STR基因座突變對親子鑒定準(zhǔn)確性的影響探討

包杰 張靜 陳丹

河南省生殖健康科學(xué)技術(shù)研究院 河南事緣法醫(yī)物證司法鑒定所 河南 鄭州 450002

引言

STR即短串聯(lián)重復(fù)序列，又稱為見微衛(wèi)星DNA，核心序列包括2～7bp，屬于高度串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)在幾次到幾十次不等。短串聯(lián)重復(fù)序列符合孟德爾遺傳定律，在基因組內(nèi)有著廣泛的分布，存在著高雜合度以及高度多態(tài)性，檢測難度小，在目前的法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記中應(yīng)用十分廣泛，完全可以滿足親子鑒定以及個體識別的應(yīng)用需求。另一方面，因?yàn)镾TR基因座突發(fā)概率較大，在親子鑒定方面對結(jié)果的準(zhǔn)確性也有著一定的影響，必須要謹(jǐn)慎對待，將其帶來的不利影響降到最低。

1 STR基因座突變規(guī)律

1.1 STR突變規(guī)律

STR基因座現(xiàn)在常被用于親子鑒定，但是其突變率可以達(dá)到0～7×10-3，會對鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確率產(chǎn)生影響。為排除這一影響，就需要掌握STR的突變規(guī)律，提前做好預(yù)防和處理[1]。根據(jù)研究可以確定，STR基因座突變原因是DNA復(fù)制滑動，符合逐步突變模式。每次突變只有一個重復(fù)單位被改變，在上一次突變的基礎(chǔ)上可以繼續(xù)發(fā)生兩個或多個單位的變化，由此可確定多步突變是逐步形成的。

1.2 STR突變步數(shù)

STR等位基因發(fā)生突變，基本上均是重復(fù)單位數(shù)的改變，每個突變均對應(yīng)著一個或數(shù)個重復(fù)單位的增多/減少。超過90%的STR突變只有一個重復(fù)單位的增多/減少，為一步突變。二步突變的概率不足10%，可見多步突變的概率更小[2]。

1.3 STR突變來源

根據(jù)統(tǒng)計可確定STR突變主要來源于父方，可以達(dá)到母方的0.7～14倍，多數(shù)基因座為3～6倍。一旦STR基因座發(fā)生突變，將會造成重復(fù)單位數(shù)增加或減少，而這一概率父方與母方概率相同，只有較小的概率會增加重復(fù)單位。

1.4 STR突變率

影響STR基因座突變的重要因素是其多態(tài)性的高低，重復(fù)單位數(shù)目越多相應(yīng)的基因座長度就越長，多態(tài)性也會更高，因此發(fā)生突變的概率更高，如D21S11、FGA等。突變率與完整重復(fù)單位連續(xù)不間斷的長度幾何平均值為正相關(guān)，甚至是指數(shù)關(guān)系。

1.5 突變的等位基因

即便是一個基因座，等位基因之間的突變概率也有著較大的差異，主要是因?yàn)榈任换虻耐暾貜?fù)單位數(shù)不同。重復(fù)單位相同且連續(xù)相連，不被不完整重復(fù)單位打斷的較長的等位基因，發(fā)生突變的概率更高。此種重復(fù)序列在不同的位置均有可能出現(xiàn)復(fù)制滑動的情況。正常情況下，存在連續(xù)10個以上的重復(fù)單位更容易發(fā)生突變。

1.6 其他

隨著父親年齡的增大，STR基因組發(fā)生突變的概率會一定的增長。另外，經(jīng)過觀察X和Y染色體STR突變數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)性染色體STR突變規(guī)律以及突變率與常染色體STR突變沒有明顯差異。

2 STR基因座突變后非父排除率

在不考慮突變的情況下，檢測的一系列遺傳標(biāo)記中出現(xiàn)任何一個排除親子關(guān)系的概率即累積非父排除率。一旦STR基因組出現(xiàn)突變，便需要有至少兩個遺傳標(biāo)記才可以排除親子關(guān)系。經(jīng)過研究可以確定，檢測Power Plex 16系統(tǒng)允許三個基因座突變的累積費(fèi)父排除率＞0.99，檢測24個STR允許三個三個基因座突變的累積費(fèi)父排除率＞0.9999[3]。

3 STR基因座突變下父權(quán)指數(shù)計算

3.1 平均突變父權(quán)指數(shù)

在基因座發(fā)生突變的情況下，假如被檢測男子為真正生父，但是受突變影響出現(xiàn)排除親子關(guān)系分型結(jié)果的概率與突變率一致。被檢隨機(jī)男子并非生父，出現(xiàn)的排除親子關(guān)系分型結(jié)果的概率是非父排除率。基于PI定義分析，PI為兩種情況下概率的比值：AMPI=μ/PE。其中μ表示基因座突變率，PE表示非父排除率[4]。應(yīng)用此種方法計算，最終得到的AMPI值至于PE大小相關(guān)，與被檢男子的具體基因分型并不相關(guān)。

