谷氨酸(Glu)的所占比例較高，分別為12.5%、7.9%和7.2%；FHL2蛋白屬于親水不穩(wěn)定蛋白，其脂肪族指數(shù)為50.36；平均親水性為-0.509，不穩(wěn)定指數(shù)為50.99。FHL2蛋白帶正電荷，其帶負(fù)電荷(Asp+Glu)和帶正電荷(Arg+Lys)的氨基酸殘基總數(shù)分別為37和39個。根據(jù)TMHMM 2.0在線工具分析，F(xiàn)HL2蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)；使用Signal P 5.0預(yù)測，F(xiàn)HL2蛋白不存在信號肽。使用NetPhos3.1在線工具分析顯示FHL2蛋白有33個磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位點分別有16、10和7個。

2.5 FHL2蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SOPMA在線工具預(yù)測FHL2蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角占比分別為55.91%、20.07%、19.35%和 4.66% (圖3)。使用SWISS-MODEL在線工具預(yù)測的FHL2蛋白三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致(圖4)。

c. 無規(guī)則卷曲；h. α-螺旋；t. β-轉(zhuǎn)角；e. 延伸鏈c. Random coil; h. α-helix; t. β-turn; e. Extension chain圖3 牦牛FHL2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 The predicted secondary structure of yak FHL2 protein

圖4 牦牛FHL2蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 The predicted tertiary structure of yak FHL2 protein

2.6 蛋白相互作用分析

使用STRING11.0在線工具對牦牛FHL2蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)HL2蛋白與雌激素受體基因1(ESR1)、雄激素受體(AR)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(FOXO1)、乳腺癌易感基因1(BRCA1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)、S100鈣結(jié)合蛋白A10(S100A10)和小窩相關(guān)蛋白1(CAVIN1)等蛋白互作緊密 (圖5)。

圖5 FHL2蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析圖Fig.5 FHL2 protein interaction networks

2.7 牦牛FHL2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從NCBI下載黃牛(NM_001046046.2)、綿羊(XM_004006115.4)、山羊(XM_018054971.1)、小鼠(NM_001289533.1)、大鼠(NM_031677.1)、兔(XM002709708.3)、馬(XM_005599782.3)、鯽魚(XM_027743867.2)、原雞(XM_040657379.1)、線蟲(XM_034758044.1)和豬(XM_013995898.2)11個物種的FHL2基因序列，利用Mega11.0構(gòu)建基因進(jìn)化樹。結(jié)果表明，牦牛與黃牛的親緣關(guān)系最近，其次是與山羊和綿羊，與原雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，說明該基因在動物進(jìn)化過程中比較保守(圖6)。

圖6 用NJ法構(gòu)建的FHL2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of FHL2 gene constructed by NJ method

2.8 牦牛FHL2基因表達(dá)差異分析

2.8.1FHL2基因組織表達(dá)分析 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)HL2基因在牦牛心、肝、脾、肺、腎、卵巢、子宮和輸卵管中均有表達(dá)(圖7)，其在心中的表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)；肺、卵巢、輸卵管和子宮中的表達(dá)量極顯著高于肝、脾和腎(P<0.01)。

柱上大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同Columns with different capital letters denote difference at P<0.01, with different lowercase letters denote difference at P<0.05. The same as below圖7 空懷母牦牛不同組織中FHL2基因的相對表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of FHL2 gene in different tissues of non-pregnant female yak

2.8.2 空懷期與妊娠期牦牛生殖器官中FHL2基因的表達(dá)分析 以空懷期生殖器官的表達(dá)量為參照，檢測FHL2基因mRNA在牦?？諔哑谂c妊娠期卵巢、子宮和輸卵管組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FHL2基因在空懷期卵巢中的表達(dá)量極顯著高于妊娠期(P<0.01)(圖8A)，妊娠期子宮中的表達(dá)量極顯著高于空懷期(P<0.01)(圖8B)，空懷期和妊娠期輸卵管中的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)(圖8C)。

