肉類摻假檢測技術(shù)研究進(jìn)展

余卉茹，紀(jì)藝，彭城，徐曉麗，汪小福，孫梅好*，陳笑蕓*

1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，杭州310021

食品是人類生存和發(fā)展最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，食品安全已成為世界公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點。蛋白質(zhì)是維持人體健康的必需物質(zhì)，而肉類食品中富含蛋白質(zhì)和微量元素，故在食品消費中占比較高。近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，肉制食品的需求也不斷提高，部分不良商家為獲取更多經(jīng)濟(jì)效益而在肉類中摻假，嚴(yán)重侵害了消費者的合法權(quán)益，也極大地危害了食品安全。因此，亟需相應(yīng)的檢測技術(shù)，以確定肉制品中成分的真實性和準(zhǔn)確性，保障食品安全。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，肉類制品的檢測水平也逐漸提高。傳統(tǒng)的物理方法是通過顯微鏡觀察肉類樣品的顆粒形態(tài)學(xué)構(gòu)造來區(qū)分不同動物組織，該方法檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性較少，熱穩(wěn)定性能也較為理想，但通過顯微鏡觀測結(jié)果受主觀因素影響較多，分辨率也無法保證，并且無法有效區(qū)分動物種類［1］。近年來，以蛋白質(zhì)和核酸為基礎(chǔ)的肉類摻假檢測技術(shù)逐漸興起，研究表明，利用免疫學(xué)方法可以定量地測定出動物源成分［2-5］。其中微孔板ELISA 在定量靶標(biāo)表征上有較高的精確度［6-7］。Macedo-Silva 等［8］采用ELISA 檢測法制作抗牛、馬、豬、雞蛋白的抗血清來鑒別漢堡中可能摻入的廉價肉類成分，靈敏度為0.6%。胡連霞等［9］研究發(fā)現(xiàn)GNM C7-8 實時熒光PCR 檢測法能夠?qū)ν瑫r添加4 類假肉的成分進(jìn)行檢測，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測。本文分別從傳統(tǒng)物理技術(shù)、光譜技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)和DNA 分析技術(shù)等角度，分析和闡述肉類和肉類制品中具有的動物源性成分檢測方法以及鑒別技術(shù)，并對優(yōu)缺點進(jìn)行對比分析，旨在為進(jìn)一步的研究和標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論依據(jù)。

1 市場上常見的肉類摻假形式

肉類富含蛋白質(zhì)，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，已成為大家餐桌上必不可少的美味，且每年肉類市場需求量較大。在此情況下，部分不良商家為獲取更高的經(jīng)濟(jì)效益將價格較低的肉類摻雜進(jìn)高價肉類中出售，這嚴(yán)重影響了肉類市場的流通和消費者的健康［10］。按照摻假嚴(yán)重性，肉類摻假可分為3 類［11］。第1 類是將低價肉類如鴨肉等加入到牛羊肉中以高價出售，這種摻假方式在生活中最為常見，且牛羊肉制品經(jīng)常作為火鍋食材，通過調(diào)味，很大程度上掩蓋了牛羊肉原有的味道，使得消費者難以簡單地從感官上進(jìn)行辨別；第2 種是利用一些如馬肉、狐貍?cè)庖约八跞獾确强墒秤玫娜忸愡M(jìn)行摻假，這些肉類大多是由生產(chǎn)皮毛的養(yǎng)殖場提供的，在動物飼養(yǎng)過程中往往無節(jié)制的使用藥物，因此，這類肉制品中存在很大的安全隱患；第3 種是利用來源不明確的非可食用肉類在牛羊肉中摻假，如流浪貓、流浪狗、老鼠等未經(jīng)過正規(guī)的食品安全檢測的肉類，此類摻假方式多見于流動商販，因其無固定場所，無法追蹤，而且食用這些肉制品后極易感染疫病，因此，安全隱患極大。

