基于網(wǎng)絡藥理學和體外驗證實驗探索斑蝥素治療肝癌的作用機制

汪姣，包良，杜吉雅，張菱芳，王海生

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

肝癌是常見的惡性腫瘤，是發(fā)病率和病死率最高的5種癌癥之一［1］。肝癌治療方法多樣，目前臨床以手術治療、化療、放療和靶向治療等療法為主［2］。因肝癌早期癥狀不明顯，患者就診時多為中晚期，不再適合手術治療，晚期肝癌患者的治療方法有限，且復發(fā)率高、易發(fā)生轉移。中醫(yī)藥療法在治療肝癌的過程中有預防復發(fā)、轉移等優(yōu)點［3］。

斑蝥素（cantharidin）是傳統(tǒng)中藥斑蝥的有效提取成分，研究表明其對胃癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用［4］。斑蝥素可通過阻滯肝癌細胞周期使其停滯在G2/M 期，有效抑制其增殖，并促進凋亡，從而發(fā)揮抗癌效應［5］；還可通過下調P－糖蛋白表達情況，逆轉肝癌HepG2/ADM 的多藥耐藥性［6］。目前，針對斑蝥素治療肝癌的機制進行了大量研究，但主要以單靶點、單通路的作用機制為主，對其潛在的機制尚未進行系統(tǒng)的研究。因此，筆者運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術進一步對斑蝥素治療肝癌的作用機制進行系統(tǒng)分析，以期為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人肝癌細胞株HepG2 細胞為本實驗室凍存，在37 ℃、5%CO2的細胞箱中培養(yǎng)。

1.1.2 試驗藥物、主要試劑及儀器

斑蝥素（美國Sigma公司，25 mg/瓶，批號：C7632），溶于DMSO 溶液中，配制成50 mmol/L 的母液，在?20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司，批號：8121174、2117119）；CCK－8（大連美侖生物技術有限公司，批號：MA0218－5－May－15E）；RIPA 裂解液（上海尚寶生物科技有限公司，批號：1092891）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶有限公司，批號：67－68－5）；RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒（日本Takara 生物公司，批號：PK0542、AKG0730A、AKE1154A）；Akt、PT3K（美國Affinity 公司，批號：AF6214、AF6261）；ECL 顯色液（美國伯樂公司，批號：102031721）；BCA 蛋白定量試劑盒（美國Thermo 公司，批號：VL316399）；Matrigel 膠（上海碧云天有限公司，批號：120420210222）。

多功能酶標儀（美國thermo公司）；PCR 儀（美國羅氏公司）；電泳儀、轉膜儀（美國伯樂公司）。

1.2 方法

1.2.1 斑蝥素靶點的篩選

通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取斑蝥素的2D 結構和SMILES 表達式，運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp－e.com/tcmsp.php）和SwissTargetPrediction（https：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，將Organism 設置為Homo Sapiens（人類），入選預測概率選擇大于0，將兩個數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點合并去重，得到斑蝥素的預測靶點。

1.2.2 肝癌靶點的獲取

以“l(fā)iver cancer”為關鍵詞進行檢索，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）中獲取肝癌的潛在靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，Score值越高則代表該靶點與疾病聯(lián)系越密切，因此，以Score值為條件，將Score值大于中位數(shù)的靶點選擇為肝癌的潛在靶點。合并兩個數(shù)據(jù)庫中獲得的交集靶點，刪除重復，得到疾病相關的靶點。利 用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對藥物作用靶點和疾病靶點取交集，得到“斑蝥素－肝癌”共同靶點31個。

1.2.3 蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建及核心蛋白的篩選

運用STRING 數(shù)據(jù)庫，輸入31個共同靶基因，將物種設置為Homo Sapiens，選擇交互作用大于0.4，去除游離節(jié)點，下載“tsv”格式的數(shù)據(jù)，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構建PPI 網(wǎng)絡。將同時滿足Degree、Betweenness 和Closeness 三項數(shù)據(jù)，并在平均值之上的靶基因選為核心靶點。

1.2.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析

基于DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.abcc.ncifcrf.gov/）進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。將得到的交集靶點基因上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，并以P<0.05為篩選條件，將結果繪制成氣泡圖。

1.2.5 分子對接

從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載斑蝥素mol2結構，從蛋白數(shù)據(jù)PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中選擇下載核心靶點度值前6 的蛋白質3D 結構的pdb 格式文件，并要求所選擇的蛋白盡量滿足以下條件［7］：①選擇物種為人；②蛋白質結構中必須有1 個或多個小分子配體；③分辨率高；④pH 值接近人體正常生理范圍。利用AutoDock 4.2.6 軟件進行分子對接，并通過Pymol 2.4.0軟件將對接結果可視化。

1.2.6 CCK檢測HepG2增殖

HepG2細胞以濃度1×105/mL均勻接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。待細胞貼壁后分別加入終濃度為0、2.5、5、10、20 μmol/L的斑蝥素，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK－8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標儀測定450 nm波長的光密度值（optical density，OD）。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real－time PCR）檢測mRNA的水平