A.卵巢；B.子宮；C.輸卵管A. Ovary; B. Uterus; C. Oviduct圖8 牦牛生殖器官中FHL2基因的相對表達(dá)水平Fig.8 Relative expression level of FHL2 gene in reproductive organs of yaks

2.9 母牦牛FHL2蛋白在生殖器官及顆粒細(xì)胞的定位

IF結(jié)果顯示，F(xiàn)HL2蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)(圖9)，且主要存在于細(xì)胞核并從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)彌散。IHC結(jié)果顯示，F(xiàn)HL2蛋白在牦牛的卵巢、輸卵管、子宮均有分布。在卵巢中主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞，在輸卵管上主要表達(dá)于黏膜上皮細(xì)胞，在子宮中主要表達(dá)部位為子宮腺和子宮內(nèi)膜細(xì)胞(圖10)。

圖9 FHL2 在牦牛卵巢顆粒細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.9 The subcellular localization of FHL2 in yak ovarian granulosa cells

3 討 論

FHL2蛋白是4個半LIM結(jié)構(gòu)域蛋白家族中的一個成員，它不直接調(diào)節(jié)基因表達(dá), 而是通過與轉(zhuǎn)錄因子及其上游共調(diào)節(jié)因子相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[2]。通過與其靶蛋白結(jié)合，F(xiàn)HL2蛋白調(diào)節(jié)或微調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和隨后的基因調(diào)控，這對各種組織的功能及其病理很重要，特別是在繁殖相關(guān)性狀中具有重要的調(diào)控作用[15-16,22]。為了探究牦牛FHL2基因、蛋白及其表達(dá)特性，本試驗克隆獲得了牦牛FHL2基因完整的CDS區(qū)全長840 bp，編碼279個氨基酸，共有33個磷酸化位點。近期的研究發(fā)現(xiàn)，c-Abl 激酶通過 FHL2 蛋白磷酸化來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[23]。牦牛FHL2蛋白定位在顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上，這與在小鼠和綿羊上的研究結(jié)果一致[22,24]。牦牛FHL2蛋白氨基酸同源性比對和基因進(jìn)化樹結(jié)果顯示，F(xiàn)HL2基因與黃牛的同源性最高，相似度為99.64%，在進(jìn)化樹上牦牛與黃牛最先聚為一類，其次與偶蹄目的綿羊和山羊聚為一類，與禽類的關(guān)系最遠(yuǎn)。Zhang等[24]的研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2基因與有蹄動物的同源性最高，與家禽的同源性較低，與本研究結(jié)果一致，說明FHL2基因在進(jìn)化過程中比較保守。本試驗發(fā)現(xiàn)，牦牛FHL2基因的CDS區(qū)與黃牛的CDS區(qū)相比有兩個堿基發(fā)生突變，且第98位點堿基的改變導(dǎo)致谷氨酸突變?yōu)樘於彼?，這種突變是否影響FHL2蛋白的功能尚待研究。

根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖顯示，F(xiàn)HL2蛋白可能與AR、FOXO1、BRCA1、ESR1、HMCN1、CAVIN1、S100A102和TRAF2等蛋白相互作用。FHL2蛋白是 BRCA1的轉(zhuǎn)錄共激活因子，Rajan等[25]研究闡明，BRCA1可與雌激素受體 (ER) 結(jié)合，抑制雌激素受體(ER-α)的信號傳導(dǎo)，并阻斷ER-α的轉(zhuǎn)錄激活功能。Zhang等[26]的研究表明，BRCA1可與雄激素受體(AR)結(jié)合，并通過激活SIRT1來抑制AR表達(dá)。雄激素通過AR在雌性的生殖系統(tǒng)中起著重要的作用[27]，且FHL2過表達(dá)抑制排卵相關(guān)基因，部分是通過FHL2作為AR的共阻遏物調(diào)節(jié)KGN細(xì)胞中C/EBPβ的表達(dá)實現(xiàn)[28]。FHL2是FOXO1轉(zhuǎn)錄的共抑制子，F(xiàn)OXO1是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡關(guān)鍵性的調(diào)控因子，F(xiàn)OXO1在卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)會誘導(dǎo)下游與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的凋亡與卵泡的閉鎖[29-30]；還有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1與子宮內(nèi)膜蛻膜化、胚胎植入與胚胎發(fā)育都有緊密的聯(lián)系[31]。有研究表明， FHL2通過誘導(dǎo)FOXO1與組蛋白去乙酰酶SIRT1相互作用，使FOXO1蛋白去乙?；?，從而抑制FOXO1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性[29]。蛋白互作結(jié)果表明，F(xiàn)HL2蛋白可通過互作蛋白參與卵巢排卵、顆粒細(xì)胞的增殖、子宮內(nèi)膜蛻膜化、胚胎植入和胚胎發(fā)育的調(diào)控，推測FHL2與雌性動物的繁殖性能有重要聯(lián)系。

