人巨細(xì)胞病毒UL133基因型導(dǎo)致兒童肝功能損傷的機(jī)制研究

顧盼盼，張慧，桑旭，羅厚江

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染是新生兒期及嬰幼兒期常見的病毒感染性疾病之一。作為HCMV唯一宿主的人類，巨細(xì)胞病毒可以潛伏在唾液、乳汁、腎臟以及造血系統(tǒng)等不同類型的體液和各個(gè)臟器中，其傳播方式亦多種多樣，例如呼吸道、輸血、哺乳、分娩及不潔性交等。30%～40%嬰幼兒肝炎綜合征的病原體是HCMV[1]，而且其臨床表現(xiàn)輕重不一，從無(wú)癥狀感染到膽汁淤積肝炎甚至膽道閉鎖，均可出現(xiàn)。具體表現(xiàn)為皮膚顏色黃染、尿色變深、糞便顏色變淺呈白陶土樣、膽紅素及轉(zhuǎn)氨酶異常升高，甚至發(fā)生肝硬化、肝功能衰竭致死，尤其多見于亞裔患者[2-4]。HCMV病毒中有幾百個(gè)基因型，其中與HCMV的毒力關(guān)系最為密切的是UL133基因型，是誘發(fā)嬰幼兒出現(xiàn)肝功能損害的重要危險(xiǎn)因素，但其具體發(fā)生機(jī)制尚不明朗。溫正旺等[5]報(bào)道顯示，嬰幼兒HCMV肝損傷與Caspase家族蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路關(guān)系密切。本課題先通過建立幼鼠UL133肝損傷模型，檢測(cè)每組幼鼠肝臟細(xì)胞的凋亡情況、UL133RNA、Caspase-3、Caspase-6及Toll 樣受體4(TLR4)的蛋白含量，隨后進(jìn)行臨床驗(yàn)證，監(jiān)測(cè)2組患兒尿液UL133陽(yáng)性率及血液Caspase-3、Caspase-6表達(dá)水平，探索HCMV-UL133基因型導(dǎo)致嬰幼兒肝損傷的內(nèi)在分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 購(gòu)買領(lǐng)航生物科技有限公司(中國(guó)上海)的3～4周齡健康雌性SD幼鼠共30只，初始體質(zhì)量100±10 g，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK20180003。蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)了所有動(dòng)物研究(批準(zhǔn)文號(hào)：AM-SU-AP#：JP-2018-1)。將上述幼鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只?？瞻捉M經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水；對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注入100μl空載的腺病毒；實(shí)驗(yàn)組在PubMed中搜索螢光素酶(luciferase)基因的CDS區(qū)域，合成并構(gòu)建到PLVX-EF1a-puro載體中，在pLKO.1-puro慢病毒載體(IGE BIOTECHNOLOGY LTD，廣州，中國(guó))中構(gòu)建靶向U133-PLVX-EF1a-puro。6 h后，將培養(yǎng)基完全更換為新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后收集病毒上清液，用0.22 μm濾器過濾。取攜帶UL133基因型的慢病毒500 μL的原液加入0.9%生理鹽水1 mL稀釋為1.5 mL，隨后向每只幼鼠的尾靜脈中注入100 mL，濃度滴度：2.0×1012，飼養(yǎng)7日使藥物穩(wěn)定。

1.2 選擇患兒對(duì)象 選取2019年5月—2022年5月蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科收住的HCMV伴有肝功能損害患兒66例為肝損害組，64例無(wú)肝功能異常為無(wú)肝損害組。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患兒診斷標(biāo)準(zhǔn)符號(hào)2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)制定的《巨細(xì)胞病毒感染診斷方案》[6],經(jīng)熒光定量PCR定量檢測(cè)尿液確診為HCMV病毒感染,均為初發(fā)未經(jīng)抗病毒及免疫抑制劑治療病例。排除標(biāo)準(zhǔn)；所有患兒均排除先天性膽道閉鎖、消化道畸形、其他類型病毒性肝炎(如甲、乙、丙肝炎病毒、EB、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒等感染所致的肝炎)、遺傳代謝性疾病及藥物性肝炎等。本研究均詳細(xì)告知患兒監(jiān)護(hù)人，取得其同意后簽署知情同意書，蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)報(bào)備后通過。2組患兒初始臨床資料比較，見表1。

表1 2組患兒初始臨床資料比較

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)開始7日后將魯米諾(Luminol)(武漢德晟生化科技有限公司，CAS521-31-3)，注射到每只小鼠的腹腔內(nèi)，并立即用異氟醚氣體麻醉。使用NightOWL體內(nèi)成像系統(tǒng)(BERTHOLD，德國(guó))對(duì)每組幼鼠進(jìn)行成像，確認(rèn)其形成肝損傷模型。實(shí)驗(yàn)開始后第10天將SD幼鼠拉斷脊椎處死，立即取出幼鼠的肝臟，使用雙蒸水沖洗肝臟表面血液至潔凈，每組均取部分組織標(biāo)本固定于4%多聚甲醛24 h后，再施行石蠟包埋、切片，HE染色；剩余組織標(biāo)本放置于液氮罐中保存，采用RT-PCR方法檢測(cè)UL133 RNA，ELISA 檢測(cè)Caspase-3、Caspase-6及TLR4表達(dá)水平。

