一步法高通量可控制備生物相容水/水微囊及其響應釋放

翟小威，潘湄蝶，石 盼，趙 鵬，陳 東，

（1.浙江省智能生物材料重點實驗室,浙江大學化學工程與生物工程學院,杭州 310027；2.浙江大學能源工程學院,能源清潔利用國家重點實驗室,杭州 310003；3.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,杭州 310003）

隨著微流控技術的發(fā)展，自上而下制備微囊的技術開始得到開發(fā)［9］.微流控技術是一種在微米尺度對微量流體進行精確操控的技術，可廣泛應用于生物檢測［10，11］、藥物分析［12，13］、細胞測序［14，15］、材料制備［16，17］、載體設計［18，19］等領域.微流控具有微型化、集成化等特征，可以對流體進行精準控制［20］，從而精確控制剪切過程，能夠一步法生成雙重乳液，然后以此為模板，制備具有核殼結(jié)構(gòu)的微囊.微流控技術已成功實現(xiàn)一步法制備各種水包油或油包水微囊［21～23］，且具有尺寸均一、結(jié)構(gòu)可控［24～27］、壁厚可調(diào)、包裹率高、裝載率大［28，29］等諸多優(yōu)勢.目前，微流控技術制備的微囊主要是基于水油體系，即水包油（油/水）或油包水（水/油）微囊［30］.但隨著應用需求的不斷增加［如污水凈化［31］、液滴制備［32］、細胞提取與分離［33］、三維（3D）生物打?。?4］、生物相容材料制備［35］等諸多領域］，水包水（水/水）微囊開始得到越來越多的關注.但是水/水微囊與水/油微囊或油/水微囊不同，水/水微囊內(nèi)外相均為水相，內(nèi)外相的密度差較小，界面張力較低［36］，較難控制形成微囊，通常需要外加電場或聲場輔助乳化［37］.此外，藥物遞送、醫(yī)學治療等領域的應用，在生物相容性、微囊后處理、可控制備、響應釋放、大通量生產(chǎn)等方面對水/水微囊提出了更高的要求.因此，設計微流控器件一步法高通量可控制備生物相容水/水微囊，實現(xiàn)載體的可控釋放，具有重要意義.

本文采用同軸微流控器件一步法制備大小均勻、尺寸可控、壁厚可調(diào)、生物相容的水/水微囊；系統(tǒng)研究了微流控器件結(jié)構(gòu)對水/水微囊形成過程的影響規(guī)律，并進一步結(jié)合數(shù)值模擬，揭示內(nèi)相和外相流速、外相/空氣和內(nèi)相/外相界面張力、內(nèi)相和外相黏度對水/水微囊尺寸和壁厚的調(diào)控規(guī)律；通過pH刺激響應，展示了水/水微囊囊壁溶解和微囊釋放過程及其內(nèi)在機理；最后利用微通道流動阻力分析，設計多通道平行放大微流控器件，實現(xiàn)了尺寸均勻可控水/水微囊的高通量制備.本文制備的水/水微囊具有器件結(jié)構(gòu)簡單、操作便捷、一步法成型、通量高、微囊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、尺寸均一可控、無需后處理等優(yōu)點.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

黃原膠（化妝品級）、透明質(zhì)酸鈉（化妝品級）和普魯蘭多糖（化妝品級）均購于山東優(yōu)索化工科技有限公司；海藻酸鈉（分析純）和檸檬酸鈉（分析純）均購于上海阿拉丁試劑有限公司；無水氯化鈣（分析純）購于國藥集團化學試劑有限公司；甘油（純度≥99%）購于上海麥克林生化科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（純度約99%）購于上海伊卡生物技術有限公司.

P-1000型拉伸儀，美國Sutter Instrument公司；LSP01-1A型注射泵，保定蘭格恒流泵有限公司；LabN1/YZ1515x型蠕動泵，保定申辰泵業(yè)有限公司；玻璃毛細管，北京中成石英玻璃有限責任公司；RCT基本型磁力攪拌熱臺（MAG），德國IKA公司；ME204E型電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SZN型連續(xù)變倍體視顯微鏡，寧波舜宇光學科技有限公司；Orange 4K型光固化3D打印機，深圳長朗科技有限公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 同軸玻璃管微流控器件的制備 通過拉伸儀將內(nèi)徑0.55 mm、外徑0.96 mm的圓柱形玻璃管和內(nèi)徑1.00 mm、外徑1.40 mm的圓柱形玻璃管一端拉伸成錐狀，并利用砂紙將錐狀管口分別打磨至300和600μm.管口尺寸通過體顯微鏡進行精確測量.然后將外徑0.96 mm的玻璃管（內(nèi)管）插入內(nèi)徑1.00 mm的玻璃管（外管），分別制備內(nèi)管管口內(nèi)縮300μm、內(nèi)/外管管口平齊、內(nèi)管管口伸出300μm、內(nèi)管管口內(nèi)縮300μm外管管口不拉伸的同軸微流控器件，最后通過AB膠環(huán)氧樹脂固定.

