基于DNA與上轉換納米顆粒相結合的生物傳感與成像研究進展

趙恒智，余方志，李翔菲，李樂樂

（國家納米科學中心,中國科學院納米生物效應與安全性重點實驗室,北京 100190）

脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）作為主要的遺傳物質在生命系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用.得益于DNA分子的堿基互補配對特性以及一系列功能性DNA如核酸適體（Aptamer，可與目標物發(fā)生特異性結合）、脫氧核酶（DNAzyme，具有類酶催化功能）的發(fā)現(xiàn)，DNA被廣泛應用于生物傳感、生物成像、藥物遞送和疾病治療等領域［1～8］.DNA在上述領域的應用中具有諸多方面的優(yōu)勢.首先，DNA可以通過固相合成實現(xiàn)自動化的化學合成，其具有易于合成及易于化學修飾的優(yōu)點［9，10］.此外，DNA還具有可編程性強以及生物相容性好等優(yōu)勢，極大地推動了DNA在生物醫(yī)學領域中的應用.另一方面，由于小尺寸效應，納米材料具有獨特的光學、電學及磁學特性，在生物成像等領域中表現(xiàn)出優(yōu)良的應用潛力［11～13］.通過將這些納米材料與DNA進行結合，不僅可以整合DNA及納米顆粒各自的優(yōu)勢，還可以催生出單一成分所沒有的協(xié)同特性，實現(xiàn)新型生物成像應用［14～16］.

由于具有獨特的光學、磁學等性質，鑭系元素摻雜的上轉換納米顆粒（Upconversion nanoparticles，UCNPs）受到了廣泛關注［17～21］.與傳統(tǒng)的發(fā)光材料如量子點、碳點等不同，UCNPs通過非線性光學過程展現(xiàn)出反斯托克斯的發(fā)光特性.在該過程中，UCNPs在低能量光子如近紅外（Near-infrared，NIR）光輻射下可連續(xù)吸收2個或多個光子，產生較短波長的紫外（Ultraviolet，UV）光或可見光［21］.UCNPs具有如下優(yōu)勢：首先，UCNPs的激發(fā)光處于NIR窗口，不僅可以大幅降低來自生物系統(tǒng)的自發(fā)熒光背景干擾，還能有效避免光引起的組織損傷；其次，NIR光具有更高的組織穿透深度，可實現(xiàn)活體水平的生物成像；第三，UCNPs發(fā)光穩(wěn)定性好，可以有效地抵抗光漂白；因此被廣泛應用于生物成像［5，19］.此外，通過在UCNPs中摻入不同的鑭系離子，可在同一激發(fā)波長照射下實現(xiàn)多色發(fā)光成像分析.近年來，基于DNA與UCNPs相結合的生物成像技術備受關注.這種交叉融合能夠將DNA的分子識別功能與UCNPs的光學性能相結合，從而開發(fā)出新型生物成像策略，為疾病的診斷及病理學研究提供新工具.

本文聚焦基于DNA與UCNPs結合的生物成像策略，并根據(jù)工作原理將其歸納為3種成像方法（圖1）.第一種方法，將具有腫瘤標志物識別能力的核酸適體與UCNPs結合，實現(xiàn)腫瘤靶向成像.第二種方法，UCNPs作為能量供體與DNA結合，構建基于發(fā)光共振能量轉移（Luminescence resonance energy transfer，LRET）機制的生物傳感器，實現(xiàn)對靶標分子的檢測與成像分析.第三種方法，通過構建光響應的DNA傳感器，并引入UCNPs作為控制單元，實現(xiàn)NIR光操控的、時空選擇性分子傳感與成像.本文將分別對這3種成像策略的研究進展進行概述，并對該領域的發(fā)展前景進行了展望.