2 傳統(tǒng)物理學(xué)鑒別方法

傳統(tǒng)的肉類摻假鑒別方法是以組織學(xué)特性和解剖學(xué)為基礎(chǔ)，通過肉品自身特征和脂肪特征對其品種進(jìn)行確定，主要通過色澤、氣味和味道等，并對肉類品質(zhì)的鑒定提供依據(jù)［12］。羊肉和其他肉類相比更加鮮嫩，并且膽固醇與脂肪含量均低于牛肉和豬肉。此外，鏡檢法也可用于檢測肉制品中的動物源性成分，其是物理鑒別中唯一一個被歐盟官方認(rèn)可的方法［13］，該方法可對哺乳動物、魚類、禽類等的肉質(zhì)進(jìn)行觀察從而區(qū)分，但不能鑒別出具體的動物種類。

3 基于光譜法的鑒別方法

不包括蛋白質(zhì)與核酸在內(nèi)的其他化合物均屬于生物體內(nèi)的代謝物質(zhì)，如脂類、糖類大分子和一些小分子的代謝物，但在檢測代謝物方面當(dāng)前僅針對少部分的小分子代謝物，并且它們的分子質(zhì)量均未超過2 kD。根據(jù)相關(guān)研究可知，動物種屬的辨別可以借助肉類中氨基酸、酚類和糖類等代謝物含量和構(gòu)成來實現(xiàn)［14-16］。目前應(yīng)用較為廣泛的有色譜法、質(zhì)譜法、光譜分析法等，其中光譜分析法是以原子、分子的光譜學(xué)為依據(jù)而建立的，其利用各種樣品的光譜來分辨物質(zhì)，同時，對其化學(xué)成分含量進(jìn)行判定。通常用于研究物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和組成，是一種在食品飼料動物成分檢測鑒別中的有效方法，主要優(yōu)勢為無污染、無損傷、成分檢測效率高等［17］。紅外吸收光譜和拉曼光譜自20 世紀(jì)70 年代就被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品和有機(jī)物的成分鑒定，因此，小分子代謝物內(nèi)的C、H、O、N之間的化學(xué)鍵與官能團(tuán)的表示均可以采用該方法，從而進(jìn)行定量和定性檢驗［1］。肉糜因為物種和組織特定形態(tài)特征不易被識別，成為了一種極易摻假的食品，故Lemonia-Christina 等［18］基于光譜技術(shù)，利用牛肉、雞肉、豬肉等不同程度摻假的120 個樣品進(jìn)行可見光光譜（visible，VIS）、熒光光譜（fluorescence，F(xiàn)luo）、多光譜圖像（multispectral image，MSI）采集，建立并評價了支持向量機(jī)分類模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光譜數(shù)據(jù)在檢測和定量肉糜摻假方面具有較大的應(yīng)用潛力，其中基于MSI 的模型優(yōu)于基于其他傳感器的模型，其精確度為87%～100%，基于Vis 的模型精確度為57%～97%，而基于Fluo 的模型精確度較低，但3 種方法均能檢出樣品。

3.1 拉曼光譜法

拉曼光譜法是通過物質(zhì)分子光散射作用下的非破壞指紋成像技術(shù)，其可對各種照射光的頻率進(jìn)行散射光譜研究，能夠獲取分子轉(zhuǎn)動與振動的相關(guān)數(shù)據(jù)，從而完成分子結(jié)構(gòu)的分析。Fowler等［19］指出拉曼光譜技術(shù)可以對食品中的主要成分含量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，且可定量檢測某種成分的含量，因此，可以運用于食品成分檢測中。拉曼光譜法具有重復(fù)性能好、靈敏高、操作簡單等優(yōu)點［20-21］。

