PH敏感型阿霉素/CTLA-4 siRNA納米載體抑制腎細胞癌的生長*

拜合提亞·阿扎提 李前進 劉強 王玉杰

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 烏魯木齊 830054)

近年來，腎細胞癌已占全球癌癥相關(guān)死亡2%以上[1-2]，它分為幾種主要和罕見的亞型。腎透明細胞癌亞型是腎細胞癌中最常見、侵襲性最強的亞型[3-5]。雖然大多數(shù)原位腎細胞癌患者可以通過手術(shù)進行治療，但術(shù)后全約有四分之一的患者會復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[6-7]，因此需要探索額外的治療方案。有研究顯示，阿霉素可引起腫瘤細胞的免疫原性細胞死亡，誘導(dǎo)抗原特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，可與免疫檢查點抑制劑或免疫佐劑聯(lián)合使用，增強全身抗腫瘤免疫，減少轉(zhuǎn)移[8-10]。在所有免疫檢查點抑制劑中，CTLA-4抗體最早被批準(zhǔn)用于治療包括腎細胞癌在內(nèi)的多種癌癥[11]。然而，CTLA-4抗體在臨床應(yīng)用過程中存在響應(yīng)率低和毒副作用較大等缺陷[12]。因此，利用小干擾RNA(Small interfering RNA, siRNA)直接敲除免疫檢查點CTLA-4是很好的選擇[13]。為了實現(xiàn)高效的CTLA-4 siRNA和阿霉素的共同遞送，本研究設(shè)計了對PH敏感的共包封納米載體，進而探究該阿霉素/CTLA-4 siRNA納米載體復(fù)合物是否可以激活抗腫瘤免疫并抑制腎透明細胞癌的生長。

1 材料與方法

1.1 細胞系、動物和主要試劑 RENCA細胞購自武漢普諾賽生物有限公司；Fluc-RENCA細胞由本實驗室先前構(gòu)建保存。細胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。35只雌性Balb/c小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，小鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，保證小鼠充足進食飲水，所有動物實驗通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。4 -羧基苯甲醛、PCL-OH、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基丁二酰亞胺 (NHS)、二甲氨基吡啶 (DMAP)、二氯甲烷(DCM)、四氫呋喃(THF)購自北京百靈威科技有限公司；PEG, PEG-NH2和三乙胺(TEA) 購自北京鍵凱科技有限公司。阿霉素(doxorubicin, Dox)購自武漢德美凱生物科技有限公司；si-CTLA-4由上海吉瑪科技有限公司合成，序列為5′-TACTTTGTGGGCATGGGCTT-3′。RIPA試劑、ECL發(fā)光試劑、熒光素酶底物、DAB顯色試劑購自碧云天生物科技有限公司；兔抗CTLA-4、兔抗IFN-γ、兔抗Ki67購自Abcam公司；兔抗GAPDH和山羊抗兔二抗購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 LDs和P-LDs的合成 以4-羧基苯甲醛和PCL-OH為原料，經(jīng)羥基酯化反應(yīng)合成PCL-CHO。4-羧基苯甲醛(2.5 mmol)， EDC(5 mmol)， NHS(2.5 mmol)和DMAP (1.5 mmol)溶于DCM∶THF=3∶1的混合液中, 30℃反應(yīng)1 h。之后加入PCL-OH(0.5 mmol)反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后,溶液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，殘留物溶于DCM，過濾去除多余4-羧基苯甲醛。將剩余的澄清溶液濃縮后倒入冷甲醇中，沉淀過濾后用甲醇洗滌，真空干燥得到PCL-CHO。將PCL-CHO (0.5 mmol)、PEG或PEG-NH2(0.75 mmol)和TEA (2.5 mmol)溶于10 mL DCM中反應(yīng)48 h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，將殘渣溶于THF中，滴入超純水中。在超純水(pH 7.4)中透析(MWCO=8 kDa)24 h，去除游離的PEG，然后離心去除未反應(yīng)的PCL-CHO。凍干后，得到PCL-PEG或PCL-N-PEG。將25 mg PCL-PEG或PCL-N-PEG與2mg Dox溶于5 mL DCM，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，得到Dox膠束，將siRNA和Dox膠束輕輕混合(膠束∶siRNA=2000∶1，摩爾比)，即得到LDs或P-LDs。