Fig.1 Schematic illustration of biosensing and imaging strategies based on the integration of DNA and UCNPs

1 DNA-UCNPs用于腫瘤靶向成像

光學成像技術是一種分辨率高、具有原位實時能力的成像手段，其在生理病理學研究以及疾病診斷等領域應用廣泛，是醫(yī)學和生命科學中不可或缺的研究工具.與傳統(tǒng)有機熒光染料及量子點等熒光材料不同，UCNPs可在NIR光的激發(fā)下產生上轉換發(fā)光，從而能夠在生物成像應用中大幅降低生物樣品所產生的自體熒光干擾并實現(xiàn)深層組織成像.利用UCNPs對腫瘤部位進行特異性地標記，可視化地分辨病變組織與正常組織，有望用于腫瘤診斷及手術導航.然而，UCNPs本身不具有腫瘤特異性識別功能，需將其與具有靶向功能的配體相結合以實現(xiàn)相關應用.

核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選出的具有特定序列的寡核苷酸，能夠與特定目標物結合，具有很強的結合親和力和特異性［22～24］.由于與抗體的功能相似，適體常被稱為“化學抗體”.迄今，通過SELEX技術已經(jīng)篩選出大量的核酸適體，可以特異性識別小分子、蛋白質、細胞及組織［25～29］.因此，將具有腫瘤靶向功能的核酸適體修飾在UCNPs表面，有望實現(xiàn)基于上轉換發(fā)光的腫瘤成像.例如，通過配體交換法將AS1411適體（可與癌細胞表面過表達的核仁素結合）修飾在UCNPs表面，實現(xiàn)了腫瘤細胞MCF-7的靶向成像［圖2（A）］［30］.該納米探針孵育后的MCF-7細胞在NIR光激發(fā)下顯示出強烈的上轉換發(fā)光，而同樣條件下，核仁素陰性細胞NIH-3T3并未展現(xiàn)出明顯的上轉換發(fā)光信號，表明其腫瘤靶向成像功能.Tan課題組［31］通過在UCNPs表面修飾與細胞膜受體蛋白酪氨酸激酶7（Protein tyrosine kinase 7，PTK7）特異性結合的sgc8適體，并引入光敏劑分子，實現(xiàn)了PTK7過表達癌細胞CEM的靶向成像及光動力治療［圖2（B）］.隨后，該課題組［32］將帶有AS1411適體的DNA四面體框架核酸修飾于UCNPs表面，實現(xiàn)了對癌細胞的靶向成像.

Fig.2 DNA-UCNPs for aptamer-mediated targeted tumor imaging

比率成像的策略能夠降低環(huán)境及儀器效率等造成的干擾，從而可獲得更為可靠的成像信息.UCNPs具有可調的上轉換發(fā)光特性.通過精準的設計合成及調控，能夠制備出多色上轉換發(fā)光的UCNPs，用于構建腫瘤比率成像分析方法.Zhang課題組［33］制備了雙色發(fā)光的UCNPs，并對其進行核酸適體修飾以及藥物裝載，用于腫瘤成像及治療.如圖2（C）所示，修飾于UCNPs表面的sgc8適體鏈與攜帶猝滅劑BHQ-1的單鏈DNA部分雜交，使UCNPs的綠色發(fā)光被猝滅劑BHQ-1猝滅，從而只顯現(xiàn)出紅色發(fā)光.UCNPs表面核酸適體與癌細胞表面受體PTK7結合會引起核酸適體構象變化，從而釋放攜帶猝滅劑BHQ-1的單鏈DNA并使光敏劑分子PPA靠近UCNPs.該靶向過程會引起UCNPs綠色發(fā)光的恢復以及UCNPs與PPA之間能量轉移導致的紅色發(fā)光降低.因此，可根據(jù)綠光強度與紅光強度的比率實現(xiàn)腫瘤精準成像.此外，核酸適體構象的改變還能夠同時觸發(fā)化療藥物的釋放以及光動力治療的開啟，從而實現(xiàn)集腫瘤成像、化療藥物釋放及光動力治療的一體化.

