高效液相色譜法測(cè)定追風(fēng)透骨丸中α-香附酮和香附烯酮的含量

宋 瑩 崔業(yè)波 張大勇 馬曉靜 王路宏

追風(fēng)透骨丸由制川烏、白芷、制草烏、香附（制）等20余味中藥材加工制成，具有祛風(fēng)除濕，通經(jīng)活絡(luò)，散寒止痛的功效，臨床廣泛用于風(fēng)寒濕痹，肢節(jié)疼痛，肢體麻木[1]。其中，香附（制）在處方中具有行氣止痛的重要作用[2]。追風(fēng)透骨丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成分制劑第十八冊(cè)》[3]和《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）》[4]，上述標(biāo)準(zhǔn)僅將香附（制）列入鑒別項(xiàng)，缺乏對(duì)其含量的質(zhì)控指標(biāo)，可見其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并不完善，而本制劑是國(guó)家醫(yī)保目錄甲類藥品，臨床治療必需，且使用廣泛。因此，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面、嚴(yán)格控制，十分必要。本文通過(guò)查閱文獻(xiàn)[5-14]，建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定香附（制）中α-香附酮和香附烯酮的含量，為追風(fēng)透骨丸中香附（制）提供更全面、可靠的質(zhì)量控制依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型安捷倫高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，配二極管陣列檢測(cè)器）；BT125D型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司，感量：0.01/0.1 mg）。

1.2 試藥與樣品

對(duì)照品：α-香附酮對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：99.8%，批號(hào)：110748-202117）、香附烯酮對(duì)照品（Shanghai Standard Technology Co.,Ltd，批號(hào)：ST77690181）。試劑：甲醇（DIKMA，批號(hào)：50102）為色譜純，乙酸乙酯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200610）為分析純，水為超純水（自制）。樣品：追風(fēng)透骨丸購(gòu)于市區(qū)零售藥店，來(lái)源于同一藥品生產(chǎn)企業(yè)，批號(hào)：K10061、K12089、P12099，規(guī)格：每10丸重1 g，質(zhì)量執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：《中華人民共和國(guó)藥典》。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；以甲醇（A）-水（B）（65∶35）為流動(dòng)相；流速為1.0 ml/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量：5 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 mn。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品混合溶液的制備精密稱取α-香附酮20.09 mg，置50 ml棕色容量瓶中，香附烯酮10.56 mg，置20 ml棕色容量瓶中，分別加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，再分別精密量取上述α-香附酮對(duì)照品溶液2 ml、香附烯酮對(duì)照品溶液4 ml，置同一10 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成每毫升含α-香附酮80.36 μg、香附烯酮211.2 μg的混合溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備精密稱取追風(fēng)透骨丸細(xì)粉約20 g，置適宜圓底燒瓶中，加水200 ml，連接揮發(fā)油測(cè)定器，在揮發(fā)油測(cè)定器上端加水使充滿其刻度部分，至有水流入燒瓶時(shí)為止，再加入乙酸乙酯1 ml，連接回流冷凝管，將圓底燒瓶置電熱套中緩慢加熱至沸，并保持微沸約1.5 h，停止加熱，分取乙酸乙酯層，置10 ml棕色容量瓶中，再用少量甲醇沖洗冷凝管，將沖洗液并入上述10 ml棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液[按照處方比例制備缺香附（制）的陰性樣品，按“2.2.2”供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液]各5 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液在與對(duì)照品混合溶液色譜圖相同位置處，出現(xiàn)保留時(shí)間一致的色譜峰，且與相鄰色譜峰分離完全，分離度均大于1.5，符合要求，α-香附酮和香附烯酮理論板數(shù)均不低于8 000。陰性對(duì)照溶液色譜圖中，未出現(xiàn)待測(cè)成分色譜峰，說(shuō)明本方法專屬性良好。見圖1～3。

圖1 α-香附酮和香附烯酮對(duì)照品混合溶液HPLC色譜

圖2 追風(fēng)透骨丸供試品溶液HPLC色譜

圖3 追風(fēng)透骨丸陰性對(duì)照溶液HPLC色譜

2.3.2 線性關(guān)系精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液1、2、5、8、10 μl注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明兩種待測(cè)成分在各自檢測(cè)質(zhì)量范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。見表1。

表1 追風(fēng)透骨丸中α-香附酮和香附烯酮標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn)精密量取同一對(duì)照品混合溶液5 μl，注入液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣分析6次，結(jié)果：α-香附酮、香附烯酮峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.40%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批追風(fēng)透骨丸（批號(hào)：K10061）細(xì)粉約20 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，同法測(cè)定，結(jié)果供試品中每克含香附烯酮0.041 mg，RSD值為1.0%，含α-香附酮0.021 mg，RSD為1.4%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批追風(fēng)透骨丸（批號(hào)：K10061）供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)，精密量取5 μl，注入液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別記錄待測(cè)成分峰面積，其24 h內(nèi)的RSD分別為：0.6%、0.4%（n均等于8），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量（香附烯酮0.041 mg/g、α-香附酮0.021 mg/g）追風(fēng)透骨丸（批號(hào)：K10061）細(xì)粉約10 g，再分別加入濃度為2.074 mg/ml的香附烯酮對(duì)照品溶液0.2 ml和濃度為1.330 mg/ml的α-香附酮對(duì)照品溶液0.2 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，同法測(cè)定，計(jì)算各樣品中香附烯酮和α-香附酮的加樣回收率。見表2。

表2 樣品中香附烯酮和α-香附酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品的含量測(cè)定

分別對(duì)3批追風(fēng)透骨丸中香附烯酮和α-香附酮的含量進(jìn)行測(cè)定。見表3。

表3 追風(fēng)透骨丸中α-香附酮和香附烯酮含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品待測(cè)成分制備方法的選取

本文考慮到追風(fēng)透骨丸為中藥成方制劑，由20余種中藥材原粉直接入藥制成，成分復(fù)雜，采用超聲、加熱回流直接提取的方法，得到的供試品溶液成分較多，色譜峰較難分離，而α-香附酮和香附烯酮均為香附（制）中具有揮發(fā)性的揮發(fā)油成分，故本文采用水蒸氣蒸餾法對(duì)其進(jìn)行提取，既符合待測(cè)成分本身的理化性質(zhì)，同時(shí)又起到純化待測(cè)成分的作用，結(jié)果表明該提取方法得到的供試品液相色譜圖，雜質(zhì)峰較少，待測(cè)成分色譜峰宜與相鄰色譜峰分離，且分離度滿足要求。

3.2 不同色譜柱的考察

本文分別采用美國(guó)安捷倫科技有限公司Agilent TC-C18、ZORBAX SB-C18和北京迪馬科技有限公司Dimaonsil C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm），對(duì)建立的檢測(cè)方法中色譜柱選用進(jìn)行考察，結(jié)果用以上3種色譜柱得到的色譜圖中，待測(cè)成分色譜峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，且理論塔板數(shù)均能達(dá)到8 000以上，符合要求，表明以上色譜柱均可用于該方法的檢測(cè)，本文選用以上3種色譜柱中較為常用的ZORBAX SB-C18柱進(jìn)行試驗(yàn)。