張日婷,趙弘卿,王洵,嚴(yán)玉蘭
據(jù)2021年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù),肺癌為40歲以上男性癌癥患者和60歲以上女性癌癥患者的主要死亡原因,病死人數(shù)超過乳腺癌、前列腺癌及大腸癌總和[1]。根據(jù)組織學(xué)類型和預(yù)后分類,非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌類型的85%,進(jìn)一步可細(xì)分為腺癌(44%)、鱗狀細(xì)胞癌(23%)、大細(xì)胞癌(4%)及未分型的肺癌(29%),其中肺腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢,在NSCLC中發(fā)病率最高[2]。circRNA于1976年首次在RNA病毒中發(fā)現(xiàn),由前體mRNA反向剪接循環(huán)產(chǎn)生,其3'和5'端相連形成共價閉環(huán)結(jié)構(gòu),無線性RNA 5'帽結(jié)構(gòu)或3'聚腺苷酸尾巴,比線性RNA更穩(wěn)定[3],有可能為多種疾病的生物標(biāo)記物。研究[4]表明,circRNA通過多種機制調(diào)節(jié)生物學(xué)過程,如作為海綿競爭miRNA反應(yīng)元件,調(diào)控相應(yīng)靶基因表達(dá)、調(diào)節(jié)RNA Pol II轉(zhuǎn)錄及指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。有證據(jù)[5]表明,許多物種的標(biāo)本中存在大量circRNA,在多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。circRNA的異常表達(dá)可能與肺腺癌的發(fā)病有關(guān)。
既往研究[6-7]表明,來源于RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子1(RUNX1) 的hsa_circ_0002360在多種腫瘤標(biāo)本中表達(dá)異常,如非小細(xì)胞肺癌、胃癌、舌鱗狀細(xì)胞癌,可通過靶向結(jié)合miR-629-3p,抑制抗癌基因PDLIM4表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。抑制hsa_circ_0002360可改善NSCLC對紫杉醇的耐藥性[8-9]。hsa_circ_0002360在肺腺癌中的生物學(xué)功能尚未完全闡明。與微陣列分析相比,高通量測序(RNA-seq)是一種可識別未知核苷酸序列的開放技術(shù),為探究circRNA的細(xì)胞類型特異性、組織特異性及其生物學(xué)功能提供了新的線索。本研究通過高通量測序方式,篩選肺腺癌組織異常表達(dá)的circRNA,并采用qRT-PCR技術(shù)放大樣本驗證測序結(jié)果,構(gòu)建circRNA/miRNA/mRNA(ceRNA)網(wǎng)絡(luò)互作圖分析部分circRNA與miRNA和mRNA的關(guān)系圖,采用克隆實驗、劃痕實驗及Tranwell侵襲實驗分析circRNA對肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響,為探索circRNA參與肺腺癌發(fā)病的機制提供參考。
1.1 一般資料 選取江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院胸外科接受部分或根治性手術(shù)的肺腺癌患者25例,其中男14例,女11例;平均年齡(67.0±4.1)歲;腫瘤分期:Ⅰ期5例,Ⅱ期6例,Ⅲ期8例,Ⅳ期6例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理確診為原發(fā)性肺腺癌;(2)術(shù)前未進(jìn)行化療、放療及其他輔助治療;(3)患者無高血壓、糖尿病或心血管疾病等基礎(chǔ)性疾?。?4)患者及其家屬知曉本試驗所有研究方案,并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他腫瘤的患者;(2)意識不清者;(3)臨床信息不完善。術(shù)中均切取患者肺腺癌組織和癌旁正常組織冷凍備用,其中5對標(biāo)本作為高通量測序,20對標(biāo)本作為qRT-PCR試驗。本項目經(jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。
1.2 方法
1.2.1 總RNA提取和質(zhì)量控制(QC) 使用TRIzol試劑(Ambion Life Technologies公司,美國)提取標(biāo)本總RNA。紫外分光光度儀NanoDrop 2000(Thermo Scientific公司,美國)檢測總RNA的濃度及質(zhì)量。合格標(biāo)準(zhǔn):OD260值/OD280值為1.8~2.1。儲存于-80 ℃冰箱備用。