2基于DNA-UCNP的LRET傳感器

UCNPs具有獨特的上轉換發(fā)光特性，其激發(fā)波長處于NIR窗口，因此可將其作為能量供體用于構建基于LRET的化學與生物傳感器，從而解決傳統(tǒng)熒光團激發(fā)波長較短帶來的限制.此外，還可以利用UCNPs可調的多色發(fā)光特性發(fā)展比率型分子傳感與成像策略.

MicroRNA（miRNA）是一種非編碼RNA，在許多細胞過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用.研究表明，miRNA的表達水平與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關［34～36］.因此，miRNA可作為一種潛在的腫瘤標志物用于癌癥的診斷及治療.Zhu課題組［37］通過將雙受體分子標記的cDNA（miRNA互補序列）在靜電作用下吸附于UCNPs表面，構建了用于活細胞內miRNA成像的納米傳感器［圖3（A）］.在初始狀態(tài)下，受體分子與能量供體UCNPs之間距離接近，可通過LRET猝滅UCNPs的上轉換發(fā)光.當目標miRNA存在時，其能與cDNA雜交并形成穩(wěn)定的DNA/RNA異源雙鏈結構.由于雙鏈結構具有較大的剛性，使其與UCNPs之間的親和力下降并從UCNPs表面釋放，從而中斷受體分子與供體UCNPs之間的LRET作用，進而恢復UCNPs的上轉換發(fā)光用于miRNA檢測.該傳感器進一步被用于活細胞內miRNA的原位成像分析.Na課題組［38］將靶標miRNA的互補DNA序列分成兩段，并將其中一段修飾于能量供體UCNPs表面，另一段進行受體熒光團TAMRA標記，構建了一種基于LRET的miRNA傳感策略.該方法利用靶標miRNA的“橋聯(lián)”作用將受體熒光團標記的互補DNA捕獲至UCNPs表面，從而通過LRET作用影響UCNPs發(fā)光，實現(xiàn)miRNA的傳感檢測.DNA自組裝能夠賦予DNA納米結構規(guī)則的幾何構型以及良好的結構穩(wěn)定性.受此啟發(fā)，Kuang課題組［39］合成了以DNA為框架，金納米顆粒和UCNPs為頂點的納米金字塔探針，用于細胞內miRNA的檢測與成像.良好的幾何構型使得UCNPs與金納米顆粒之間發(fā)生LRET過程，從而猝滅UCNPs的上轉換發(fā)光.目標miRNA的存在可觸發(fā)DNA框架的瓦解，導致UCNPs與金納米顆粒之間的LRET中斷，從而恢復UCNPs的上轉換發(fā)光以實現(xiàn)miRNA檢測.此外，該納米金字塔探針還可通過圓二色光譜信號的變化實現(xiàn)對miRNA的定量檢測.最近，Ding等［40］利用雙色發(fā)光的UCNPs作為能量供體并提供內參信號，結合miRNA觸發(fā)的發(fā)夾DNA自組裝反應，構建了自參比信號放大的納米傳感器.目標miRNA引發(fā)的發(fā)夾DNA自組裝反應能夠將受體熒光團拉近至供體UCNPs表面，從而通過LRET效應引起信號的變化，實現(xiàn)活細胞中miRNA的高靈敏比率成像［圖3（B）］.miR122作為一種新興的肝損傷生物標志物，在藥物性肝損傷檢測中展現(xiàn)出巨大潛力.Li課題組［41］以UCNPs為供體，金納米籠為能量受體及藥物載體，并基于miR122介導的DNA鏈置換反應，構建了藥物性肝損傷成像及按需給藥的一體化納米診療平臺.

