基底剛度對(duì)基于納米顆粒的阿霉素內(nèi)吞影響的研究

賈冠杰,孔金龍,楊莎莎,張玉原,楊慧圓,杜瑤瑤,王楷群,趙志換,陳維毅

(太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原030024)

化療是癌癥治療的重要手段。阿霉素是臨床上常用的廣譜化療藥物。由于其水溶性差、非靶向性以及用藥導(dǎo)致的心臟毒性[1]，所以將阿霉素靶向運(yùn)輸?shù)讲≡顓^(qū)域?qū)τ谔岣甙⒚顾氐闹委熜室约皽p輕副作用具有重要意義[2-5]。基于納米載藥技術(shù)的阿霉素(doxorubicin，DOX)輸運(yùn)增強(qiáng)了機(jī)體內(nèi)阿霉素在靶向區(qū)域的吸收和分布，提高了殺傷癌細(xì)胞的能力，減少了藥物對(duì)于正常組織的不良反應(yīng)[6-9]。載有DOX的聚合物-脂質(zhì)混合納米粒子(polymer-lipid hybrid nanoparticle，PLN)比游離的DOX更容易向細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[10]?；赥iO2納米顆粒的DOX運(yùn)輸可以使得MCF-7細(xì)胞中藥物積累量增加約2.4倍[11]。Ge-DOX-5-ALA/NPs納米顆?？梢岳媚[瘤細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)觸發(fā)釋放藥物，以成功地將DOX轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤部位[12]。復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境對(duì)于阿霉素的靶向運(yùn)輸有著顯著影響。包裹于乙二醇?xì)ぞ厶巧系陌⒚顾氐妮斶\(yùn)受到微環(huán)境酸堿度的影響，當(dāng)pH值為5時(shí)靶向區(qū)域處釋放出來阿霉素的熒光強(qiáng)度最大[13]。缺鐵微環(huán)境中影響基于聚乙烯醇的DOX輸運(yùn)，當(dāng)加入轉(zhuǎn)鐵蛋白配體之后，腫瘤細(xì)胞對(duì)于載藥顆粒的攝取率顯著提高[14]。因此，研究復(fù)雜腫瘤微環(huán)境對(duì)于改善化療效果有重要意義。

在眾多腫瘤微環(huán)境因素中，腫瘤力學(xué)微環(huán)境(例如細(xì)胞外基質(zhì)剛度)對(duì)于腫瘤發(fā)展進(jìn)程以及治療有著重要影響。轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)與正常組織的細(xì)胞外基質(zhì)剛度相比顯著降低[15-16]?；|(zhì)中膠原蛋白水平的增加導(dǎo)致的腫瘤內(nèi)血管受壓和灌注不足使得到達(dá)腫瘤部位的化療藥物濃度降低[17]。致密性的基質(zhì)阻礙了較大尺寸(>60 nm)的納米載藥顆粒輸運(yùn)到腫瘤處進(jìn)而影響治療效果[18]。在特定剛度的基質(zhì)中紫杉醇更容易被乳腺癌細(xì)胞吸收[19-21]。在剛度為105 kPa的基質(zhì)中肝癌細(xì)胞對(duì)于順鉑的耐藥性最強(qiáng)[22]。針對(duì)于在腫瘤發(fā)展進(jìn)程中伴隨的基質(zhì)剛度變化的研究能夠?yàn)樘岣呋熕幬锢眯侍峁撛趲椭?/p>