1.2.2 circRNA高通量測序 選取1.2.1提取的5對總RNA標(biāo)本,采用Epicenter Ribo-Zero rRNA試劑盒(Illumina公司,美國)和RNase R酶(Epicenter公司,美國)先后處理總RNA,去除核糖體和線性RNA。將處理后的RNA裂解成片段,準(zhǔn)備cDNA合成和PCR擴增,并修飾末端和連接前體。采用TruSeq Stranded Total RNA HT/LT試劑盒(Illumina公司,美國)構(gòu)建高通量測序(RNA-seq)文庫,Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent 公司,美國)生物分析儀行質(zhì)量控制和評估。從Illumina HiSeq X10測序儀中獲取配對末端讀數(shù),Q30進(jìn)行質(zhì)量控制。在3'修剪后,使用Cutadapt軟件(版本1.9.3)刪除含N3序列的讀數(shù)小于50 bp或低質(zhì)量的reads。測序數(shù)據(jù)通過Bowtie2軟件[10]與人類基因組(NCBI xl_ref_ Xenopus_laevis_v2)比對,并使用Find_circ軟件(如CIRI)[11]識別circRNA。差異倍數(shù)fold change>2或<0.5,t檢驗P值<0.05表示表達(dá)存在差異。采用R軟件limma包(R版本3.3.1)處理數(shù)據(jù)。測序程序和數(shù)據(jù)分析由OE生物技術(shù)公司執(zhí)行(中國上海)。
1.2.3 qRT-PCR實驗 選取1.2.1提取的剩余20對總RNA標(biāo)本,采用qRT-PCR實驗檢測測序結(jié)果中異常表達(dá)倍數(shù)排名前10位(5個上調(diào)和5個下調(diào))的10個circRNA。circRNA的特異性引物由Generay Biotech公司(捷瑞生物工程有限公司,中國上海)設(shè)計,引物序列見表1。采用HiScript II Q RT SuperMix試劑盒合成cDNA(諾唯贊生物科技股份有限公司,中國南京),以cDNA為模板于LightCycle?480 II實時PCR儀器(Roche,瑞士)上行實時PCR實驗。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算2組間差異circRNA。所有實驗重復(fù)三次后分析數(shù)據(jù)。
表1 qRT-PCR circRNA引物
1.2.4 生物信息學(xué)分析 選取高通量測序中肺腺癌組織異常表達(dá)倍數(shù)排名前5位的5個上調(diào)circRNA,構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)。采用miRanda軟件預(yù)測circRNA的靶向miRNA,TargetScan、RegRNA及miRTarBase軟件預(yù)測miRNA與circRNA、mRNA間的靶向互作關(guān)系。Cytoscape軟件繪制circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)圖。
1.2.5 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞中心,中國上海),接種于6孔板中,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長融合至50%后,分為空白對照組(正常A549細(xì)胞,空白對照組)、陰性對照組(siRNA對照組)及實驗組(轉(zhuǎn)染si-hsa_circ_0002360的A549細(xì)胞,siRNA組),分別以LipoFiter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、si-NC試劑及si-circRNA試劑轉(zhuǎn)染稀釋、混合后加入人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中[12],qRT-PCR檢測陰性對照組和實驗組細(xì)胞中hsa_circ_0002360表達(dá)水平。
1.2.6 克隆實驗 取各組對數(shù)生長期細(xì)胞接種至6孔板中,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d換液1次,待再次干預(yù),磷酸鹽平衡生理鹽水(PBS)清洗3次,每孔加入多聚甲醛1 mL,置于4 ℃冰箱內(nèi)固定細(xì)胞30 min,PBS再清洗3次,每孔加入結(jié)晶紫1 mL,常溫染色10 min,PBS清洗至背景干凈,靜置干燥。記錄細(xì)胞克隆數(shù),克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù))×100%。每組實驗重復(fù)3次。
1.2.7 細(xì)胞劃痕實驗 取各組對數(shù)生長期細(xì)胞接種至6孔板中,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞單層貼壁達(dá)90%時,取無菌10 μL槍頭沿直線每孔劃2條線,PBS清洗3次,去除脫落細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h,分別于劃痕后0、24 h用顯微鏡觀察拍照,ImageJ軟件分析遷移能力。
1.2.8 Transwell侵襲實驗 采用鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室測量細(xì)胞侵襲能力。小室下層加入含有10% FBS的培養(yǎng)基,將懸浮在不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)基中的各組細(xì)胞(5×104細(xì)胞/孔)接種到上層小室中,于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h,棉簽去除上層小室中細(xì)胞,4%多聚甲醛固定濾膜另側(cè)細(xì)胞30 min, 0.1%結(jié)晶紫染色10 min。統(tǒng)計9個視野中計數(shù)細(xì)胞,并在顯微鏡下以400×放大倍數(shù)拍照。
2.1 高通量測序肺腺癌患者的一般資料 本研究選取5例肺腺癌患者的癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行高通量RNA測序,5例患者的臨一般資料見表2。