3.2 傳遞概率計算法

傳遞概率計算法的原理于無突變情況下的PI值計算方法一致，只是突變親代傳遞等位基因給后代的概率有所改變，與等位基因的突變概率相同。此種方法計算，主要與爭議父基因型相關(guān)，需要以基因分型信息為支持，得到更具有針對性的PI值?，F(xiàn)在對于STR基因座突變的研究越來越多，掌握了越來越多的突變數(shù)據(jù)，但是多數(shù)只能夠使用整個基因座的突變率。傳遞概率法計算則是需要應(yīng)用到特異等位基因突變概率，要根據(jù)基因座突變率推算得到等位基因的突變概率才可以。由此就決定了此種方法計算過程的復(fù)雜性，實(shí)際應(yīng)用中要格外注意。

3.2.1 突變模型。STR等位基因突變概率的計算模型包括等概率模型、遞減模型、成比例模型、驗(yàn)性遞減模型以及逐步穩(wěn)態(tài)模型。其中，等概率模型以及成比例模型均與逐步突變模型不符。遞減模型符合SMM，將突變概率和重復(fù)序列長度變化之間的關(guān)系納入到考慮范圍內(nèi)，且對等位基因頻率數(shù)據(jù)庫中內(nèi)有的新等位基因情況也進(jìn)行了綜合分析，只是未針對與等位基因頻率之間的非穩(wěn)態(tài)關(guān)系進(jìn)行分析。經(jīng)驗(yàn)性低價模型的原理更為簡單，利用Ms表示等位基因發(fā)生s（s＞1）步突變概率，則Ms≈（1/2）（1/10）|s-1|。逐步穩(wěn)態(tài)模型不僅考慮了突變概率和重復(fù)序列長度變化的關(guān)系，同時還考慮了不同等位基因突變概率有所差異的情況。此模型同時符合SMM和群體等位基因頻率穩(wěn)定不變的要求，相比其他幾種模型，在基因突變概率方面的計算方面理論上應(yīng)用效果最好。

3.2.2 突變率性別比。存在較多的研究表示父方與母方之間的突變概率有所差異，這樣在計算突變PI值時，也需要將此方面的突變率性別差異納入到考慮范圍內(nèi)。例如Brenner按照女性突變率是男性突變率的1/3.5進(jìn)行PI值計算。

3.2.3 突變方向。雖然在一些研究中STR突變多趨向于增加重復(fù)單位，但是在計算等位基因突變率時，往往都是采用突變重復(fù)序列增加或減少機(jī)會相等的算法進(jìn)行計算。

3.2.4 一步突變與多步突變。部分情況下孩子等位基因是通過親代一步突變或者多步突變而來，例如母方基因型為12，13，孩子基因型為13，14，父方基因型為15，16。對于多步突變（16突變成14）的情況是否也需要納入考慮，目前尚未完全統(tǒng)一。但是實(shí)際上基因座發(fā)生二步甚至多步突變的概率是非常小的，以及幾乎不對對最終PI值的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，大多數(shù)情況對其是忽略不計的。

3.2.5 非整數(shù)步突變。假如D24S11基因座中，母方基因型為29，30，孩子基因型為30，31，父方基因型是32，33，就可以判斷存在非整數(shù)突變。但是此種非整數(shù)重復(fù)單位改變的情況下在STR基因座突變中的可能性非常小。其有可能不是重復(fù)序列的改變，而是重復(fù)序列側(cè)翼序列的改變，無論是選擇逐步穩(wěn)態(tài)模型還是經(jīng)驗(yàn)遞減模型進(jìn)行計算，均無法得到準(zhǔn)確的等位基因突變概率，影響最終鑒定結(jié)果可靠性。

3.2.6 父、母均有突變可能性。例如母方基因型為12，13，孩子基因型為12，14，父方基因型為12，15?？梢哉f明父母均有基因座突變的可能性，那么在進(jìn)行計算時需要考慮母方的突變可能性嗎？相比來講，如果將母方突變納入到考慮范圍內(nèi)，最終的計算結(jié)果將會對PI值產(chǎn)生明顯的影響。雖然在親子鑒定的實(shí)施中基本上是認(rèn)定父方突變，但是對于部分特殊案例也有著極大的情況，不能夠完全忽視母方突變的可能性。