包裹于載藥顆粒上的化療藥物向內(nèi)輸運(yùn)的效率與細(xì)胞的內(nèi)吞作用有關(guān)。已有研究表明基質(zhì)剛度對(duì)于細(xì)胞內(nèi)吞作用有調(diào)控作用。較硬的基質(zhì)會(huì)抑制MK2抑制劑肽的吸收[23]?；讋偠鹊脑黾訒?huì)使得單位面積上的乳腺癌細(xì)胞對(duì)于載有藥物C6的F127MM納米顆粒的攝取效率降低[24]。軟基質(zhì)上培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞顯著提高了對(duì)于細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的吸收[25]?；|(zhì)剛度能夠影響基質(zhì)細(xì)胞對(duì)于癌細(xì)胞膜釋放的微泡(microvesicles，MVs)的吸收效率[26]。由此看來，研究細(xì)胞外基質(zhì)剛度對(duì)細(xì)胞內(nèi)吞作用的影響有助于提高基于納米載藥技術(shù)的藥物利用率，進(jìn)而增強(qiáng)化療藥物的治療效果。

在本研究中，探索了細(xì)胞黏附基底剛度對(duì)于基于納米載藥顆粒技術(shù)的阿霉素內(nèi)吞作用的影響。具體內(nèi)容有：1)探索了包裹在納米載藥顆粒上的DOX的輸運(yùn)對(duì)于不同PDMS基底剛度上的Hela細(xì)胞存活率的影響。2)研究了基底剛度對(duì)HeLa細(xì)胞中網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的影響。聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)納米粒子可以負(fù)載抗癌藥物DOX并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。通過HeLa細(xì)胞吸收DOX的效率分析了底物剛度介導(dǎo)內(nèi)吞作用的機(jī)制。檢測(cè)HeLa細(xì)胞的活性和介導(dǎo)內(nèi)吞作用的整合素αVβ5和蛋白NUMB在不同剛度的PDMS基底上表達(dá)。本工作發(fā)現(xiàn)ECM剛度的變化會(huì)影響細(xì)胞的內(nèi)吞作用，合適的剛度(楊氏模量范圍在0.578 MPa～1.986 MPa)可以使納米載藥達(dá)到更顯著的治療腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

PDMS(基料、固化劑)購(gòu)自Dow Corning公司(美國(guó))；DMEM培養(yǎng)基和FBS胎牛血清購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))；CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Dojindo公司(日本)；鹽酸氯丙嗪(內(nèi)吞抑制劑CPZ)；DOX阿霉素購(gòu)自MedChemExpress公司(中國(guó))；一抗Anti-Integrin alpha V+beta5(1∶200)、NUMB單克隆抗體(1∶100)和二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)購(gòu)自abcam公司(美國(guó))；一抗NUMB多克隆抗體購(gòu)自Thermo-Fisher公司(美國(guó))；二抗Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG(H+L)、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、β-肌動(dòng)蛋白-HRP兔單克隆抗體、DAPI和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于碧云天公司(中國(guó))。

1.2 載藥納米顆粒和不同剛度的PDMS基底制備與力學(xué)性能測(cè)試

制備了聚乙烯吡咯烷酮PVP納米粒子以攜帶DOX.先將十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)與葡萄糖在160 ℃混合制備CTAB-C，再將CTAB-C與30 mL丙酮在油浴中混合得到脫模板的C(RC)納米材料，加入酒精通過超聲波合成W18O49@RC，最后將PVP和W18O49@RC均勻分散在酒精中，充分?jǐn)嚢璨㈦x心得到PVP-W18O49@RC納米顆粒。制備的載藥納米顆粒顯示出了良好的生物兼容性。具體細(xì)節(jié)見文獻(xiàn)[27].

實(shí)驗(yàn)中使用了5種不同剛度的PDMS.先將PDMS基料與固化劑分別按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶30的質(zhì)量比混合在6孔板中，再用真空干燥箱除去微小氣泡，最后放入80 ℃烘箱中固化。采用電子機(jī)械儀測(cè)量了PDMS基底的楊氏模量。電子機(jī)械儀負(fù)載速度為100 mm/min，最大載荷為50 N.

