阿托品對(duì)形覺(jué)剝奪性近視模型大鼠的改善作用及作用機(jī)制

李錫謙， 康 平， 周 玉

(三六三醫(yī)院眼科, 四川 成都 611730)

近年來(lái)，近視的患病率迅速增加，特別是在東亞和東南亞地區(qū)，80%～90%的年輕人患有近視，20%左右的人患有高度近視[1]。高度近視增加眼部并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，例如視網(wǎng)膜脫離、近視黃斑變性和脈絡(luò)膜血管新生，甚至導(dǎo)致視力喪失[2]。盡管近視已經(jīng)非常普遍，但近視發(fā)展的機(jī)制仍不完全清楚。阿托品(atropine，ATR)是一種非選擇性可逆毒蕈堿拮抗劑，在臨床上常被用作睫狀肌麻痹劑、散瞳劑以及弱視治療劑[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)ATR在減緩近視方面具有非常好的效果[4]，然而其作用機(jī)制尚不清楚。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和遺傳穩(wěn)定性來(lái)控制成熟組織的穩(wěn)態(tài)，其異?；蛲蛔兣c人類的多種疾病有關(guān)，包括癌癥、骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)變性和心臟代謝疾病[5]。據(jù)報(bào)道，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與近視的發(fā)生關(guān)系密切[6]。而ATR能否通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)形覺(jué)剝奪性近視大鼠起到一定的改善作用尚不明確。因此，本研究旨在探究ATR對(duì)形覺(jué)剝奪性近視大鼠的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物:60只SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自濱州醫(yī)學(xué)院，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2021-0005。本研究已獲得本院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2主要試劑:ATR購(gòu)自江蘇悅興藥業(yè)有限公司；白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6(貨號(hào)：FY-A014251)、IL-1β(貨號(hào)：FY-A014118)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(貨號(hào)：FY-A014242)ELISA試劑盒購(gòu)自上海富雨生物科技有限公司；Wnt/β-catenin通路激活劑TAK-715(貨號(hào)：S80610)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；Wnt(貨號(hào)：ab260036)、β-catenin(貨號(hào)：ab32572)、p-β-catenin(貨號(hào)：ab246504)、TGF-β1(貨號(hào)：ab215715)、TIMP-2(貨號(hào)：ab180630)、MMP-2(貨號(hào)：ab92536)、GAPDH兔多克隆抗體(貨號(hào)：ab9485)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3FDM大鼠模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組:FDM大鼠模型參照文獻(xiàn)[6]構(gòu)建。用膠水把遮光眼罩粘貼在大鼠右眼上，每天檢查眼罩是否脫落，若發(fā)現(xiàn)眼罩松動(dòng)，及時(shí)用膠水貼好，左眼不做任何處理。NC組大鼠眼睛不做任何處理，共處理4周。將造模成功的48只SD大鼠隨機(jī)分為Model組、阿托品組(ATR組)、Wnt/β-catenin通路激活劑TAK-715組、ATR+TAK-715組，每組12只。ATR組按照3mg/kg的劑量右眼結(jié)膜下注射ATR[7]；TAK-715組按照10mg/kg的劑量右眼結(jié)膜下注射TAK-715[8]；ATR+TAK-715組在ATR組基礎(chǔ)上右眼結(jié)膜下注射10mg/kg TAK-715；NC組、Model組右眼結(jié)膜下注射等量的生理鹽水，每天一次，持續(xù)4周。

1.4標(biāo)本采集:最后一次注射ATR后，測(cè)量大鼠右眼眼軸長(zhǎng)度和屈光度，之后麻醉大鼠處死，收集血液，分離得到血清，置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｃ拷M取6只大鼠的右眼鞏膜固定于4%多聚甲醛中，取剩余6只大鼠右眼鞏膜保存在-80℃冰箱。

1.5眼部生物學(xué)參數(shù):采用手持帶光檢影鏡測(cè)定眼球相對(duì)屈光度，A型超聲儀測(cè)量眼軸長(zhǎng)度，評(píng)估眼球屈光狀態(tài)變化。

1.6鞏膜形態(tài)比較:取鞏膜組織置于4%多聚甲醛溶液固定，脫水、包埋、切成5μm的石蠟切片，用蘇木精和伊紅(H&E)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7血清炎癥因子水平:按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.8RT-qPCR檢測(cè)鞏膜TGF-β1、MMP-2、TIMP-2 mRNA的表達(dá):提取1.4保存的大鼠鞏膜組織總RNA，之后將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-qPCR測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)的mRNA表達(dá)量，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃/30s，40個(gè)循環(huán)(95℃/5s,60℃/30s)；以GAPDH為內(nèi)參基因，引物使用NCBI在線設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

1.9Western blot檢測(cè)鞏膜組織Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá):取大鼠鞏膜組織勻漿，用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，將蛋白質(zhì)進(jìn)行變性、定量、電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入一抗Wnt、β-catenin、p-β-catenin、TGF-β1、TIMP-2、MMP-2和GAPDH抗體(1∶1000)，4℃孵育過(guò)夜，加入二抗，室溫孵育2h，加入ECL試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡。使用Image Lab軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1ATR對(duì)大鼠眼部生物學(xué)參數(shù)的影響:與NC組相比，Model組右眼眼軸長(zhǎng)度和屈光度顯著增加(P<0.05)；與Model組相比，ATR組右眼眼軸長(zhǎng)度和屈光度顯著降低(P<0.05)；TAK-715組右眼眼軸長(zhǎng)度和屈光度顯著增加(P<0.05)；與ATR組相比，ATR+TAK-715組右眼眼軸長(zhǎng)度和屈光度顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠右眼生物學(xué)參數(shù)的比較