4 STR基因座突變對親子鑒定準(zhǔn)確性影響注意要點(diǎn)

4.1 初步判定突變

在對一定數(shù)量的STR基因座進(jìn)行檢測后，發(fā)現(xiàn)其中之后少數(shù) 幾個基因座排除親子關(guān)系的情況下，不排除存在突變的可能。一般情況下因?yàn)榛蜃亩鄳B(tài)性、突變率以及親子關(guān)系認(rèn)定水平等特點(diǎn)，對于存在的幾個的實(shí)際數(shù)量并沒有明確規(guī)定。應(yīng)用PowerPlex 16與AmpFLSTR Identifler系統(tǒng)時，假如可以檢出15個STR的基因型，存在3個以內(nèi)的基因座排除親子關(guān)系，便可懷疑存在突變。其他不排除親子關(guān)系基因座的累積非父排除率可以達(dá)到99%以上。如果存在4個及以上也無法排除STR突變的可能性，只能夠確定突變的概率比較小。

4.2 增多基因座數(shù)目

測序是可以鑒定是否存在突變的有效方法，其中需要增加檢測的遺傳標(biāo)記數(shù)，可以通過累積非父排除率進(jìn)行估計。累積非父排除率越高以及允許突變基因座越多的情況下，需要檢測的遺傳標(biāo)記也就越多。并且，對于需要增加檢測遺傳標(biāo)記的情況，依然存在著新突變發(fā)生的可能。

4.3 區(qū)分突變情形

4.3.1 沉默等位基因。如果出現(xiàn)親代一方與孩子全部表現(xiàn)為純合子的情況，如母方分型為29，30，孩子分型是30，父方分型為32，便需要注意因等位基因漏擴(kuò)產(chǎn)生的沉默等位基因。沉默等位基因基本上均是引物和模板間不配對導(dǎo)致，可選擇不同引物或試劑盒檢測，還可以通過改變擴(kuò)增條件來進(jìn)行證實(shí)。以ISFG要求為依據(jù)，要對沉默等位基因基因座的PI值進(jìn)行計算。

4.3.2 親屬個體代替檢驗(yàn)。存在親緣關(guān)系的個體之間具有相同等位基因的可能性要高于隨機(jī)個體之間的概率。假如與生父存在親緣關(guān)系的個體代替生父進(jìn)行親子鑒定，便有一定的可能性檢測出被檢男子與孩子之間存在個別基因座排除親子關(guān)系的可能性。但是被檢測的基因座數(shù)目越多，則出現(xiàn)這種情況的可能性也越低。

4.3.3 單親二體。子代一對染色體完全來自母方或父方，如果是單親二體將會導(dǎo)致假排除，一般需要對同一號染色體上的多個基因座進(jìn)行檢測來證實(shí)。

5 STR基因座突變對親子鑒定準(zhǔn)確性影響試驗(yàn)

5.1 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

3130型自動遺傳分析儀、Identifiler plus試劑盒與9700型PCR擴(kuò)增儀。

5.2 試驗(yàn)方法

①DNA提取與擴(kuò)增。應(yīng)用Identifiler plus試劑盒進(jìn)行15個STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增處理，包括D8S1179、D2S1339、D21S11、D19S433、CSF1PO、D16S539、TH01、D3S1358、FGA、D18S51、TPOX與D2S1338。 控制整個反應(yīng)體系為10μL，并按照親子鑒定要求完成各項(xiàng)參數(shù)的設(shè)置：30℃條件小操作10min，41℃條件下處理30min，99℃下處理5min，5℃下處理5min，共進(jìn)行35個循環(huán)處理，且最后的10min需要延長，調(diào)整溫度為72℃。處理后得到的產(chǎn)物要置于4℃條件下保存。②檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。應(yīng)用Chelex-100提取模板BNA，并將處理得到的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過3500DX基因分析儀完成毛細(xì)血管電泳。再利用全自動分析儀來確定親權(quán)關(guān)系。

5.3 試驗(yàn)結(jié)果

用于本次試驗(yàn)的親子鑒定標(biāo)本共有3120份，支持親子關(guān)系的有1946份，三聯(lián)體806份，二聯(lián)體1150份，合計觀察到減數(shù)分裂共有1805次，15例基因座突變，突變率為0.83%。其中，突變率前三位基因分別是D8S1179、D21S11和D2S1339?？梢源_定STR在DNA合成過程中存在著比較高的突變率，造成基因突變，而對親子鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。

6 結(jié)束語

STR基因座在親子鑒定中存在著比較高的突變率，尤其是父方突變概率要高于母方。為降低突變對鑒定結(jié)果的影響，需要掌握STR基因座突變的規(guī)律，總結(jié)基因突變情況計算侵權(quán)指數(shù)，進(jìn)一步提高親子鑒定的準(zhǔn)確性。