1.3 PVP納米顆粒和PDMS上的DOX負(fù)載

將1 mg PVP納米顆粒和1 mmol/L DOX溶液分別分散于超納米純蒸餾水(1 mL)中，再將上述溶液混合在室溫下暗區(qū)攪拌。將載有DOX的納米粒子離心并用超納米純蒸餾水進(jìn)行洗滌，每一次都收集DOX上清液以測(cè)量DOX的載量。用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量加載后的上清液DOX溶液。公式(1)用于計(jì)算DOX的負(fù)載[28]。

(1)

其中,amount of loaded drug是指加載到PVP納米顆粒上的DOX量。

將DOX溶于1 mmol/L的PBS溶液中，用DMEM稀釋10倍至終濃度為100 μmol/L.將3 mL濃度為100 μmol/L的DOX溶液加入不同組別的PDMS中，浸泡48 h.用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基上清液的紫外吸收光譜。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

研究中使用了人宮頸癌細(xì)胞系(HeLa；ATCC編號(hào)為CCL-2).HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將5種不同硬度的PDMS基底進(jìn)行消毒后，再將細(xì)胞溶液移入5組基底中，孵育48 h.

1.5 PDMS和內(nèi)吞抑制劑CPZ的細(xì)胞毒性

PMDS和CPZ的細(xì)胞毒性通過CCK-8試劑盒表征。5組PDMS底物和對(duì)照組上的HeLa細(xì)胞密度均為105/mL.37 ℃培養(yǎng)48 h后，一組加入內(nèi)吞抑制劑CPZ，37 ℃再培養(yǎng)1 h，后加入2 mL的50 μg/mL DOX或PVP/DOX培養(yǎng)18 h.將200 μL CCK-8溶液加入到含有2 mL培養(yǎng)基的每個(gè)培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞在37 ℃下進(jìn)行孵育。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。每次測(cè)量重復(fù)3次。

1.6 PVP/DOX復(fù)合物的細(xì)胞攝取

DOX具有紅色熒光特性。為了定位DOX，使用熒光顯微鏡進(jìn)行標(biāo)記。為了方便顯微分析，將HeLa細(xì)胞接種在具有不同硬度PDMS的24孔板中，保證每孔約105個(gè)細(xì)胞，并置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h.一組用PVP/DOX復(fù)合物(50 μg/mL)處理18 h，另一組細(xì)胞先用CPZ(25 μg/mL)處理1 h，然后加入PVP/DOX處理18 h.熒光顯微鏡觀察前，用PBS洗滌細(xì)胞以除去游離的DOX.用ImageJ軟件分析每個(gè)基板上細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.7 免疫熒光染色

整合素αVβ5和網(wǎng)格蛋白銜接蛋白NUMB是網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞作用中的兩種重要蛋白質(zhì)。本研究探測(cè)了接種在不同剛度PDMS基質(zhì)上的細(xì)胞αVβ5和NUMB的形態(tài)。向HeLa細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)1%BSA，37 ℃孵育30 min.再將體積分?jǐn)?shù)1% BSA稀釋的一抗Anti-Integrin alpha V+beta5(1∶200)和NUMB單克隆抗體(1∶100)加入細(xì)胞溶液中，并在4 ℃下保持過夜。用PBS(1∶500)稀釋的二抗Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG(H+L)和Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)加入細(xì)胞溶液中并維持4 h.然后使用DAPI染色細(xì)胞核。最后將染色的細(xì)胞洗滌并在熒光顯微鏡下觀察。使用ImageJ軟件分析每個(gè)基板上細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。對(duì)于每個(gè)基板，分析不少于100個(gè)細(xì)胞的至少5個(gè)區(qū)域。每個(gè)區(qū)域分析3次并取平均值以減少錯(cuò)誤。

1.8 Western Blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)

將培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行裂解。裂解物在冰上孵育，再在4 ℃、15 000 g下離心以收集上清液。參照BCA蛋白定量試劑盒說明書，測(cè)定各組蛋白濃度。上樣等量蛋白，體積分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用含有0.2%吐溫-20和5%脫脂奶粉的PBS封閉，并用兔單克隆抗NUMB抗體(1∶1 000)和抗β-肌動(dòng)蛋白(1∶2 000)印跡過夜。用PBS洗膜，將蛋白質(zhì)與山羊抗兔IgG H&L(HRP)和β-肌動(dòng)蛋白-HRP兔單克隆抗體(1∶5 000) 室溫孵育1 h.使用蛋白質(zhì)印跡數(shù)字成像儀對(duì)條帶進(jìn)行可視化。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有定量結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，在Origin軟件中采用Tukey顯著性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)組間差異。*表示兩組數(shù)據(jù)存在差異(*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001)，0.05表示顯著差異，N.S表示無顯著差異。所有生物學(xué)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果和討論