按照Trizol 試劑（Invitrogen）說明書提取實驗組和對照組的細胞內(nèi)總RNA，采用Nanodrop ND－1000 測定RNA 的濃度和純度，使用cDNA 逆轉錄試劑盒（TaKaRa）對1 μg 的RNA 進行逆轉錄，再以cDNA 為模板，以10 μL 的反應體系進行PCR 反應。反應條件為95 ℃預變性30 s，PCR 反應：95 ℃變性5 s，60 ℃延伸45 s，72 ℃退火10 s，進行45個循環(huán)。引物序列見表1，以GAPDH 作為內(nèi)參對照，結果以2－ΔΔCt表示mRNA 相對表達量。

表1 核心靶蛋白引物序列表

1.2.8 Western blot法檢測蛋白的表達

細胞接種至6 孔培養(yǎng)板中，用5 μmol/L 斑蝥素分別刺激細胞0、3、5、10、15 min，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA 裂解液裂解細胞。12 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清，按照BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度。按每15 μL 蛋白樣品加入5 μL 蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5 min 后，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品、半干轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗PI3K（1∶2 000）、Akt（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入山羊抗兔二抗（1∶100 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每 次10 min。ECL 顯色液以1∶1 體積比混合滴在PVDF 膜上，使用凝膠成像拍照，利用Image J 軟件定量目標條帶的相對蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計學處理，以均數(shù)± 標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 靶點的篩選

從TCMSP 和Swiss Target Prediction 中共獲得斑蝥素的靶點53個，去除重復靶點后得到32個靶點。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫和TTD 數(shù)據(jù)庫，選擇Relevance Score值大于中位數(shù)的為肝癌的靶點。從TTD 數(shù)據(jù)庫中獲取1 468 個，GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得8 408 個，將兩個數(shù)據(jù)庫中篩選出的靶點合并、去重后共得到8 408個肝癌的靶點，運用Venny 2.1 平臺取交集后得到31 個共同靶點，分別是PPP2R2A、ADORA2B、ABCB1、POLB、CASP3、PTPN1、HSD11B1、BIRC5、PTGES、OPRK1、PTGS2、FGFR4、GABRA1、STAR、OPRM1、PRKCA、ELANE、UGT2B7、PREP、BCL2、PPP5C、CDC25A、PRKCD、VDR、PPP1CA、HMGCR、CAMK4T、P53、PTEN、PPP1CC和BAX。

2.2 斑蝥素與肝癌PPI 網(wǎng)絡的構建及核心靶點的篩選

上傳得到的交集靶基因至STRING 數(shù)據(jù)庫，然后下載數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2 軟件構建PPI 網(wǎng)絡圖，結果見圖1，其中包含26 個節(jié)點和61 條連線，節(jié)點代表靶點，依據(jù)度值（Degree）設定，顏色由淺到深代表度值由小到大。對網(wǎng)連線則代表靶點之間的相互作用。節(jié)點顏色和大小絡中的節(jié)點進行拓撲分析得到度值、介度、緊密度的中位數(shù)分別為4、0.004 9、0.458 8，將同時滿足大于度值、介度、緊密度3個參數(shù)中位數(shù)的靶點列為核心靶點，參數(shù)見表2。由此推斷TP53、PTEN、CASP3等核心靶點在斑蝥素治療肝癌的過程中起著重要作用。

圖1 交集靶點PPI網(wǎng)絡圖

表2 核心靶點及相關參數(shù)

2.3 GO分類富集和KEGG通路富集分析

基于DAVID 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行富集分析（P<0.05），以P值為篩選條件，選擇排名前十條繪制成氣泡圖，見圖2和圖3。GO 分類富集分析顯示，斑蝥素在治療肝癌的過程中參與了87 條生物過程（BP）（圖2a），主要包括蛋白質去磷酸化、細胞增殖、細胞周期的調控等；涉及21 條分子功能（圖2b），主要為蛋白結合、酶結合、蛋白質磷酸酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性、蛋白磷酸酶2A結合、蛋白磷酸酶活性等。GO 分類富集分析得出16 條細胞組分（圖2c），主要包括細胞質、細胞液、細胞核、內(nèi)質網(wǎng)、線粒體、內(nèi)質網(wǎng)的膜、蛋白復合體等。

圖2 斑蝥素治療肝癌交集靶點的GO分析圖

KEGG 富集31 條信號通路，依據(jù)P值大小排名前二十的結果見圖3，主要涉及乙型肝炎通路、鞘脂類信號通路、PI3K/Akt 信號通路、MAPK 信號通路、細胞凋亡、p53信號通路等。

圖3 KEGG通路富集分析

2.4 斑蝥素治療肝癌的分子對接

將核心靶點度值（Degree）前6 的靶點進行分子對接，進一步驗證斑蝥素和肝癌的結合活性。結合自由能（Binding energy）可以評估受體和配體之間的親和性，一般認為結合能<0 kJ/mol 表明配體分子和受體蛋白能夠自發(fā)結合，結合能