2.2ATR對(duì)大鼠鞏膜形態(tài)變化的影響:NC組大鼠鞏膜厚度正常，膠原纖維排列整齊，細(xì)胞外基質(zhì)分布均勻；與NC組相比，Model組鞏膜變薄，膠原纖維排列稀疏紊亂；與Model組比較，ATR組鞏膜厚度增加，膠原纖維直徑增加；TAK-715組鞏膜破碎分離，纖維和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)之間的空隙增大；與ATR組相比，ATR+TAK-715組鞏膜厚度減小，纖維排列紊亂，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠鞏膜組織病理變化(HE，×200)

2.3ATR對(duì)大鼠血清炎性因子的影響:與NC組相比，Model組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與Model組相比，ATR組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，TAK-715組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與ATR組相比，ATR+TAK-715組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β IL-6和TNF-α水平的比較

2.4ATR對(duì)大鼠鞏膜組織TGF-β1、MMP-2、TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響:與NC組比較，Model組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，ATR組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，TAK-715組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平顯著下降(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與ATR組相比，ATR+TAK-715組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平顯著下降(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠鞏膜組織中TGF-β1 MMP-2 TIMP-2 mRNA水平的比較

2.5ATR對(duì)大鼠鞏膜組織Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)的影響:與NC組比較，Model組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，ATR組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，TAK-715組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與ATR組相比，ATR+TAK-715組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表5，圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)鞏膜組織Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 各組大鼠鞏膜組織中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白水平的比較

3 討 論

近視已成為國(guó)際公共衛(wèi)生問(wèn)題，并給全球造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近視可造成鞏膜組織丟失，I型膠原降解增加，以及視網(wǎng)膜萎縮和脈絡(luò)膜萎縮等變化[9]。本研究結(jié)果顯示，與NC組比較，Model組大鼠鞏膜變薄，膠原纖維排列稀疏紊亂，眼軸長(zhǎng)度和屈光度顯著增加，表明形覺(jué)剝奪性近視大鼠模型構(gòu)建成功。ATR是從植物顛茄、曼陀羅或莨菪等提出的生物堿，被證明在減緩近視進(jìn)展方面始終有效[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，0.01% ATR滴眼液可以使近視進(jìn)展延遲，可能通過(guò)抑制鞏膜軟骨細(xì)胞中DNA和糖胺聚糖的合成實(shí)現(xiàn)。本研究中，ATR使鞏膜厚度增加，膠原纖維直徑增加，眼軸長(zhǎng)度和屈光度顯著降低，與先前的研究一致，驗(yàn)證了ATR對(duì)形覺(jué)剝奪性近視的改善作用。

眼軸增長(zhǎng)為導(dǎo)致近視的重要原因之一，而鞏膜外細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)重塑是眼軸增長(zhǎng)的重要原因，許多研究表明MMP-2與TIMP-2之間平衡被破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)重塑。TGF-β1可以通過(guò)上調(diào)TIMP-2表達(dá)或調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，MMP-2、TIMP-2以及TGF-β1可能是大鼠形覺(jué)剝奪性近視的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12]。另外，在近視眼網(wǎng)膜中，IL-6、TNF-α等炎癥因子上調(diào)，引發(fā)促炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致眼部炎癥[13]。本研究結(jié)果顯示，Model組大鼠鞏膜中存在炎癥反應(yīng)和胞外基質(zhì)重塑，而ATR組IL-1β、IL-6、TNF-α水平和MMP-2 mRNA水平和蛋白水平顯著降低，TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平以及蛋白水平顯著升高，表明ATR可能通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)、抑制胞外基質(zhì)重塑，對(duì)形覺(jué)剝奪性近視大鼠起到保護(hù)作用。

研究報(bào)道稱Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、纖維化和血管新生等生理病理過(guò)程，其異?；蛲蛔兣c近視密切相關(guān)，Wnt/β-catenin通路的活化通過(guò)調(diào)節(jié)鞏膜重塑，參與形覺(jué)剝奪性小鼠近視進(jìn)展[14]，而Wnt信號(hào)通路拮抗劑DKK-1可減少屈光不正者的近視轉(zhuǎn)移[15]。本研究中，與Model組比較，ATR組大鼠Wnt蛋白水平顯著降低、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平顯著升高，提示ATR可抑制形覺(jué)剝奪性近視大鼠鞏膜組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化。為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究利用Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑干預(yù)發(fā)現(xiàn)，與ATR組相比，ATR+TAK-715組鞏膜損傷加重，IL-1β、IL-6、TNF-α水平、MMP-2 mRNA水平及MMP-2、Wnt蛋白水平顯著增加，TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平顯著降低。表明TAK-715可減弱ATR對(duì)形覺(jué)剝奪性近視大鼠的保護(hù)作用，證實(shí)了ATR確實(shí)可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路，改善大鼠形覺(jué)剝奪性近視。

綜上所述，ATR可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路減輕炎癥反應(yīng)，抑制胞外基質(zhì)重塑，進(jìn)而改善大鼠形覺(jué)剝奪性近視。然而，ATR調(diào)控大鼠形覺(jué)剝奪性近視可能涉及其他通路，有待深入探究。