3.2 紅外光譜法

紅外光譜一般分為遠(yuǎn)紅外、中紅外和近紅外3 大區(qū)域，該方法主要是針對分子呈現(xiàn)偶極矩變化且振動狀態(tài)的化合物進(jìn)行分析，不同紅外輻射波長對應(yīng)的吸收效果也存在差異，可利用光譜圖中吸收峰的波長、形狀與強(qiáng)度開展物質(zhì)的研究。一般情況下分子結(jié)構(gòu)特征可以通過吸收譜帶長度與紅外吸收帶波長真實位置來體現(xiàn)，這在未知物質(zhì)化學(xué)基團(tuán)與分子結(jié)構(gòu)的研究有非常關(guān)鍵的作用和價值［4］；另外，化學(xué)基團(tuán)或者分子構(gòu)成通常會影響譜帶吸收強(qiáng)度，故其既能夠檢測物質(zhì)純度，也能夠完成定量分析。

近年來，紅外光譜因效率高、快捷、操作簡單等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于食用油、蜂蜜、奶制品以及肉制品摻假、鑒別檢測等方面。任再琴等［22］在紅外光譜的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，利用紅外光譜法檢測食用油并建立相應(yīng)的校正模型，可以準(zhǔn)確的鑒別出某種食用油中是否摻入其他成分。此法也可以有效地應(yīng)用于檢測羊肉是否摻假。方瑤等［23］將近紅外光譜、PLSR 偏最小二乘法及MSC 多元散射校正算法聯(lián)合對金鯧魚魚肉進(jìn)行檢驗，結(jié)果表明預(yù)測集均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）為1.845 4，決定系數(shù)（decision coefficient，R2）為0.884 1，即基于以紅外光譜法為基礎(chǔ)的預(yù)測模型檢測金鯧魚肉質(zhì)精確度較高。

4 基于免疫學(xué)的鑒別方法

免疫檢測技術(shù)可以精確地確定肉類中的動物源性成分，因而被廣泛應(yīng)用于肉類摻假的檢測中，常見的檢測技術(shù)包括試管沉淀法、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散法、放射免疫法、免疫組化、對流免疫電泳法和酶聯(lián)免疫法［24］，其中應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免疫法（又稱ELISA 技術(shù)），該方法利用酶來檢測樣品中的抗體或者抗原，具有操作簡單、靈敏性高、特異性強(qiáng)等特點［8，25］。

4.1 環(huán)狀沉淀法

環(huán)狀沉淀法是通過抗體和抗原特異性融合產(chǎn)生肉眼可見的沉淀物。李景鵬等［26］利用環(huán)狀沉淀法對牛肉中是否摻入馬肉進(jìn)行檢測，通過觀察發(fā)現(xiàn)，可通過已知血清與肉樣是否產(chǎn)生沉淀來辨別肉類是否摻假，該方法具有可視、快速、操作簡單、特異性好等優(yōu)勢。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA 又稱酶標(biāo)法，其是以免疫酶為前提研究而形成的技術(shù)［27］。ELISA 技術(shù)原理為有效融合待檢樣品與酶標(biāo)抗體或者抗原，然后將其吸附于固相抗原或者抗體上，在其表面完成相應(yīng)反應(yīng)，液相內(nèi)游離成分通過洗滌劑完成清洗，然后添加酶底物顯色，定性分析依據(jù)顏色的深淺來完成；而且被檢物質(zhì)與產(chǎn)物的含量之間存在一定聯(lián)系，所以也可以開展定量分析［28］。Cheng-Hsin等［29］在1995年的報道中指出，將多克隆抗體對抗血清蛋白的酶聯(lián)免疫可應(yīng)用于新鮮肉類的摻假檢測中，但不同肉樣間可能存在交互反應(yīng)，因此，可通過多克隆抗體免疫吸附親和層析減少交互反應(yīng)。此外，單克隆抗體為捕獲抗體（此抗體對肌肉可溶性蛋白具有專一性），制備夾層式酶聯(lián)免疫用以檢測牛肉或豬肉中是否含有雞肉；或通過將2 種不同的單克隆抗體植入乳酸脫氫酶中，以檢測牛肉或豬肉中是否含有火雞肉，該方法靈敏性高，甚至能檢測出低含量（≥1%）的雞肉或火雞肉。在Macedo-Silva 等［30］和駱訓(xùn)國等［31］的研究中也指出，酶聯(lián)免疫法可以對肉類摻假進(jìn)行有效檢測，不論是單一樣品還是混合樣品均表現(xiàn)出較好的特異性和靈敏性。