表2 高通量測序肺腺癌患者的一般資料
2.2 circRNA高通量測序結(jié)果 測序結(jié)果顯示,肺腺癌組織中285個circRNA表達(dá)異常(差異倍數(shù)>2.0或<0.5,P值<0.05),其中102個circRNA表達(dá)上調(diào),183個circRNA表達(dá)下調(diào)(圖1A,1B)。
1A 肺腺癌組織(Y軸)與癌旁正常組織(X軸)間cricRNA表達(dá)差異的散點圖 1B 2組間異常表達(dá)circRNA的火山圖圖1 高通量測序中2組標(biāo)本異常表達(dá)circRNA 分布圖
2.3 肺腺癌組織和癌旁正常組織間circRNA表達(dá)水平比較 采用qRT-PCR實驗檢測20對肺腺癌組織和癌旁正常組織中高通量測序結(jié)果差異表達(dá)倍數(shù)前10位的10個circRNA(5個上調(diào)和5個下調(diào))表達(dá)水平。其中2個circRNA引物設(shè)計不成功,在qRT-PCR實驗中移除。結(jié)果顯示,肺腺癌組織中hsa_circ_0000264、hsa_circ_0039-161、hsa_circ_0002360及hsa_circ_000-6276表達(dá)高于癌旁正常組織, hsa_circ_0004062、hsa_circ_0004417、hsa_circ_0001320及hsa_circ_0004777表達(dá)低于癌旁正常組織,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2A),且異常表達(dá)方向與高通量測序結(jié)果一致(圖2B)。hsa_circ_0002360為表達(dá)差異倍數(shù)最高的circRNA。
2.4 生物信息學(xué)分析 選取高通量測序結(jié)果中肺腺癌組織表達(dá)上調(diào)差異倍數(shù)前5位的5個circRNA構(gòu)建circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)互作圖。結(jié)果顯示, 5個表達(dá)上調(diào)circRNA對應(yīng)28個靶向miRNA, 82個相關(guān)mRNA。其中與hsa_circ_0002360結(jié)合的miRNA有has-mi-6769b-5p、has-mi-3147、has-mi-3620-5p、has-mi-296-3p、has-mi-1268b、has-mi-684、has-mi-6848-5p、has-mi-762及has-mi-4739,同其相關(guān)的mRNA有WARS、PHF19、HILPDA、EPB41、MSN、PRELP、PDE4A、PHLDA2、ARHGAP40、TET3、SYNGR2及PODXL。
2A 2組肺組織中circRNA表達(dá)水平(*P<0.05, **P<0.01) 2B RNA-Seq和qRT-PCR結(jié)果中10個circRNA中的差異倍數(shù)變化(FCs)圖2 肺腺癌組織和癌旁正常組織間circRNA表達(dá)水平比較
5A hsa_circ_0002360沉默后3組A549細(xì)胞克隆增殖視野 5B 3組細(xì)胞增殖結(jié)果比較柱狀圖(P<0.05) 5C hsa_circ_0002360沉默后3組A549細(xì)胞遷移視野 5D 3組細(xì)胞遷移結(jié)果比較柱狀圖(P<0.05) 5E hsa_circ_0002360沉默后3組A549細(xì)胞侵襲視野 5F 3組細(xì)胞侵襲結(jié)果比較柱狀圖(P<0.05)圖5 Hsa_circ_000236沉默后肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力變化圖(*P<0.05)
圖3 circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)互作圖
2.5 si-RNA干預(yù)對肺腺癌細(xì)胞株hsa_circ_0002360表達(dá)的影響 在A549細(xì)胞中,實驗組hsa_circ_0002360表達(dá)低于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。
2.6 hsa_circ_0002360沉默對A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響 克隆實驗表明,實驗組肺腺癌細(xì)胞增殖率低于空白對照組和陰性對照組(圖5A、5B)。劃痕實驗結(jié)果提示,實驗組A549細(xì)胞遷移能力低于空白對照組和陰性對照組(圖5C、5D)。Transwell侵襲實驗表明,實驗組細(xì)胞侵襲力低于空白對照組和陰性對照組(圖5E、5F)。
圖4 si-RNA干預(yù)后2組細(xì)胞株hsa_circ_000236表達(dá)水平柱狀圖(*P<0.05)
肺癌有效治療方法仍為外科手術(shù)治療,而臨床上約65%的NSCLC患者確診時已處于中晚期,錯過最佳手術(shù)治療時機。NSCLC 5年生存率不足15%,關(guān)于NSCLC發(fā)生和發(fā)展的機制仍不清楚[13]。隨著新一代測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,circRNA在真核細(xì)胞中的調(diào)控功能開始受到關(guān)注。研究[14]表明,circRNA參與多種疾病發(fā)病過程,包括自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及多種腫瘤,可能為新的生物標(biāo)記物和潛在的治療靶點。
