乙酰唑胺對圓錐角膜成纖維細(xì)胞膠原代謝的影響

謝云鵬，雷旭琴，宋 婕，李曉娜，賀 瑞，楊繼忠，馮鵬飛

(1.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原 030024；2.山西省眼科醫(yī)院a.準(zhǔn)分子激光室，b.角膜病科，太原 030002)

圓錐角膜是以角膜中央變薄、向前突出成圓錐形為特征的一種角膜疾病，患病率在0.030～4.790‰之間[1]。圓錐角膜的病因尚不明確，角膜基質(zhì)變薄、結(jié)構(gòu)改變是造成角膜向外擴(kuò)張的主要原因。角膜基質(zhì)占角膜厚度的90%以上，主要由膠原蛋白組成[2]，為角膜維持正常的屈光特性提供力學(xué)支持。病理狀態(tài)下，膠原合成和降解的穩(wěn)態(tài)失衡，膠原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致基質(zhì)層變薄，角膜力學(xué)性能下降，抵抗變形能力降低，在眼內(nèi)壓及外界刺激下角膜擴(kuò)張形成圓錐角膜[3]。膠原代謝異常是圓錐角膜發(fā)生的原因之一，膠原代謝相關(guān)的基因COLs、MMPs是圓錐角膜的易感基因[4]。已有研究[5-7]表明，圓錐角膜中膠原合成基因COLs、交聯(lián)基因LOXs的表達(dá)降低，MMPs等降解基因表達(dá)升高，膠原含量減少。改善膠原的合成及交聯(lián)程度對減緩圓錐角膜進(jìn)程具有重要的意義。

圓錐角膜的治療方法主要有角膜移植、角膜交聯(lián)、佩戴接觸鏡等，臨床上根據(jù)角膜厚度等參數(shù)和圓錐角膜進(jìn)程選擇合適的治療手段。晚期圓錐角膜患者需進(jìn)行角膜移植術(shù)，早中期圓錐角膜可通過佩戴角膜接觸鏡進(jìn)行治療，但受散光、屈光參差或高度近視、屈光不正等因素的限制[8]。角膜交聯(lián)是目前治療早期圓錐角膜的主要手段，通過膠原交聯(lián)提高角膜的力學(xué)性能可以顯著延緩圓錐角膜的進(jìn)程，但交聯(lián)方案在提高氧利用率及核黃素的通透性方面仍待進(jìn)一步改進(jìn)，新型交聯(lián)劑的開發(fā)應(yīng)用也是目前角膜交聯(lián)研究的主要課題[9]。藥物治療圓錐角膜鮮有報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素能夠降低兔圓錐角膜模型中角膜曲率，增加角膜中央厚度，防止圓錐角膜的進(jìn)展[10]，為圓錐角膜的治療提供了新思路。

乙酰唑胺是一種結(jié)晶磺胺類藥物，可用于青光眼、高原反應(yīng)、水腫等疾病的治療[11-13]，在眼組織中，可通過抑制碳酸酐酶活性，減少房水生成從而降低眼壓[12]。乙酰唑胺對眼組織的作用主要集中在對眼壓的調(diào)節(jié)，對眼部其他疾病的作用尚不明確。對關(guān)節(jié)炎大鼠研究發(fā)現(xiàn)，乙酰唑胺藥物治療后，軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白基因表達(dá)及蛋白多糖的含量升高[14]。橫向主動(dòng)脈縮窄小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，乙酰唑胺可以降低心臟組織中Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)[15]。上述研究推測，乙酰唑胺能夠調(diào)節(jié)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分的代謝。鑒于此，本研究采用乙酰唑胺溶液處理人圓錐角膜成纖維細(xì)胞，分析處理后角膜細(xì)胞中膠原代謝基因表達(dá)及膠原含量的變化，探究乙酰唑胺調(diào)節(jié)圓錐角膜中膠原合成的機(jī)制。研究結(jié)果對揭示乙酰唑胺類藥物在圓錐角膜中的作用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 圓錐角膜成纖維細(xì)胞的提取及培養(yǎng)