1.2.2 微流控器件制備水/水微囊 內(nèi)/外相各成分含量均為質(zhì)量分數(shù)：內(nèi)相為0.2%黃原膠（增稠劑、穩(wěn)定劑［38］）、0.1%透明質(zhì)酸鈉（保濕劑［39］）、2%普魯蘭多糖（抗氧化劑［40］）、5%甘油（保濕劑［41］）的水溶液（以下簡稱黃原膠水溶液），由內(nèi)管注入微流控器件；外相為1%海藻酸鈉（包材，可被鈣離子交聯(lián)形成穩(wěn)定囊壁［42］）、0.05%十二烷基硫酸鈉（表面活性劑）的水溶液，由外管注入微流控器件.內(nèi)相在外相的剪切下形成液滴，同時外相在重力作用下脫離管口生成水包水的水/水微囊，并進一步通過接收池（質(zhì)量分數(shù)為5%氯化鈣水溶液）中的鈣離子交聯(lián)海藻酸鈉水凝膠網(wǎng)絡，形成穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu).為了便于觀察水/水微囊的特征，采用黃色染色劑對內(nèi)相進行染色.通過系統(tǒng)改變內(nèi)相流速和外相流速，研究微流控器件結(jié)構(gòu)對水/水微囊成型的影響，最終確定水/水微囊的制備相圖.

1.2.3 流速對水/水微囊制備的影響 內(nèi)管管口內(nèi)縮300μm的同軸微流控器件制備水/水微囊具有較好的穩(wěn)定性，若無特別說明，后續(xù)均采用該種設計.保持外相流速不變，研究內(nèi)相流速對水/水微囊直徑和壁厚的影響.然后保持內(nèi)相流速不變，研究外相流速對水/水微囊直徑和壁厚的影響.水/水微囊的直徑和壁厚通過隨機選取100顆微囊進行測量計算得到.內(nèi)相流速為40 mL/h，外相流速為20 mL/h，制備得到的水/水微囊具有較薄的壁厚，若無特別說明，后續(xù)均采用該內(nèi)相/外相流速.

1.2.4 水/水微囊形成過程的數(shù)值模擬 數(shù)值模擬采用SolidWorks軟件建立幾何模型，使用ANSYS Workbench完成網(wǎng)格劃分和模擬過程.模擬器件參數(shù)與實驗器件參數(shù)保持一致，即內(nèi)管外徑0.96μm、內(nèi)徑0.55 mm、管口300μm，外管外徑1.40 mm、內(nèi)徑1.00 mm、管口600μm，內(nèi)管管口內(nèi)縮300μm.由于同軸微流控器件通道結(jié)構(gòu)具有軸對稱性，將模型簡化為二維模型.模型總體尺寸為20 mm×5.4 mm，包括上方微通道結(jié)構(gòu)和下方20 mm長的空氣域.微通道結(jié)構(gòu)和內(nèi)外相采用非結(jié)構(gòu)化四邊形網(wǎng)格劃分.幾何模型分別設置20，25，30，35，40和45μm等6種網(wǎng)格尺寸對模型進行網(wǎng)格無關性檢驗，最后選取網(wǎng)格尺寸為30μm，對應微囊直徑為2.756 mm.內(nèi)相和外相進口為速度型入口，出口為壓力型出口，壁面為靜止無滑移的疏水表面.初始化后，內(nèi)相充滿內(nèi)通道，外相充滿外通道.流動模型設置為層流模型，瞬態(tài)求解過程中的壓力速度耦合采用SIMPLE算法，殘差收斂精度為10-5，時間步長為10-4s.數(shù)值模擬研究兩相流速、界面張力及兩相黏度對水/水微囊直徑和壁厚的影響時，模擬采用的溫度為25℃，操作壓力為0 Pa，外相/空氣界面張力為30 mN/m，內(nèi)相/外相界面張力為0.5 mN/m，內(nèi)相0.2%黃原膠水溶液密度為1200 kg/m3，黏度為0.48 Pa·s，外相1.0%海藻酸鈉水溶液密度為1135 kg/m3，黏度為0.30 Pa·s，空氣密度為1.225 kg/m3，黏度為1.79×10-5Pa·s.