Fig.3 LRET-based DNA-UCNP sensors

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）是生物體中普遍存在的生物活性分子，在能量傳遞、酶催化和信號轉導中起著至關重要的作用.Chen課題組［42］將ATP適體的互補序列DNA修飾于UCNPs表面并與Cy3熒光團標記的ATP適體鏈雜交，構建了ATP傳感器.在初始狀態(tài)下，能量供體UCNPs與受體熒光團Cy3間的LRET使得UCNPs的發(fā)光被猝滅.ATP能夠與適體鏈發(fā)生特異性結合，從而使Cy3標記的適體DNA從UCNPs表面釋放并中斷LRET作用，恢復UCNPs的上轉換發(fā)光.該傳感器進一步被用于活細胞內ATP的原位成像分析.通過選擇不同的功能性DNA，該方法可應用于其它小分子的檢測與成像.Lee課題組［43］以UCNP為供體，氧化石墨烯為受體，通過多巴胺適體將兩者進行集成，構建了多巴胺生物傳感器，用于檢測干細胞來源多巴胺能神經(jīng)元中釋放的多巴胺分子.近期，Zhang課題組［44］將Pb2+選擇性DNAzyme探針修飾于UCNPs表面，基于LRET原理，構建了特異性成像Pb2+的納米傳感器.

通過摻雜不同元素，UCNPs在NIR光激發(fā)下具有可調的多色發(fā)光，為生理病理過程中多靶標檢測提供了新工具.Liu課題組［45］開發(fā)了一種DNA-UCNPs納米傳感器，用于溶酶體中K+及pH的多靶標成像分析［圖3（C）］.該納米傳感器主要由UCNP能量供體、金納米顆粒受體及具有K+或pH響應能力的DNA分子連接而成.K+會觸發(fā)富鳥嘌呤序列DNA分子形成G-四鏈體結構，使得UCNP和金納米顆粒相互靠近，通過LRET作用猝滅UCNP的綠色發(fā)光.同時，酸性pH條件下胞嘧啶的質子化驅動C+·G-C三鏈體DNA的形成，使發(fā)射藍光的UCNP和金納米顆?？拷瑢е滤{光猝滅.因此，通過引入不同上轉換發(fā)光的UCNPs供體，可在NIR光激發(fā)下實現(xiàn)pH和K+的同時成像分析.該體系為溶酶體生物化學研究提供了新方法.研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體中H+的流入會伴隨著K+的流出.Kuang課題組［46］將2種含有不同miRNA識別序列、不同熒光修飾的DNA分子連接于UCNPs表面，并進一步與納米金棒進行組裝，構建了可同時成像2種不同靶標miRNA的納米組裝體探針.能量供體UCNPs與受體納米金棒之間的LRET使得上轉換發(fā)光信號被猝滅.在目標miRNA的存在下，miRNA通過與DNA分子中識別序列的雜交將UCNP從納米金棒表面釋放，進而開啟供體UCNP與受體熒光團之間的LRET作用，實現(xiàn)對2種miRNA的檢測及成像.該課題組［47］進一步構建了拉曼-上轉換發(fā)光雙模式成像納米探針，實現(xiàn)了活細胞內miRNA及端粒酶活性的定量分析.

3 基于DNA-UCNPs的時空選擇性分子傳感與成像

傳統(tǒng)傳感器的設計采用“始終開啟”的策略，即只要有靶標分子輸入便會產生成像信號.該類傳感系統(tǒng)在復雜生命體系（如細胞內和活體）中的應用面臨一個關鍵難題，即其在被遞送至目標區(qū)域的過程中可對靶標分子提前響應，導致成像的精準度受限［48］.因此，如何實現(xiàn)“時-空”可控的分子傳感與成像成為該領域的一個前沿科學問題.