人圓錐角膜組織來源于山西省眼科醫(yī)院角膜病科，為角膜移植術(shù)后的遺棄組織，實(shí)驗(yàn)經(jīng)太原理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。圓錐角膜組織按照實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法用 0.5 mg/mL Ⅱ型膠原酶消化提取角膜成纖維細(xì)胞，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(FBS，Gibco)、體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(HyClone)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，傳代3～4 次的細(xì)胞進(jìn)行乙酰唑胺藥物處理。

1.2 乙酰唑胺藥物處理

將提取的圓錐角膜成纖維細(xì)胞以3×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到六孔板中，貼壁后更換為不含血清的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，饑餓處理 6 h后加入100 μmol/L乙酰唑胺溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，用于后續(xù)基因和蛋白水平檢測。以相同培養(yǎng)條件下未進(jìn)行乙酰唑胺處理的細(xì)胞作為對照。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR( qPCR )檢測基因表達(dá)

收集的圓錐角膜成纖維細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后，加入細(xì)胞裂解液，采用EastepSuper 總RNA 提取試劑盒(Promega，上海)提取胞內(nèi)總RNA，采用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，大連)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.采用qPCR檢測對照組和乙酰唑胺處理細(xì)胞中膠原合成(COLs)、羥基化修飾(P4Hs、PLODs)、交聯(lián)(LOXs)、降解(MMPs、TIMPs)相關(guān)基因及抗氧化酶基因(NQO-1、HO-1)的表達(dá)變化。引物信息如表1所示，以管家基因GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 qPCR引物Table 1 List of Primers for qPCR

1.4 膠原含量檢測

收集的細(xì)胞培養(yǎng)液上清經(jīng)離心去沉淀后直接用于胞外膠原含量檢測；細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后，加入適量體積的RIPA裂解液(含體積分?jǐn)?shù)1%磷酸酶抑制劑和體積分?jǐn)?shù)1% 蛋白酶抑制劑)，冰上裂解10 min，12 000 g離心10 min，取上清檢測胞內(nèi)膠原含量。

使用BCA試劑盒對待測樣本中的總蛋白進(jìn)行定量。采用人總膠原ELISA試劑盒(酶免，上海)檢測樣本中總膠原含量的變化，按照試劑盒說明書檢測450 nm波長處OD值的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中總膠原的含量。采用Western blot 法檢測胞內(nèi)I 型膠原的表達(dá)，20 μg總蛋白通過8% SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，美國)。將膜放置于質(zhì)量濃度為5%脫脂奶粉中，室溫條件下進(jìn)行封閉處理2 h，分別加入鼠抗人Collagen I抗體和GAPDH抗體(1∶500)(Servicebio，武漢)，4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后加入HRP偶聯(lián)的羊抗鼠二抗(1∶5 000)(Servicebio，武漢)，室溫孵育1 h.漂洗后使用ECL發(fā)光試劑盒顯影，采用ImageJ分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參，比較乙酰唑胺處理前后圓錐角膜成纖維細(xì)胞中I型膠原的表達(dá)。

1.5 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平檢測

乙酰唑胺處理后，采用活性氧(ROS)熒光探針DCFH-DA(10 μmol/L)孵育圓錐角膜成纖維細(xì)胞，通過熒光倒置顯微鏡成像，使用 ImageJ 1.8.0 軟件對熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量，分析乙酰唑胺處理后細(xì)胞內(nèi) ROS 含量變化。收集乙酰唑胺處理后的細(xì)胞，通過反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，取上清，BCA法蛋白定量后采用丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(索萊寶，北京)和總氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒(普利萊，北京)檢測細(xì)胞內(nèi) MDA 含量和T-AOC的變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(n=3)，使用 SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，p<0.05認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 乙酰唑胺調(diào)節(jié)圓錐角膜成纖維細(xì)胞膠原代謝相關(guān)基因的表達(dá)