1.2.5 水/水微囊的pH響應和可控釋放 分別用HCl溶液和檸檬酸鈉調(diào)節(jié)溶液pH為1.0或8.0，靜置觀察水/水微囊在酸性或堿性溶液中隨時間的變化.

如表1所列測點偏移量對應關系，解析程序即按此進行數(shù)據(jù)包解析，同時生成一項測點信息的配置表存儲在數(shù)據(jù)庫中，便于之后作為某臺盾構(gòu)的特征信息查看。在生成測點信息配置表過程中，以各測點所屬盾構(gòu)機子系統(tǒng)分組，如此在后續(xù)對盾構(gòu)機子系統(tǒng)部件進行分析時提供便利，如圖3。

1.2.6 平行放大微流控器件的設計和水/水微囊的高通量制備 首先通過微通道流動阻力分析，設計平行放大10通道微流控器件，微流控器件內(nèi)相主管道直徑4.0 mm，內(nèi)相分管道直徑0.5 mm，外相主管道直徑3.5 mm，外相分管道直徑1.2 mm.然后通過三維建模軟件SolidWorks建立微流控器件模型.最后通過光固化3D打印機直接打印微流控器件.

2 結(jié)果與討論

2.1 同軸微流控器件的設計和水/水微囊的制備

為了實現(xiàn)一步法制備大小均勻、尺寸可控、壁厚可調(diào)、生物相容的水/水微囊，需要設計同軸微流控器件，如圖1（A）所示.內(nèi)相黃原膠水溶液由內(nèi)管注入微流控器件；外相海藻酸鈉水溶液，由外管注入微流控器件.內(nèi)相在外相的剪切下形成液滴，同時外相在重力作用下脫離管口生成水包水的水/水微囊，并進一步通過鈣離子交聯(lián)海藻酸鈉水凝膠網(wǎng)絡，如圖1（B）所示.由于微流控器件對內(nèi)外相的精準調(diào)控，水/水微囊在光學顯微鏡下具有清晰穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu)［圖1（C）］，平均尺寸（D）為（2.83±0.09）mm［圖1（D）］.該方法制備水/水微囊具有器件結(jié)構(gòu)簡單、操作便捷、一步法成型、微囊尺寸均一可控、核殼結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、無需后處理等優(yōu)點［圖1（E）］.

Fig.1 Design and preparation of water/water microcapsules

2.2 微流控器件結(jié)構(gòu)對水/水微囊成型過程的影響

為了深入研究微流控器件結(jié)構(gòu)對水/水微囊成型過程的影響規(guī)律，分別制備了內(nèi)管管口內(nèi)縮、內(nèi)外管管口平齊、內(nèi)管管口伸出、內(nèi)管管口內(nèi)縮外管管口不拉伸等4種同軸微流控器件，并通過系統(tǒng)改變內(nèi)相和外相流速，判斷水/水微囊的成型情況，最終確定水/水微囊的制備相圖，分別如圖2（A）～（D）所示.水/水微囊形成的關鍵是內(nèi)相在外相的剪切下形成液滴，同時外相在重力作用下脫離管口生成水/水微囊.由于內(nèi)外相均是水溶液，內(nèi)相/外相界面張力較小，并且流體黏度較大，內(nèi)相不容易在外相的剪切下形成液滴，進而被外相包裹形成水/水微囊，因此外相流速增大，對內(nèi)相剪切加強，更易形成水/水微囊.

此外，內(nèi)管管口內(nèi)縮和外管管口拉伸，有利于外相在外管管口處通過流動聚焦剪切內(nèi)相，因此內(nèi)管管口內(nèi)縮和外管管口拉伸的同軸微流控器件制備水/水微囊內(nèi)核居中，壁厚均勻，且具有較好的穩(wěn)定性和較大的制備區(qū)間.當外管管口不拉伸時，外相對內(nèi)相的剪切作用減弱，其水/水微囊的制備區(qū)間變窄，且在較大流速區(qū)間內(nèi)，只能得到變形的水/水微囊，如圖2（D）所示.通過實驗觀察，若無特別說明，后續(xù)均采用內(nèi)管管口內(nèi)縮和外管管口拉伸的同軸微流控器件制備水/水微囊.