1.3 電鏡觀察P-LDs及差示掃描量熱法檢測P-LDs的粒徑 將Lipo、LDs和P-LDs分別滴加到銅網(wǎng)上，讓液滴充分鋪開，室溫靜置30 min。小心除去多余液體，加入2%的磷鎢酸復(fù)染后在室溫下干燥過夜。 使用透射電子顯微鏡(JEM-2100，Hitachi，Japan)在200kV的電壓下觀察樣品。對于粒徑檢測，將Lipo、LDs和P-LDs分別加入小鼠血漿中，在1、2、4、8、12、24 h取樣，按照儀器使用流程采用差示掃描量熱法測定它們的平均粒徑。

1.4 流式細胞術(shù)檢測脾淋巴細胞對P-LDs的攝取 分離小鼠脾臟，使用70 μm濾網(wǎng)過濾細胞勻漿，使用小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒的說明操作，得到小鼠脾淋巴細胞。在24孔板(106個/孔)中接種的脾淋巴細胞，在pH為7.4和pH為6.8的RPMI 1640中分別加入1.32 μg/mL si-CTLA-4的LDs、P-LDs、siRNA及商品化的陽離子轉(zhuǎn)染試劑+siRNA孵育2 h，離心洗滌收集細胞，200 μL PBS重懸細胞，使用LSR II細胞儀(BD，USA)進行檢測，并用FACS DIVA軟件v8.0進行分析。

1.5 Western blot檢測P-LDs對脾淋巴細胞中CTLA-4表達的影響 在pH 7.4或pH 6.8條件下，用1.32 μg/mL si-CTLA-4的LDs、P-LDs及siRNA分別轉(zhuǎn)染脾淋巴細胞。培養(yǎng)48 h后，使用RIPA裂解液裂解細胞，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，采用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，使用兔抗小鼠CTLA-4抗體(1∶2000)及兔抗小鼠GAPDH抗體(1∶1000)在4℃孵育過夜，使用山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，使用ECL發(fā)光液在ChemiDocTM成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)進行成像。蛋白條帶經(jīng)Image J軟件定量。

1.6 活體成像法檢測P-LDs的體內(nèi)分布 在雌性Balb/c小鼠左側(cè)腋下接種5×105個RENCA細胞，建立Balb/c小鼠皮下腎癌模型。接瘤后7天，通過尾靜脈注射Lipo、LDs和P-LDs (2 mg/kg)。24 h后使用IVIS?Spectrum系統(tǒng)(Caliper, hopkins, USA)對小鼠器官進行成像。

1.7 皮下移植瘤模型檢測P-LDs的體內(nèi)抗腫瘤活性 將表達螢火蟲熒光素酶的RENCA細胞(Fluc-RENCA)( 5×105個/只)接種到小鼠的左測腋下。待腫瘤體積達到100 mm3左右，隨機分為4組，每組5只，通過尾靜脈每隔3天注射PBS、Dox+si-CTLA-4、LDs和P-LDs (回輸量均換算為Dox:2 mg/kg, si-CTLA-4:0.32 mg/kg)。每2天記錄小鼠體重和腫瘤體積。根據(jù)以下公式計算腫瘤體積:V = L×W2/2(L，最長維度;W，最短維度)。在第23天使用IVIS?Spectrum系統(tǒng)對小鼠進行成像。