2.1 PDMS基底的剛度特性

通過拉伸試驗(yàn)測(cè)試了5種配比的PDMS基底力學(xué)性能，PDMS的應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖1(a)所示。通過擬合曲線前10%的斜率得到了不同質(zhì)量比的PDMS的楊氏模量(圖1(b))。結(jié)果表明，調(diào)控PDMS配比能夠影響其力學(xué)性能，抗拉強(qiáng)度會(huì)隨著質(zhì)量比的增加而增加。質(zhì)量比為1∶30的PDMS最軟，楊氏模量為0.447 MPa，而質(zhì)量比為1∶5的PDMS剛度最大，楊氏模量為2.38 MPa.質(zhì)量比為1∶20，1∶15和1∶10的PDMS楊氏模量分別為0.578 MPa，0.815 MPa和1.986 MPa.

圖1 不同質(zhì)量比PDMS基材的冷拉伸性能Fig.1 Cold-drawn tensile properties of PDMS substrates with different mass ratios

2.2 不同剛度PDMS的DOX負(fù)載能力

采用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量了不同配比的PDMS基底上DOX的吸附特性。分別測(cè)定DOX溶液，DMEM溶液以及各組不同剛度PDMS基底負(fù)載DOX 48 h后上清液的紫外吸收光譜特性。不同組別的吸光度曲線如圖2所示。DOX在480 nm處表現(xiàn)為強(qiáng)吸收峰，這與文獻(xiàn)[29]結(jié)果相類似。DMEM在430 nm處表現(xiàn)為強(qiáng)吸收峰。而各組PDMS基底上的DOX負(fù)載能力沒有明顯的差異，這說明不同剛度的PDMS基底不會(huì)影響游離的DOX負(fù)載能力。

圖2 負(fù)載DOX 48 h后不同組的紫外吸收特性曲線Fig.2 UV absorption characteristic curve of different groups after loading DOX for 48 h

2.3 PVP納米粒子的DOX負(fù)載能力

將PVP納米顆粒加到DOX溶液中磁性攪拌48 h，然后吸出上清液進(jìn)行紫外-可見分光光度法測(cè)定。如圖3所示，DOX和載藥后PVP/DOX復(fù)合物的紫外吸收光譜分別以紅線和藍(lán)線表示。DOX和PVP/DOX復(fù)合物的吸收光譜在480 nm處有明顯的吸收帶，但PVP/DOX復(fù)合物的吸收光譜強(qiáng)度大大低于純DOX溶液，這是由于藥物已被加載到PVP粒子上。根據(jù)式(1)計(jì)算得出，PVP粒子的載藥量約為100 μmol/L.

圖3 采用紫外-可見分光光度法測(cè)定DOX在PVP顆粒上的負(fù)載能力Fig.3 Loading capacity of DOX on PVP particles measured by UV-vis spectrophotometry

2.4 DOX的細(xì)胞內(nèi)攝取和分布

為了評(píng)估PVP在細(xì)胞內(nèi)的攝取情況并證明PVP納米顆粒可以通過特定的內(nèi)吞途徑被內(nèi)化到靶細(xì)胞中，研究了PVP/DOX復(fù)合物在HeLa細(xì)胞中的內(nèi)吞行為和內(nèi)吞途徑。在正常條件和內(nèi)吞抑制條件下，通過熒光倒置顯微鏡監(jiān)測(cè)DOX的紅色熒光來定位不同剛度的PDMS基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞中PVP/DOX顆粒。在藥物孵育18 h后，對(duì)照組和不同剛度PDMS基底上DOX的大部分紅色熒光均勻分布在細(xì)胞內(nèi)，少量DOX分布在細(xì)胞膜周圍；而在先用抑制劑CPZ預(yù)處理1 h再孵育藥物后，各組細(xì)胞膜外而不是細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)鮮紅色熒光(圖4).結(jié)合兩組實(shí)驗(yàn)分析，PVP納米粒子可以被細(xì)胞內(nèi)化吸收，并通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑被細(xì)胞有效吸收。