circRNA可能與腫瘤發(fā)病、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有關(guān)。circRNA BIRC6通過海綿吸附作用吸附miRNA-145,影響NSCLC細(xì)胞增殖[15];circRNA-CHD2競爭性結(jié)合miRNA-30e-3p,上調(diào)MDM2靶向癌基因,抑制腫瘤抑癌基因TP53表達(dá),從而調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[16];circ0072088通過調(diào)節(jié)miR-545-3p/STAT3軸,促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[17]。然而,circRNA在肺腺癌發(fā)病中的作用機制尚不明確。
本研究通過高通量測序篩選人肺腺癌組織中異常表達(dá)circRNA譜。結(jié)果顯示,肺腺癌組織中共有102個circRNA表達(dá)上調(diào),183個表達(dá)下調(diào)。差異倍數(shù)排名前5位上調(diào)circRNA為hsa_circ_0000264、hsa_circ_0039161、hsa_circ_0002360、hsa_circ_0006276及hsa_circ_0009128,前5位下調(diào)circRNA為hsa_circ_0004062、hsa_circ_0004417、hsa_circ_0003176、hsa_circ_0001320及hsa_circ_0004777。放大樣本后qRT-PCR實驗結(jié)果與測序結(jié)果一致。其中hsa_circ_0002360差異倍數(shù)最高,猜測hsa_circ_0002360與肺腺癌發(fā)病相關(guān)。
circRNA可通過海綿吸附作用結(jié)合靶向miRNA或蛋白質(zhì),影響疾病進(jìn)展[18]。如circPRKCI包含miR-545和miR-589結(jié)合位點,能夠通過海綿吸附作用競爭性結(jié)合miR-545和miR-589,抑制其活性,從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[19];circTP63通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FoxM1表達(dá),影響肺鱗癌進(jìn)展[20];hsa_circRNA_104348通過調(diào)節(jié)miR-187-3p/RTKN2軸和激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)肝癌進(jìn)展[21]。本研究中ceRNA網(wǎng)絡(luò)互作圖分析顯示,hsa_circ_0002360可與多個miRNA靶向結(jié)合,提示hsa_circ_0002360可能通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系抑制靶向miRNA,從而影響靶基因的表達(dá),最終參與肺腺癌的發(fā)病機制。
腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移影響腫瘤分化程度,且影響腫瘤患者預(yù)后,術(shù)后多需輔以放療或化療,降低復(fù)發(fā)風(fēng)險。circRNA惡性腫瘤中以腫瘤抑制因子或致癌因子方式參與發(fā)病,如hsa_circ_0000467參與胃癌發(fā)病過程,表達(dá)水平與胃癌腫瘤分期存在相關(guān)性,沉默hsa_circ_0000467可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲,被認(rèn)為是潛在的胃癌預(yù)后標(biāo)志物[22]。食道癌患者血漿癌基因SMAD7的circ-SMAD7表達(dá)下調(diào),與TNM分期呈負(fù)相關(guān),circ-SMAD7過表達(dá)可抑制食道癌細(xì)胞的遷移和增殖,而circ-SMAD7沉默后作用相反[23]。本研究中三代高通量測序結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果均顯示,肺腺癌組織hsa_circ_0002360差異倍數(shù)最高;hsa_circ_0002360體外功能實驗表明,hsa_circ_0002360影響肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。推測hsa_circ_0002360可作為致癌因子,增強肺腺癌細(xì)胞的惡性程度。
本研究存在不足之處,如qRT-PCR樣本量偏少,測序結(jié)果驗證說服力有限;未能對差異表達(dá)的每個circRNA進(jìn)行大樣本驗證;網(wǎng)絡(luò)互作圖僅分析了差異倍數(shù)前5位的circRNA與miRNA/mRNA的靶向互作關(guān)系;基因沉默僅探索了hsa_circ_0002360對腫瘤細(xì)胞活性的影響,而其表達(dá)是否與肺腺癌的分化程度、預(yù)后、其他病理類型肺癌及肺部疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性未深入探討。盡管如此,本研究結(jié)果可為circRNA參與肺腺癌發(fā)病機制的闡明提供了重要信息。
綜上所述,circRNA在肺腺癌組織表達(dá)異常,其中hsa_circ_0002360表達(dá)差異倍數(shù)最高,hsa_circ_0002360參與肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移過程可能為肺腺癌患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點。