針對這一問題，本課題組［49］通過引入UCNPs作為控制模塊，率先提出了上轉換發(fā)光激活型傳感方法，以實現(xiàn)時空選擇性分子傳感與成像.如圖4（A）所示，設計了含有UV光敏感基團（PC）的互補鏈與ATP適體雜交，封閉其ATP識別功能.同時，互補鏈3′端標記的猝滅基團可以有效猝滅適體鏈5′端標記的熒光基團Cy3.進一步將構建的DNA傳感器與UCNPs結合，構建了近紅外光調控的傳感器件.在NIR光照射下，UCNPs將其轉換為UV光以切割互補鏈中的PC基團，導致互補鏈與適體鏈的雜交親和力降低，進而恢復核酸適體對ATP的識別能力.核酸適體鏈通過結合ATP發(fā)生構象變化，與互補鏈分離，從而恢復Cy3熒光信號.利用該方法，通過NIR光控制實現(xiàn)了在活細胞中ATP分子的時空選擇性成像分析.這一概念性方法自提出以來已經(jīng)在生物傳感與成像領域得到了廣泛應用［48］.例如，本課題組通過合理設計光激活型DNA傳感體系，將該方法拓展至miRNA和pH的精準成像分析［50，51］.Lu課題組［52］通過引入“光籠”基團對DNAzyme的切割底物進行保護，設計了一種UV光激活的金屬離子成像探針，并將UCNPs作為控制模塊與其結合，開發(fā)了一種NIR光激活的金屬離子傳感器，實現(xiàn)了對細胞內和斑馬魚胚胎中鋅離子的成像分析.為增強DNA探針的生物穩(wěn)定性，Pang課題組［53］將基于DNA四面體結構的miRNA納米傳感器與UCNPs進行集成，開發(fā)了可示蹤細胞內miRNA的NIR光激活型DNA納米機器.DNA馬達是一種動態(tài)的DNA納米機器，其可通過鏈置換反應或DNAzyme切割反應增強信號轉導和放大傳感信號［54］.近期，Li課題組［55］利用UCNPs構建DNA馬達，經(jīng)NIR光啟動目標mRNA介導的鏈置換反應及連續(xù)的DNAzyme切割反應，實現(xiàn)了對腫瘤標志物生存素mRNA的高靈敏成像分析.此外，以同時成像多種miRNA分子為目標，Luo課題組［56］將UV光響應的DNA納米探針與UCNPs相結合，構建了能夠成像細胞內多種miRNA的NIR光調控型納米傳感器.最近，該課題組［57］通過在UCNPs表面修飾UV光敏感的劈裂型DNAzyme探針，實現(xiàn)了NIR光控制的目標RNA高靈敏成像分析.在該設計中，NIR光的照射能夠恢復劈裂型DNAzyme探針的靶標RNA識別能力，并通過與靶標RNA的雜交激活DNAzyme的切割能力，從而產生響應信號用于靶標RNA成像.基于DNA的分子邏輯電路由于能夠在生物系統(tǒng)中執(zhí)行復雜的信息處理而受到研究者們的廣泛關注.本課題組［58］將DNA邏輯電路的概念與上轉換納米技術相結合，構建了NIR光激活的多靶標分子關聯(lián)性成像分析方法，展示了利用上轉換納米技術對DNA邏輯運算進行時空操控的潛力.

生物分子在細胞內的時空分布受到嚴密而精細的調控以保證各種生化反應的高效有序進行，從而維持細胞的正常生命活動［59，60］.因此，在亞細胞水平對生物分子的分布及濃度進行監(jiān)測，有利于深入研究探索各種生理和病理過程，為生命科學的研究和重大疾病的診療提供更多依據(jù).為了實現(xiàn)亞細胞水平靶標分子的精確檢測，本課題組［61］設計了UV光響應的DNA探針，通過將其與UCNPs及線粒體靶向配體相結合，構建了DNA納米傳感器，實現(xiàn)了對活細胞線粒體中2種癌癥相關miRNA的精準成像［圖4（B）］.在該體系中，DNA傳感系統(tǒng)由基于toehold介導的鏈置換反應設計而成.只有在PC基團被光解以后，靶標miRNA（miR-10b和miR-21）才能夠通過兩步連續(xù)的鏈置換反應將猝滅基團標記的互補鏈替換，從而恢復Cy5的熒光信號.因此，可以在DNA納米傳感器定位至線粒體后，通過NIR光照射遠程開啟其傳感功能，特異性地對線粒體內miR-10b和miR-21進行關聯(lián)性成像分析.鑒于該方法在miRNA空間限制性成像中的成功應用，本課題組［62］進一步開發(fā)了NIR光激活的細胞器靶向型納米傳感器，分別實現(xiàn)了對線粒體和細胞核內脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1（Human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1）活性的精準成像分析.利用該酶活納米傳感器發(fā)現(xiàn)，氧化應激刺激會引起APE1在亞細胞水平的動態(tài)遷移.在此基礎上，本課題組［63］將APE1響應的DNA探針、光敏劑分子及線粒體靶向配體與UCNP相結合，構建了一種多功能的DNA納米器件，實現(xiàn)了對光動力治療過程中線粒體內APE1酶活的實時成像分析.