1.8 免疫組化法檢測腫瘤組織中CTLA-4、IFN-γ和Ki67的含量 分離的腫瘤組織在4%多聚甲醛中固定48 h，經(jīng)過脫水、浸蠟、包埋后，切成6 μm厚的切片，切片經(jīng)復(fù)水后使用pH9.0的Tris-EDTA緩沖液抗原修復(fù)20 min，使用5%山羊血清室溫封閉2 h，使用兔抗小鼠CTLA-4抗體(1∶200)、兔抗小鼠IFN-γ抗體(1∶100)和兔抗小鼠Ki67抗體(1∶100)4℃孵育過夜，使用山羊抗兔二抗(1∶1000)室溫孵育1 h，使用DAB顯色液室溫避光顯色5 min，蘇木精復(fù)染2 min，封片后使用IXplore Standard(Olympus，Japan)進行觀察，使用Image Pro Plus軟件對陽性區(qū)域進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 P-LDs的構(gòu)建及特性分析 采用化學(xué)合成法獲得包裹Dox和si-CTLA-4的PH敏感型納米載體復(fù)合物P-LDs以及包裹Dox和si-CTLA-4的非PH敏感型納米載體復(fù)合物L(fēng)Ds，電鏡觀察結(jié)果顯示，脂質(zhì)體Lipo、LDs以及P-LDs在pH6.8和pH7.4時均具有均一的球形結(jié)構(gòu)，見圖1A。粒徑分析結(jié)果顯示，Lipo、LDs以及P-LDs在血漿中可以穩(wěn)定存在，粒徑保持在60 nm左右，見圖1B。

圖1 P-LDs的特性分析

2.2 P-LDs在低PH時可以有效介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染脾淋巴細胞 使用流式細胞術(shù)檢測Cy5標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染脾淋巴細胞的能力，結(jié)果顯示，市售陽離子轉(zhuǎn)染試劑和LDs在pH6.8和pH7.4時轉(zhuǎn)染的細胞熒光強度均較弱，P-LDs在pH7.4轉(zhuǎn)染細胞時熒光強度與其余各組無顯著差異，而在pH6.8轉(zhuǎn)染細胞時，熒光強度顯著提高(P<0.01)，圖2A、B。

圖2 P-LDs的細胞攝取

2.3 P-LDs在低PH時可以有效降低脾淋巴細胞中CTLA-4表達量 使用western blot檢測siRNA沉默CTLA-4的能力，結(jié)果顯示，LDs在pH6.8和pH7.4時轉(zhuǎn)染的細胞CTLA-4表達量較高，P-LDs在pH7.4轉(zhuǎn)染細胞時CTLA-4表達量與其余各組無顯著差異，而在pH6.8轉(zhuǎn)染細胞時，CTLA-4的表達量顯著降低(P<0.01)，見圖3A、B。

圖3 P-LDs對CTLA-4基因的沉默

2.4 P-LDs可以有效介導(dǎo)siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染腫瘤細胞 活體成像觀測P-LDs介導(dǎo)Cy5標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染體內(nèi)轉(zhuǎn)染能力，結(jié)果顯示，與Lipo組和LDs組相比，P-LDs組的熒光在腫瘤中積累最高(P<0.05)，而在其他主要臟器中的富集較低，見圖4A、B。

圖4 P-LDs的體內(nèi)生物分布

2.5 P-LDs顯著抑制腎癌細胞的體內(nèi)生長 活體成像結(jié)果顯示，P-LDs組相較于Dox聯(lián)合si-CTLA-4組及LDs組，腫瘤最小，見圖5A。瘤體積監(jiān)測數(shù)據(jù)也表明，P-LDs組的腫瘤生長被顯著抑制，見圖5B。

圖5 P-LDs的抗腫瘤活性

2.6 P-LDs組中CTLA-4和Ki67表達降低，IFN-γ含量顯著提升 免疫組化結(jié)果顯示，P-LDs組相較于Dox聯(lián)合si-CTLA-4組及LDs組，CTLA-4和Ki67表達降低(P<0.001)，見圖6A、圖6C。IFN-γ含量顯著提升(P<0.0001)，見圖6B。表明腫瘤微環(huán)境中免疫抑制較弱，抗腫瘤免疫活性較強，腫瘤細胞增殖被顯著抑制。