圖4 斑蝥素治療肝癌的分子對接圖

表3 斑蝥素治療肝癌關鍵靶點結合能

2.5 斑蝥素抑制人肝癌HepG2細胞的增殖

采用CCK 法檢測不同濃度的斑蝥素作用于HepG2細胞24、48、72 h后對其增殖的影響。結果與空白對照組（0 μmol/L）相比，斑蝥素能顯著抑制人肝癌HepG2 細胞的增殖，并呈時間和劑量依賴性。見圖5。

2.6 斑蝥素影響HepG2相關基因的表達

采用Real－time PCR 法檢測斑蝥素作用于HepG2細胞后核心靶點mRNA 的表達情況。結果與對照組相比，斑蝥素干預組（5 μmol/L）中ABCB1（2.46 ±0.64）（P=0.017 3 <0.05）、PTEN（1.30 ± 0.13）（P=0.032 5 <0.05）、PTGS2（1.42 ± 0.07）（P=0.022 3 <0.05）和TP53（1.43 ± 0.01）（P=0.000 0 <0.01）的mRNA 表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，而CASP3（1.04 ± 0.12）（P=0.43）和PRKCD（1.11 ± 0.08）（P=0.58）的mRNA 表達差異不具有統(tǒng)計學意義，說明斑蝥素能夠上調ABCB1、PTEN、PTGS2 和TP53 的表達。見圖5。

圖5 斑蝥素對HepG2細胞增殖及核心靶蛋白mRNA表達的影響

2.7 斑蝥素對HepG2細胞PI3K/Akt信號通路的影響

5 μmol/L 斑 蝥 素 作 用 于HepG2 細 胞3、5、10、15 min 后，與空白對照組（0 min）相比，5 μmol/L 斑蝥素組的PI3K、Akt 蛋白表達顯著下調（P<0.05），說明斑蝥素對PI3K/Akt 信號通路具有抑制作用。見圖6。

圖6 斑蝥素對PI3K/Akt 信號通路的影響

3 討論

大量研究證明，斑蝥素對多種癌細胞具有抗腫瘤的活性，但其作用機制復雜，以往的研究多以單靶點、單通路為主。本研究運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，從分子角度全面分析了斑蝥素治療肝癌的潛在作用機制。結果顯示，斑蝥素可通過TP53、PTEN、PTGS2及ABCB1等多個核心靶點發(fā)揮作用。TP53（細胞腫瘤抗原p53）是一種重要的腫瘤抑制因子，可通過調節(jié)DNA修復、細胞周期阻滯等多種細胞反應防止癌癥的發(fā)生和發(fā)展［9］，部分肝癌的發(fā)生與p53基因的缺陷或突變密切相關［10］。TIAN 等［11］研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素可通過上調TP53 抑制癌細胞的增殖和促進凋亡。PTEN基因是一種具有雙特異性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，其表達下調可導致腫瘤血管生成增加，促進腫瘤細胞的增殖［12］。PTGS2又稱環(huán)氧合酶－2（COX－2），在多種癌細胞中表達增加，研究表明COX－2 抑制劑對肝癌細胞有良好的抑制增殖及誘導凋亡功效［13］。而ABCB1在肝癌中高表達與肝癌的高耐藥性相關［14］。

GO分類富集分析結果顯示，斑蝥素發(fā)揮的肝癌治療作用與細胞凋亡和細胞周期密切相關，早期的研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素可通過下調β－catenin 和細胞周期蛋白（cyclin）的表達，誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯在G2/M 期，抑制肝癌細胞增殖和自我更新［5］，這也與本文的分析結果相一致。

KEGG 富集結果表明，共同靶點主要富集在PI3K/Akt、乙型肝炎通路、鞘脂類通路等。PI3K/Akt 在細胞的生長、增殖、代謝過程中發(fā)揮著重要作用，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展轉移和耐藥等方面密切相關［15］。有研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素通過下調EphB4 表達，調節(jié)JAK2/STAT3 和PI3K/Akt通路抑制肝癌［16］。為了進一步驗證網(wǎng)絡藥理學預測的科學性，本研究以HepG2 細胞為模型細胞，對預測的主要靶點和通路進行了實驗驗證，結果發(fā)現(xiàn)斑蝥素能夠上調TP53、ABCB1、PTEN 和PTGS2 的mRNA 表達，下調PI3K/Akt 通路中PI3K、Akt 蛋白的表達，從而抑制HepG2細胞的增殖。

本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法分析了斑蝥素抗肝癌的潛在作用靶點及作用機制，并用分子對接技術和體外實驗進行了驗證。結果表明，斑蝥素抗肝癌具有多靶點、多通路的特點，主要通過上調TP53、PTEN、ABCB1和PTGS2 等靶點的mRNA 表達，抑制PI3K/Akt 信號通路的激活以及HepG2細胞的增殖實現(xiàn)抗肝癌的作用。