RT-qPCR的結(jié)果顯示，F(xiàn)HL2基因在牦牛的各個組織中廣泛表達(dá)，這與在小鼠[15,22]、綿羊[16]、雞[32]和人[33]上的研究結(jié)果一致，說明FHL2基因具有廣泛的生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2基因在心組織的表達(dá)量極高，與前人[16]在綿羊上的研究結(jié)果一致。FHL2基因?qū)Ω鞣N類型的心臟損傷恢復(fù)至關(guān)重要[2,11]。FHL2基因?qū)π呐K肥大相關(guān)的選擇性信號通路起保護(hù)作用，通過抑制MAPK/ERK信號抑制心肌細(xì)胞肥大，是 calcineurin/NFAT 信號的抑制因子[34]。FHL2已被確定為肺癌的重要生物標(biāo)志物，在肺部組織纖維化和肺癌的診斷與治療中有重要作用[13,35]。本試驗結(jié)果顯示，牦牛FHL2基因在肺有顯著表達(dá)，推測FHL2在牦牛心、肺的表達(dá)量高可能與其高原低氧環(huán)境的適應(yīng)性相關(guān)。RT-qPCR結(jié)果顯示，牦牛FHL2基因在卵巢、子宮和輸卵管上高表達(dá)。IHC進(jìn)一步證明，F(xiàn)HL2蛋白主要定位在卵巢有腔卵泡的顆粒細(xì)胞、子宮內(nèi)膜和輸卵管黏膜。有學(xué)者研究表明，敲除FHL2基因可抑制小鼠卵巢生長和卵泡發(fā)育，降低排卵質(zhì)量和繁殖力[15]；FHL2參與調(diào)控綿羊顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期和類固醇激素(雌二醇和孕酮)的分泌及相關(guān)基因的表達(dá)[16]；FHL2提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表皮生長因子受體(EGFR)的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增生[36]?？梢酝茰y，F(xiàn)HL2可能與牦牛卵巢卵泡發(fā)育及輸卵管黏膜和子宮內(nèi)膜增生密切相關(guān)。IF結(jié)果顯示，F(xiàn)HL2在卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，與前人的研究結(jié)果一致[16,22]。本研究還發(fā)現(xiàn)，空懷期母牦牛卵巢FHL2基因表達(dá)量極顯著高于妊娠期(P<0.01)，而妊娠期子宮FHL2基因表達(dá)量極顯著高于空懷期(P<0.01)，進(jìn)一步說明在空懷期FHL2可能促進(jìn)卵巢卵泡生長發(fā)育，而在妊娠期促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生，維持妊娠。

4 結(jié) 論

本試驗克隆得到牦牛FHL2基因CDS區(qū)全長為840 bp，編碼279個氨基酸，物種間具有較高保守性。其在牦牛各組織中廣泛表達(dá)，在心、肺、卵巢、輸卵管和子宮中高表達(dá)。FHL2蛋白主要定位在卵巢的顆粒細(xì)胞、輸卵管的黏膜上皮、子宮內(nèi)膜?？諔哑诼殉仓蠪HL2表達(dá)量顯著高于妊娠期，而妊娠期子宮中的表達(dá)量顯著高于空懷期。說明FHL2可能參與牦牛低氧適應(yīng)性、卵泡生長發(fā)育和妊娠維持等生理功能的調(diào)控。