1.3.2 幼鼠肝臟細(xì)胞HE染色及凋亡監(jiān)測(cè) 觀察幼鼠肝臟的病理改變，對(duì)肝臟標(biāo)本進(jìn)行HE染色；使用原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒(購(gòu)自羅氏公司)，根據(jù)試劑盒里提供的操作流程進(jìn)行細(xì)胞核熒光染色。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈綠色熒光，隨機(jī)挑選出3個(gè)高倍視野(x400)，并對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞×100%。

1.3.3 幼鼠肝臟UL133RNA測(cè)定 Trizol試劑購(gòu)自北京普利萊基因有限公司，按照說明書的指示抽提RNA，并測(cè)定RNA濃度。RT-PCR劑盒(購(gòu)自Fermentas公司)，根據(jù)說明書要求向96孔板中加入引物(引物由上海基康生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成，并檢驗(yàn)合格)、SYBR Green I、模板，液體的總體積是20μl，混勻后進(jìn)行RT-PCR過程，使用Lightcycler48015.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1A 空白組 1B 對(duì)照組 1C 實(shí)驗(yàn)組圖1 3組小鼠肝臟的熒光信號(hào)強(qiáng)度圖

2A 空白組 2B 對(duì)照組 2C 實(shí)驗(yàn)組圖2 3組幼鼠肝臟的HE染色圖(HE染色X100)

3A 空白組 3B 對(duì)照組 3C 實(shí)驗(yàn)組圖3 3組小鼠肝細(xì)胞凋亡情況

1.3.4 幼鼠肝臟Caspase-3、Caspase-6、TLR4水平測(cè)定 應(yīng)用ELISA試劑盒(購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司)檢測(cè)幼鼠肝臟中Caspase-3、Caspase-6及TLR4的水平；抗Caspase-3(220509-74-0)、Caspase-6(ab39707)及TLR4(76B357.1)抗體均購(gòu)自Abcom公司。ELISA試劑盒從冰箱中取出后放置在室溫環(huán)境下30 min，隨后向每個(gè)孔中加入50 uL的勻漿/標(biāo)準(zhǔn)樣品，用薄膜覆蓋微孔板，室溫下孵育2 h，隨后進(jìn)行4次洗板，輕輕甩干后;每個(gè)孔加入50 μL抗Caspase-3、Caspase-6和TLR4抗體并及時(shí)封板，再次室溫孵育2h，完成4次洗板并徹底甩干后，每個(gè)孔先后顯色劑A液和B液(A液和B液按照1:1配比)，避光常溫靜置30 min;加入終止液100 μL，450 nm處測(cè)定吸光度值(OD);橫坐標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)是OD值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算Caspase-3、aspase-6及TLR4的表達(dá)水平。

1.3.5 患兒尿液UL133基因型及血液Caspase-3、Caspase-6的測(cè)定 留取患兒的尿液10 mL，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)明確尿液中的HCMV是否含有UL133基因型。抽取患兒靜脈血液3 mL，采用ELISA試劑盒(美國(guó)PeproTech公司)檢測(cè)，酶標(biāo)孔中提前包被Caspase-3、Caspase-6的單克隆抗體溫育;隨后加入使用生物素標(biāo)記的相關(guān)抗體，與鏈霉親和素相互結(jié)合形成免疫復(fù)合物后溫育、洗滌和甩干后，顯色劑A液和B液(A液和B液按照1∶1配比)，避光常溫靜置30 min;加入終止液100 μL，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和相應(yīng)的OD值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算Caspase-3、Caspase-6表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 3組幼鼠肝臟的熒光信號(hào)強(qiáng)度比較 實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)強(qiáng)度為(12 423.68±3 334.19)CPS，高于空白組[(6.31±2.13)CPS]和對(duì)照組[(7.52±2.58)CPS]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P<0.05))，而空白組和對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05)。見圖1。

2.2 3組幼鼠肝臟HE染色情況 光學(xué)顯微鏡下顯示：空白組和對(duì)照組肝臟細(xì)胞形態(tài)基本正常，而實(shí)驗(yàn)組的肝臟細(xì)胞變性，細(xì)胞核固縮。見圖2。

2.3 3組幼鼠肝細(xì)胞凋亡情況 實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞的凋亡指數(shù)為(10.96±0.52)，高于空白組(2.39±0.27)及對(duì)照組(2.32±0.21)(P<0.05))，空白組和對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4 3組幼鼠肝臟組織UL133RNA、Caspase-3、Caspase-6及TLR4的表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組的UL133RNA、Caspase-3、Caspase-6及TLR4表達(dá)量高于空白組及對(duì)照組(P<0.05)，而空白組和對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.5 2組患兒尿液UL133陽(yáng)性率及血液Caspase-3、Caspase-6表達(dá)水平比較 肝損害組尿液中UL133陽(yáng)性率、血液中Caspase-3、Caspase-6表達(dá)水平均高于無(wú)肝損害組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 3組幼鼠肝臟組織UL133、Caspase-3、Caspase-6及TLR4的表達(dá)量比較