圖6 免疫組化分析(A) CTLA-4, (B) IFN-γ和(C) Ki67

3 討論

靶向免疫檢查點分子有望成為一種非常有效的抗腫瘤策略。目前，靶向CTLA-4的抗體已在黑色素瘤和腎細胞癌的治療中取得了成功[14]。CTLA-4/B7軸在宿主免疫監(jiān)視和腫瘤微環(huán)境調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，T細胞通常表達CTLA-4, 它和B7之間的相互會阻斷T細胞介導(dǎo)的癌細胞殺傷，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，抑制該通路可能促使T細胞釋放免疫效應(yīng)分子，產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)[15]。然而，腫瘤發(fā)生進展復(fù)雜，單一治療通常不能取得很好的療效。因此，許多臨床和臨床前研究集中在聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療、放療和免疫治療來治療癌癥。有研究顯示，阿霉素處理的腫瘤細胞可以被髓系和漿細胞樣樹突狀細胞高效吞噬，誘導(dǎo)抗原特異性CTL的激活，產(chǎn)生強烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)[8]。因此，本文旨在研究化療藥物阿霉素與Si-CTLA-4聯(lián)合應(yīng)用在腎透明細胞癌小鼠模型中對腫瘤細胞的影響。腎癌移植瘤模型顯示，給與P-LDs后可以顯著抑制腫瘤的生長，通過免疫組化染色，本文發(fā)現(xiàn)P-LDs處理的腫瘤組織中Ki67的水平明顯降低，表明腫瘤細胞的增殖顯著被抑制，與此同時，IFN-γ含量則顯著升高。已知IFN-γ是重要的抗腫瘤免疫效應(yīng)分子，其可以通過激活腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[16]。

對于非病毒基因傳遞系統(tǒng)，帶負(fù)電荷的siRNA通常通過靜電相互作用被陽離子載體包裹[17]。粒徑較小的陽離子載體有利于深入滲透至實體瘤內(nèi)部[18]。然而，陽離子載體存在著血液循環(huán)半衰期短[19]、非特異性細胞毒性、非特異性細胞攝取等問題[20]。內(nèi)源性刺激響應(yīng)的納米載體在平衡陽離子載體的優(yōu)缺點方面具有很大的潛力[21-22]。一些研究人員對陽離子載體進行了修飾，使PEG外殼響應(yīng)性分離，以延長體循環(huán)，增強腫瘤內(nèi)的滲透和積累[23]。本研究采用的PEG通過亞胺連接物與PCL偶聯(lián)，亞胺鍵對酸性非常敏感，在生理條件(pH7.4)下保持穩(wěn)定，但在酸性腫瘤微環(huán)境(pH 6.8)中容易被水解，從而釋放負(fù)載的阿霉素和si-CTLA-4，增強負(fù)載藥物在腫瘤部位的富集，降低脫靶效應(yīng)。體外轉(zhuǎn)染實驗顯示，在pH6.8時，包裹Cy5標(biāo)記的si-CTLA-4的P-LDs轉(zhuǎn)染效率比pH7.4時增加了7.7倍。體內(nèi)分布實驗也表明，P-LDs組腫瘤內(nèi)Cy5標(biāo)記的si-CTLA-4分別比LDs組和Lipo組高1.63和1.89倍。更強的腫瘤細胞靶向能力也帶來更好的CTLA-4基因的沉默效率。體外的western blot檢測及體內(nèi)的免疫組化結(jié)果都表明，P-LDs干預(yù)后CTLA-4的表達量都顯著降低。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)了PH敏感的納米載體復(fù)合物P-LDs，包含化療藥物阿霉素以及CTLA-4 siRNA，PEG外殼在PH 6.8時快速脫落，將阿霉素和si-CTLA-4高效傳遞給腫瘤細胞，增強其在腫瘤中的穿透和富集，從而增強局部抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生，抑制腎細胞腫瘤生長。