為了探討乙酰唑胺類藥物在圓錐角膜成纖維細(xì)胞基質(zhì)重塑過程中的作用，本研究通過qPCR分析了乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成和降解相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，乙酰唑胺處理組中COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1等膠原合成基因的表達(dá)顯著上調(diào)(圖2(a)，p<0.05).脯氨酰 4-羥化酶(P4H)和前膠原賴氨酸2-氧代戊二酸5-雙加氧酶(PLOD)參與脯氨酰和賴氨酰殘基的羥基化修飾，在膠原蛋白組裝、成熟過程中起重要作用。乙酰唑胺處理后，圓錐角膜成纖維細(xì)胞中膠原羥基化修飾基因P4HA、P4HB和PLOD2、PLOD3的表達(dá)沒有顯著變化(圖2(b)、(c))，而參與膠原交聯(lián)的賴氨酰氧化酶基因LOX3、LOX4的表達(dá)顯著升高(圖2(d)，p<0.05).基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及其組織抑制因子(TIMP)參與膠原的降解，相較對照組，乙酰唑胺處理組中MMP2、MMP3、MMP9的表達(dá)顯著下降(圖2(e)，p<0.05)，TIMP1、TIMP2、TIMP4的表達(dá)顯著上調(diào)(圖2(f)，p<0.05).

圖1 乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細(xì)胞內(nèi)膠原合成和降解相關(guān)基因的表達(dá)變化Fig.1 Expression of genes related to collagen synthesis and degradation in acetazolamide treated keratoconus cells

圖2 乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細(xì)胞中膠原含量變化Fig.2 Changes of collagen content in keratoconus fibroblasts after acetazolamide treatment

2.2 乙酰唑胺提高圓錐角膜成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的含量

采用ELISA方法分析乙酰唑胺處理后胞內(nèi)外總膠原含量的變化，結(jié)果顯示，乙酰唑胺處理24 h后圓錐角膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液上清及胞內(nèi)總膠原含量均顯著增加(圖2(a)，p<0.05).I型膠原是角膜細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，采用Western blot 進(jìn)一步檢測I型膠原的表達(dá)變化，如圖2(b)所示，乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細(xì)胞中 I 型膠原蛋白表達(dá)為對照組的 5 倍(p<0.05).

2.3 乙酰唑胺抑制圓錐角膜成纖維細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平

為深入探究乙酰唑胺調(diào)節(jié)圓錐角膜成纖維細(xì)胞中膠原合成的機(jī)制，本研究進(jìn)一步分析了乙酰唑胺處理后細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的變化。如圖3所示，乙酰唑胺處理后，角膜成纖維細(xì)胞中ROS水平顯著降低(p<0.05).進(jìn)一步檢測氧化應(yīng)激標(biāo)記物MDA 含量和細(xì)胞總抗氧化能力、抗氧化酶表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酰唑胺處理后，胞內(nèi) MDA 含量下降(圖4(a))，細(xì)胞總抗氧化能力提高(圖4(b))，抗氧化酶基因NQO-1的表達(dá)顯著升高(圖4(c))(p<0.05).

圖3 乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS含量變化Fig.3 ROS level in acetazolamide-treated keratoconus fibroblasts

圖4 乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細(xì)胞內(nèi)MDA含量、總抗氧化能力及抗氧化酶基因表達(dá)的變化Fig.4 MDA content，T-AOC，and gene expression of antioxidant enzymes in acetazolamide-treated keratoconus fibroblasts

3 討論

探索能從根本上改善膠原降解、增強(qiáng)角膜力學(xué)性能的方法，對減緩圓錐角膜進(jìn)程、治療圓錐角膜具有重要意義。目前，臨床上晚期圓錐角膜患者不得不進(jìn)行角膜移植術(shù)，早中期圓錐角膜的治療手段仍主要依賴佩戴角膜接觸鏡，膠原交聯(lián)治療圓錐角膜仍在探索改進(jìn)中，尚無藥物治療圓錐角膜的報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白能夠保護(hù)人角膜上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，可用于治療氧化應(yīng)激導(dǎo)致的眼部疾病[16]。蘿卜硫素能夠激活兔角膜組織中Nrf-2/HO-1抗氧化信號(hào)途徑，減緩圓錐角膜的進(jìn)展[10]。本研究發(fā)現(xiàn)乙酰唑胺可以調(diào)節(jié)角膜細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，增加圓錐角膜I型膠原及交聯(lián)蛋白的表達(dá)，下調(diào)MMPs表達(dá)，降低圓錐角膜細(xì)胞外基質(zhì)的降解。