表2 2組患兒尿液UL133陽(yáng)性率及血液Caspase-3、Caspase-6表達(dá)水平比較

3 討論

巨細(xì)胞病毒感染是一種常見的病毒性傳染病，在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率較高。相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]顯示，孕產(chǎn)婦巨細(xì)胞病毒抗體檢測(cè)的陽(yáng)性率最高可達(dá)95%。妊娠期間攜帶有巨細(xì)胞病毒后可誘發(fā)胎兒的宮內(nèi)感染，進(jìn)而導(dǎo)致不良產(chǎn)科事件，如死胎、宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等，使新生兒出現(xiàn)血液系統(tǒng)、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)等臟器的損傷[9]，危及孕產(chǎn)婦、胎兒和新生兒的健康。新生兒和嬰幼兒的巨細(xì)胞病毒檢測(cè)陽(yáng)性率2%左右[10-11]，而且巨細(xì)胞病毒感染臨床表現(xiàn)缺乏特異性，所以現(xiàn)有的診斷手段已不能滿足臨床需求，運(yùn)用分子診斷和基因診斷勢(shì)在必行。

研究[12-13]表明，巨細(xì)胞病毒的毒性和感染性強(qiáng)弱主要受到UL基因家族的β區(qū)的調(diào)控，其中以UL133、UL144及UL146調(diào)控作用最強(qiáng)。目前，調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚，本研究向幼鼠的尾靜脈注射UL133后會(huì)出現(xiàn)不同程度的變性甚至壞死，TUNEL法提示細(xì)胞凋亡，表明UL133的基因片段會(huì)致使幼鼠肝細(xì)胞變性、壞死和凋亡。有研究[14-16]顯示，巨細(xì)胞病毒感染引起的肝功能損傷與Caspase家族蛋白關(guān)系密切，但Caspase家族蛋白成員眾多，功能復(fù)雜，每一個(gè)Caspase蛋白所形成的機(jī)制不盡相同。比如，Caspase-3主要參與的是細(xì)胞外信號(hào)凋亡路徑，Caspase-6參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶誘發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡途徑，Caspase-9卻是介導(dǎo)的線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡路徑。研究[17-19]表明，HCMV感染可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶所致應(yīng)激反應(yīng)，最終引起了肝臟受損。本研究發(fā)現(xiàn)，UL133進(jìn)入SD幼鼠體內(nèi)導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷乃至凋亡，可以推測(cè)UL133與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶誘發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)之間存在相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)組Caspase-3水平高于其他2組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Caspase-3可以直接參與細(xì)胞凋亡。所以我們認(rèn)為，UL133可能通過激活Caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)通路引發(fā)肝細(xì)胞的程序性死亡。另外，有研究[20]顯示，HCMV導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過程中，TLR家族蛋白發(fā)揮了炎癥誘發(fā)劑的作用，其中尤以TLR4的作用最為明顯，許永杰等[21]研究發(fā)現(xiàn)TLR4主要通過Caspase系列蛋白酶的激活起作用。本研究實(shí)驗(yàn)組TLR4的表達(dá)水平高于其他2組，提示感染病毒后，TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路可能被激活，進(jìn)一步誘發(fā)Caspase-3、Caspase-6等凋亡蛋白激活，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。

肝臟在全身各個(gè)系統(tǒng)中是最易受到HCMV攻擊的器官之一。研究[12-13]顯示HCMV是嬰兒肝炎綜合征最常見的病原體之一，其檢測(cè)陽(yáng)性率甚至可高達(dá)60%以上。HCMV大多數(shù)情況下聚集在肝膽管上皮及內(nèi)皮細(xì)胞中，在白細(xì)胞吸附、吞噬作用和抗原呈遞等復(fù)雜過程之后，各種細(xì)胞因子和免疫介質(zhì)共同作用，最終導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)損害肝臟。本研究發(fā)現(xiàn)肝損害組患兒UL133基因型陽(yáng)性率、Caspase-3及Caspase-6蛋白水平高于無(wú)肝損害組，這與以上研究相符合，即Caspase系列蛋白表達(dá)升高可直接導(dǎo)致肝炎病人的肝臟細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)黃疸、轉(zhuǎn)氨酶升高等一系列臨床表現(xiàn)。

綜上所述，攜帶有UL133基因型的HCMV感染嬰幼兒后，可能激活TLR4路徑并介導(dǎo)Caspase-3和Caspase-6參與HCMV誘發(fā)肝損傷的病理生理過程，從內(nèi)部揭示HCMV UL133基因型引起肝功能損傷的病理生理機(jī)制，但本研究雖然發(fā)現(xiàn)在給小鼠注射UL133后，體內(nèi)與細(xì)胞凋亡因子相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生了比較明顯的變化，但仍需進(jìn)一步研究TLR4與Caspase-3和Caspase-6的相關(guān)性，從而為HCMV基因型與體內(nèi)肝功能損傷的內(nèi)在相關(guān)性提供分子理論依據(jù)。