Fig.2 Tuning of water/water microcapsules by coaxial microfluidic devices

2.3 內(nèi)相/外相流速對水/水微囊直徑和壁厚的影響

微流控技術的優(yōu)點在于對內(nèi)相/外相流速及其乳化過程的精準控制.因此可以調(diào)節(jié)內(nèi)相/外相的流速，研究其對水/水微囊直徑和壁厚的影響，如圖3（A）和（B）所示.當內(nèi)相流速為40 mL/h，外相流速為20 mL/h時，水/水微囊的直徑和壁厚分別為2.92和0.06 mm，尺寸偏差小于5%，裝載率（水核體積/微囊體積）高達87%.由于水/水微囊直徑的大小主要取決于微囊從微流控器件管口脫落的過程，與外相/空氣界面張力和內(nèi)外相重力的共同作用有關，界面張力使微囊懸掛在管口，重力使微囊脫離管口，可以用邦德數(shù)Bo（重力/界面張力）描述.由于界面張力和重力均與內(nèi)相/外相流速無關，水/水微囊的直徑基本不隨內(nèi)相/外相流速變化.在水/水微囊直徑不變的情況下，其壁厚的大小主要取決于內(nèi)相與外相的比例.因此內(nèi)相流速增加或外相流速減小，都將造成水/水微囊壁厚減小.

Fig.3 Effect of inner phase flow rate on the diameter and wall thickness of water/water microcapsules(the outer phase flow rate:20 mL/h)(A),effect of outer phase flow rate on the diameter and wall thickness of water/water microcapsules(the inner phase flow rate:15 mL/h)(B)

2.4 水/水微囊形成過程的數(shù)值模擬

在微流控器件中，水/水微囊的形成受內(nèi)相/外相流速、黏度、界面張力等因素影響［43，44］.為了進一步驗證實驗結(jié)果和指導實驗設計，通過參照實驗流體物性參數(shù)，對水/水微囊形成過程進行了數(shù)值模擬，如圖4（A）所示.隨著懸掛在管口處的液滴不斷長大，重力逐漸增大，最終克服界面張力，出現(xiàn)頸縮現(xiàn)象，液滴脫離管口，形成水/水微囊.

Fig.4 Numerical simulations showing the formation of water/water microcapsules

數(shù)值模擬與實驗結(jié)果具有較好的一致性，數(shù)值模擬內(nèi)相/外相流速對水/水微囊直徑和壁厚的影響，得出了與實驗數(shù)據(jù)一致的規(guī)律，即水/水微囊的直徑基本不隨內(nèi)相/外相流速的變化而變化，而水/水微囊壁厚隨內(nèi)相流速增加或外相流速減小都將減小，如圖4（B）和（C）所示.與實驗相比，數(shù)值模擬可以更系統(tǒng)地調(diào)節(jié)各個參數(shù)，如外相/空氣界面張力、內(nèi)相/外相界面張力對微囊直徑和壁厚的影響［圖4（D）和（E）］.隨著外相/空氣界面張力的增加，水/水微囊直徑成比例增加，這是由于外相/空氣界面張力使微囊懸掛在管口，重力使微囊脫離管口，當外相/空氣界面張力增加，需要的重力相應增加，造成水/水微囊直徑增加.當內(nèi)相/外相界面張力增大時，水/水微囊直徑略有增加.

數(shù)值模擬還研究了內(nèi)相黃原膠水溶液濃度和外相海藻酸鈉水溶液濃度對水/水微囊直徑和壁厚的影響規(guī)律，如圖4（F）和（G）所示.內(nèi)相黃原膠水溶液屬于剪切變稀非牛頓流體，其黏度隨剪切速率的增大而減小，因此不同濃度的黃原膠水溶液具有相似的剪切變稀流變曲線，對水/水微囊直徑和壁厚的影響較小.外相海藻酸鈉水溶液也是一種非牛頓流體，其黏度隨濃度增大而增大.當海藻酸鈉溶度增加時，包裹內(nèi)相難度增大，水/水微囊的生成開始伴隨內(nèi)相衛(wèi)星液滴的出現(xiàn)，造成微囊壁厚增加.

Fig.5 pH response and controlled release of water/water microcapsules

2.5 水/水微囊的pH響應和可控釋放

所制備的水/水微囊具有良好的生物相容性、尺寸均一性及較高的包裹率和裝載率，是各種活性物質(zhì)的理想載體，并且能夠?qū)H變化做出響應，實現(xiàn)可控釋放.如圖5（A）所示，水/水微囊的殼層是由二價鈣離子交聯(lián)的海藻酸鈉水凝膠組成，在酸性環(huán)境下具有良好的穩(wěn)定性，但在堿性環(huán)境下海藻酸鈉水凝膠與二價鈣離子的結(jié)合能力變?nèi)?，交?lián)網(wǎng)絡被破壞，從而釋放內(nèi)核活性物質(zhì).如果在溶液中加入檸檬酸鈉，二價鈣離子更傾向于與檸檬酸根結(jié)合，從而破壞交聯(lián)網(wǎng)絡，也可以溶解水/水微囊［圖5（B）］.如圖5（C）所示，水/水微囊的溶解速率隨pH的增大而提高.當水/水微囊的囊壁被溶解后，內(nèi)核物質(zhì)逐漸被釋放出來，展現(xiàn)出良好的pH響應性和可控釋放［圖5（D）］.