Fig.4 DNA-UCNPs for spatiotemporally selective molecular sensing and imaging

4 總結與展望

由于DNA的分子識別功能及UCNPs獨特的光學性質，二者的有機結合在生物傳感與成像方面顯示出良好的潛力和應用價值，本文綜合評述了該領域的最新研究進展.將該DNA-UCNPs體系分為3類：（1）DNA-UCNPs用于腫瘤靶向成像.該策略通過將具有靶向功能的DNA分子（如核酸適體）修飾于UCNPs表面，利用UCNPs獨特的上轉換發(fā)光對靶細胞和組織進行成像.（2）基于LRET機制的DNA-UCNPs生物傳感器.該策略通過將UCNPs作為能量供體引入到DNA傳感器中，不僅可以將激發(fā)光置于NIR窗口，還可以通過UCNPs可調的多色發(fā)光特性，實現(xiàn)比率型分子檢測及多靶標成像.（3）DNA-UCNPs用于時空選擇性分子成像.該策略將UCNPs作為控制模塊，利用NIR光遠程開啟DNA傳感模塊的傳感功能，從而實現(xiàn)“時-空”可控的分子成像.此外，將該策略與細胞器靶向配體相結合，可進一步在亞細胞水平對特定細胞器內的靶標分子進行精準成像分析.

盡管目前取得了一系列進展，但在未來的研究中仍有一些問題亟需解決.（1）在DNA-UCNPs用于腫瘤靶向成像的應用中，功能DNA分子通常以共價方式偶聯(lián)至UCNPs表面，步驟繁冗，效率較低.此外，帶負電的DNA和帶正電的UCNPs之間存在較強的靜電相互作用，DNA磷酸基團與UCNPs上稀土間存在強配位作用，這些均可能導致偶聯(lián)后的功能DNA分子失去空間構象，從而喪失靶標識別的能力.因此，在未來的研究中，可通過引入能夠保持核酸適體識別能力的三維DNA結構或削弱核酸適體與UCNPs之間相互作用的表面處理技術來應對該問題.（2）在基于DNA-UCNPs的LRET傳感器中，UCNPs作為能量供體，基于LRET效應，以上轉換發(fā)光或受體熒光來實現(xiàn)對目標分子的成像與定量分析.然而，以發(fā)光強度作為信號輸出會受到組織深度不均等因素的影響，難以實現(xiàn)精準的定量分析.而發(fā)光壽命受上述因素的影響較小，因此可利用發(fā)光壽命作為信號輸出，實現(xiàn)更為精準的分子傳感與成像.（3）在DNA-UCNPs用于時空選擇性分子傳感與成像的應用中，DNA傳感模塊的激活效率與UCNPs的上轉換發(fā)光效率緊密相關.已有研究顯示，通過在UCNPs表面修飾適合的熒光團可顯著提高光子的上轉換效率［64］，在未來的應用研究中可以考慮利用相關方法提高DNA傳感模塊的激活效率.（4）由于UCNPs的激發(fā)光處于NIR窗口，其較高的組織穿透深度使得UCNPs在活體成像方面擁有著巨大的潛力［65，66］.最近，具有更深組織穿透深度的NIR-II區(qū)UCNPs也被用于活體傳感及成像［67］.此外，UCNPs可調的多色發(fā)光特性使其還能夠應用于活體水平的多色成像［68］.目前，DNA-UCNPs在細胞成像方面已取得了較大進展，然而其在活體成像中的應用仍處于初步階段.因此，DNA-UCNPs在活體成像方面的應用具有廣闊的探索空間.