圖4 網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞抑制劑(CPZ)改變了載藥納米顆粒在HeLa細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化吸收，加入抑制劑后DOX熒光在細(xì)胞膜邊緣聚集Fig.4 Clathrin endocytosis inhibitor(CPZ) changing the internalization absorption of drug-loading nanoparticles in HeLa cells，and DOX fluorescence assembled at the edge of cell membrane after adding the inhibitor

2.5 藥物和內(nèi)吞抑制劑影響細(xì)胞活性

為了探究基底剛度對(duì)內(nèi)吞作用的影響，第一組加入游離DOX培養(yǎng)18 h，第二組先加入內(nèi)吞抑制劑CPZ，然后加入PVP/DOX復(fù)合物培養(yǎng)18 h，第三組不加抑制劑，直接加入PVP/DOX復(fù)合物培養(yǎng)18 h.3組CCK-8結(jié)果如圖5所示。發(fā)現(xiàn)在不加入DOX的情況下，不同剛度的PDMS基底對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有影響。在僅添加游離DOX的條件下，可以看到DOX對(duì)細(xì)胞有一定的殺傷作用，但不同剛度組仍沒有表現(xiàn)出明顯差異。對(duì)加入PVP/DOX復(fù)合物的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，與僅添加游離DOX組對(duì)比，添加內(nèi)吞抑制劑組細(xì)胞活性增加，而未添加內(nèi)吞抑制劑組細(xì)胞活性顯著降低，不同剛度組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。質(zhì)量比為1∶10、1∶15和1∶20的PDMS基底上的細(xì)胞活性低于質(zhì)量比為1∶5和1∶30的PDMS基底上的，這說明較硬和較軟的基底不利于細(xì)胞的內(nèi)吞作用，從而減少了PVP/DOX顆粒擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，而中等剛度的基底有利于納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞。因此，適當(dāng)?shù)幕讋偠饶軌蛱岣呒{米顆粒的給藥效率，這在給藥系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用中起著重要的作用。

圖5 分別添加游離DOX、細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑CPZ和PVP/DOX、PVP/DOX的不同剛度PBMS基底對(duì)Hela細(xì)胞活力的影響 Fig.5 Effects of PBMS substrate with different hardness on Hela cell viability by adding free DOX，endophage inhibitors CPZ, and PVP/DOX，PVP/DOX

2.6 整合素αVβ5和銜接蛋白NUMB分布和強(qiáng)度的變化

免疫熒光染色用于表征在不同基質(zhì)上培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核(DAPI，藍(lán)色通道)、整合素(αVβ5，綠色通道)和網(wǎng)格蛋白銜接蛋白(NUMB，紅色通道)的共定位(圖 6).最近的研究表明，整合素αVβ5位于網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞結(jié)構(gòu)中，可以更好地將網(wǎng)格蛋白錨定在底物上，促進(jìn)內(nèi)吞作用[30-31]。內(nèi)吞過程中，NUMB充當(dāng)網(wǎng)格蛋白銜接蛋白，將網(wǎng)格蛋白與整合素連接來引導(dǎo)內(nèi)吞[32-34]。如圖6所示，各組整合素αVβ5蛋白分布無明顯變化，但在對(duì)照組和1∶10、1∶15、1∶20的PDMS底物上可觀察到NUMB蛋白的高亮簇分布與其他組不同。