2.6 平行放大微流控器件的水/水微囊的高通量制備

如圖6（A）和（B）所示，平行放大微流控器件采用梯形結(jié)構(gòu)設計，微流控器件由一個主干通道和多個分支通道組成，每個分支通道組成一個水/水微囊生成器.流體在微通道內(nèi)的流動類似電流在電路中的傳輸［45］，微通道兩端的壓力差（ΔP）類似電壓，微通道的流動阻力（R）類似電阻，類比微通道中流體的流量（Q）類似電流，且具有類似歐姆定律關系式Q=ΔP/R.在平行放大微流控器件中，每個微通道壓力差ΔP一致，但由于離總?cè)肟诰嚯x不同，每個微通道的流動阻力不同，第N個分支通道阻力為Ru+NRc（其中，Ru是分支通道流動阻力，NRc是N段主干通道流動阻力Rc）.為了保證每個微囊生成器的流量一致，生成的微囊尺寸均一，需要保證主干通道的流體均勻分配至每個分支通道，即NRc?Rc，Q=ΔP/（Ru+NRc）≈ΔP/Ru.由于圓形微通道在層流狀態(tài)下的流動阻力［46，47］為R∝μl/d4（其中，μ是流體的黏度；l是微通道的長度；d是微通道的直徑），由此可見，流動阻力主要受微通道直徑影響.計算分析表明，采用內(nèi)相主干通道直徑4 mm，分支通道直徑0.5 mm，保證NRc＜0.01Ru，可實現(xiàn)各內(nèi)相分支通道流量相同.以此類推，采用外相主干通道直徑3.5 mm，分支通道直徑1.2 mm（由于外相分支通道采用同軸設計，分支通道橫截面積實際有效直徑為0.4 mm）.

Fig.6 High-throughput preparation of water/water microcapsules by parallel amplification of microfluidic devices

在確定平行放大微流控器件通道結(jié)構(gòu)尺寸設計后，通過SolidWorks建立三維模型，并利用光固化3D打印機直接打印微流控器件［圖6（C）］.實驗表明，10個并排微流控通道均可以穩(wěn)定生成水/水微囊，并且所生成的微囊具有較一致的尺寸大小和較均勻的分散性［圖6（D）］.綜合統(tǒng)計10個微流控通道形成的微囊分布，可以得到D=（2.75±0.10）mm［圖6（E）］.在10個平行微流控通道設計下，水/水微囊的產(chǎn)率可以達到0.5 kg/h，并可依據(jù)相同原理，進一步增加平行通道的數(shù)量，提高產(chǎn)率，實現(xiàn)尺寸均一水/水微囊的高通量制備［圖6（F）］.

3 結(jié) 論

采用玻璃毛細管設計同軸微流控器件，結(jié)合數(shù)值模擬優(yōu)化和流動阻力分析，實現(xiàn)一步法高通量可控制備大小均勻、尺寸可控、壁厚可調(diào)、生物相容的水/水微囊.在實驗研究與數(shù)值模擬相結(jié)合下，揭示了器件結(jié)構(gòu)、內(nèi)相/外相流速、界面張力、內(nèi)相/外相黏度等參數(shù)對水/水微囊直徑、壁厚的影響規(guī)律，并實現(xiàn)了水/水微囊的可控制備.該方法制備水/水微囊具有器件結(jié)構(gòu)簡單、操作便捷、一步法成型、高通量、微囊尺寸均一可控、核殼結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及無需后處理等優(yōu)點.所制備的水/水微囊具有良好的生物相容性和尺寸均一性以及較高的包裹率和裝載率，是各種活性物質(zhì)的理想載體，并且能夠?qū)H變化做出響應，實現(xiàn)可控釋放.最后通過微通道流動阻力分析，設計多通道平行放大微流控器件，實現(xiàn)了尺寸均勻可控水/水微囊的高通量制備，為水/水微囊在藥物遞送、醫(yī)學治療等領域的應用進一步奠定了基礎.