膠原是角膜細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原的含量和結(jié)構(gòu)對角膜的結(jié)構(gòu)和功能維持具有重要作用[17]。膠原合成和降解失衡，形態(tài)和排列發(fā)生改變，能夠?qū)е陆悄た棺冃文芰档?、生物力學(xué)性能下降，進(jìn)而誘導(dǎo)圓錐角膜的發(fā)生。已有研究表明，圓錐角膜患者的眼淚中膠原降解酶MMPs 的表達(dá)提高，膠原降解產(chǎn)物增加[2]。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圓錐角膜中COL5、COL6、COL12等膠原合成基因的表達(dá)下調(diào)，膠原羥基化修飾基因P4Hs、PLODs 及交聯(lián)基因LOXs 的表達(dá)降低[5，7，18]。蛋白組學(xué)分析結(jié)果顯示，與正常角膜相比，圓錐角膜中I 型、 III 型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白含量顯著降低[3]。qPCR 結(jié)果顯示，圓錐角膜細(xì)胞中 COL1的表達(dá)降低[19]。上述已有研究表明，圓錐角膜中膠原合成及羥基化修飾基因表達(dá)降低，膠原降解增加，膠原含量減少。本研究結(jié)果顯示，乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細(xì)胞中編碼I、III、V、VI膠原基因及膠原交聯(lián)酶基因LOXs的表達(dá)升高，膠原降解蛋白基因MMPs的表達(dá)下降，膠原修飾基因 P4Hs、PLODs的表達(dá)沒有顯著變化。 I 型膠原是角膜細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，占總膠原蛋白的 60%[20].進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，乙酰唑胺處理后圓錐角膜成纖維細(xì)胞中I型膠原含量降低。本研究結(jié)果表明，乙酰唑胺能夠促進(jìn)圓錐角膜細(xì)胞中膠原的合成和交聯(lián)，減少其降解。

氧化應(yīng)激參與多種眼部疾病的發(fā)生，在圓錐角膜的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用[21-22]。對文獻(xiàn)報(bào)道的圓錐角膜中的氧化應(yīng)激標(biāo)志物進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，圓錐角膜中ROS以及MDA含量顯著增加，總抗氧化能力降低，氧化-抗氧化穩(wěn)態(tài)失衡[23]。氧化應(yīng)激可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑參與多種疾病的發(fā)生。對癌細(xì)胞的研究表明，H2O2可以通過下游的MAPK途徑、PI3K途徑激活MMPs[24].ROS能夠通過NF-κB信號(hào)途徑誘導(dǎo)大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞MMP9的表達(dá)[25]。在腎臟組織中，ROS可通過TGF-β1通路調(diào)節(jié)膠原的合成和降解[26]。對肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，乙酰唑胺可以減弱由缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧[27]，推測乙酰唑胺可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)乙酰唑胺處理后，圓錐角膜成纖維細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)記物含量減少，抗氧化酶表達(dá)及細(xì)胞總抗氧化能力升高，表明乙酰唑胺能夠降低圓錐角膜成纖維細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)的信號(hào)途徑調(diào)節(jié)膠原的代謝。

角膜組織與其他結(jié)締組織不同，需要保持透明。圓錐角膜治療除了要考慮改善膠原蛋白含量及交聯(lián)程度，還要避免瘢痕的形成。III型膠原是瘢痕組織主要表達(dá)的膠原蛋白，雖然本研究發(fā)現(xiàn)乙酰唑胺能改善圓錐角膜成纖維細(xì)胞I型膠原的表達(dá)，誘導(dǎo)III型膠原亞基編碼基因的表達(dá)，但是否會(huì)影響III型膠原的含量還不明確。鑒于此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步考量乙酰唑胺對III型膠原等調(diào)節(jié)角膜透明度的蛋白或蛋白多糖含量的影響，以及對角膜組織力學(xué)性能的作用，為該類藥物改善圓錐角膜發(fā)展進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，乙酰唑胺能夠通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，減少氧化損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)圓錐角膜成纖維細(xì)胞膠原的合成，抑制膠原降解。本研究結(jié)果可為圓錐角膜的治療提供新思路。