圖6 不同基底剛度對(duì)αVβ5和NUMB表達(dá)的影響Fig.6 Effects of different substrate stiffness on the expression of αVβ5 and NUMB

圖7熒光定量分析表明整合素αVβ5在1∶10 PDMS基底上的表達(dá)較高，NUMB蛋白在3種中等剛度基底上的表達(dá)顯著高于其他組，且NUMB蛋白在1∶15 PDMS基底上具有最高的熒光強(qiáng)度。結(jié)合2.5節(jié)中的結(jié)果，可得知兩種蛋白的高表達(dá),尤其是NUMB，促進(jìn)了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，從而增加了載藥納米粒進(jìn)入細(xì)胞的能力，增強(qiáng)了藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用。

圖7 HeLa細(xì)胞內(nèi)吞蛋白整合素αVβ5和NUMB表達(dá)的定量分析Fig.7 Quantitative analysis of HeLa cell endocytosis protein integrin αVβ5 and NUMB expression

2.7 NUMB蛋白表達(dá)的定量分析

為了進(jìn)一步評(píng)估基底剛度對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)吞途徑的影響，以β-actin(42 ku)為內(nèi)參蛋白，采用Western blot探索網(wǎng)格蛋白銜接蛋白NUMB(72 ku)在不同底物中的活化和表達(dá)情況。Western blot結(jié)果如圖8(a)所示，圖8(b)顯示了蛋白質(zhì)條帶的歸一化數(shù)據(jù)。與免疫熒光染色結(jié)果類似，Western blot顯示NUMB蛋白在質(zhì)量比為1∶15 PDMS基底上的表達(dá)水平最高，比對(duì)照組高近1.5倍(圖8(b)).除此之外，NUMB蛋白在質(zhì)量比為1∶20 PDMS基底上的表達(dá)水平也高于對(duì)照組，而1∶5和1∶30的數(shù)據(jù)最低。這些結(jié)果與細(xì)胞活性測(cè)試一致，表明在特定剛度的基底上NUMB的蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化，這可能是不同剛度基底上網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用發(fā)生變化的原因。因此，基底剛度可用于調(diào)節(jié)NUMB蛋白的表達(dá)以抑制或促進(jìn) HeLa細(xì)胞的內(nèi)吞作用。

圖8 不同剛度底物對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)吞途徑中的NUMB蛋白的影響Fig.8 Effects of different stiffness substrates on NUMB proteins in the endocytic pathway of HeLa cells

3 結(jié)論

細(xì)胞的內(nèi)吞作用可作為研究納米載藥治療腫瘤的一個(gè)關(guān)鍵步驟，而細(xì)胞和基底之間的相互作用可能會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)吞作用的效率。在研究中，以HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，研究了5種不同剛度的PDMS基底如何調(diào)節(jié)HeLa細(xì)胞的阿霉素內(nèi)吞行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDMS基底剛度的變化對(duì)于阿霉素的負(fù)載能力無影響，表明剛度調(diào)節(jié)下的HeLa細(xì)胞的活性改變與初始阿霉素濃度無關(guān)。納米顆粒介導(dǎo)的阿霉素的內(nèi)吞行為受基底剛度調(diào)控，在剛度為0.578 MPa，0.815 MPa和1.986 MPa基底上呈現(xiàn)出胞內(nèi)阿霉素濃度高以及細(xì)胞活性差。通過免疫熒光染色和Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與內(nèi)吞作用相關(guān)的整合素αVβ5，銜接蛋白NUMB蛋白表達(dá)的變化受基底剛度的調(diào)控，使得阿霉素的內(nèi)吞效率變化，進(jìn)而影響阿霉素殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。剛度調(diào)控的αVβ5和NUMB表達(dá)的升高促進(jìn)了胞內(nèi)阿霉素濃度的提高，與HeLa細(xì)胞活性變差的結(jié)果一致。該研究為優(yōu)化納米載藥材料以實(shí)現(xiàn)更高療效提供了潛在基礎(chǔ)，并為更好的癌癥治療提供了有用的視角。