5 基于DNA生物學(xué)的分析技術(shù)

隨著人們生活水平的提高，對食品檢測的要求也不斷提高，以核酸為基礎(chǔ)的DNA 生物學(xué)檢測方法飛速發(fā)展。與蛋白質(zhì)相比，DNA 穩(wěn)定性、靈敏度均更高，即使對于經(jīng)過熱處理的肉制品也可進(jìn)行DNA 檢測，從而可有效避免食品加工方式對肉制品的影響［32］，因此，已逐漸成為了動物源性鑒定的主要方式。DNA 分析方法是通過分析線粒體或者核DNA 序列差異進(jìn)行檢測。在肉類實際鑒定過程中，PCR應(yīng)用最為廣泛，其可以獲得各個物種特異性的基因片段，并通過實驗設(shè)計引物并進(jìn)行擴(kuò)增而得到所需的目的片段。

5.1 常規(guī)PCR

各物物種或個體之間，基因組DNA 均有其各自的特點，且不易發(fā)生變異，故可利用種屬特異性的DNA 序列為靶標(biāo)完成PCR 反應(yīng)，該方式靈敏性較高，已逐漸成為了檢測肉類是否摻假的重要方法之一［33-35］。線粒體DNA 是裸露的環(huán)狀DNA 雙鏈分子，基因組通常較?。?5～20 kb），并且在動物組織中1 個細(xì)胞中含有多個線粒體DNA，數(shù)量較多，故線粒體DNA 被廣泛應(yīng)用于實驗研究。陳穎等［36］和Martín 等［37］分別利用牛、羊線粒體DNA序列（來自tRNA-lys、ATP8 和ATP6 的部分序列）和線粒體12S rRNA 設(shè)計了引物和探針，分別對牛肉、羊肉和鴨肉成分進(jìn)行快速檢測，結(jié)果表明，牛源性成分的檢測限度最小為0.05%，山羊、綿羊源性成分對應(yīng)的最低檢測限依次為0.005% 和0.5%，鴨肉的則是0.1%～1.0%。Martin 等［37］還對鴨肉進(jìn)行了熱處理，以探究高溫處理后的肉類樣品是否能進(jìn)行摻假檢測，結(jié)果證明經(jīng)過處理的樣品靈敏度也較高。Soares 等［38］在單一PCR 檢測的基礎(chǔ)上，以線粒體cytb和12S rRNA 為目標(biāo)基因開發(fā)了1 種針對特定物種的雙重PCR 方法，其靈敏度可達(dá)0.1%，重復(fù)性也較為理想，為混合肉類的摻假檢測提供了良好的方法。René 等［39］、Karola等［40］和Thitika［41］建立并研究了多重PCR 方法，并在原有靈敏度的基礎(chǔ)上提高了檢測的效率，可同時檢測多個肉樣，且Thitikat［41］的實驗還證明了該方法對市場銷售的樣品檢測也呈現(xiàn)出較好的效果。

5.2 實時熒光定量PCR

檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時，若應(yīng)用常規(guī)PCR 技術(shù)只能檢測終點，實時熒光定量PCR 技術(shù)是將熒光基團(tuán)融入到PCR 反應(yīng)系統(tǒng)中，對熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行觀測從而觀察實驗全過程，其中指數(shù)增長階段數(shù)據(jù)分析最為適用，并且樣品DNA 含量與Ct值（循環(huán)數(shù)）二者間的關(guān)系為線性，因此，樣品的定量分析可在完成標(biāo)準(zhǔn)曲線制定后開展［38，42］。實時熒光定量PCR 可分為SYBR Green real-time PCR 和Taq-Man real-time PCR。SYBR Green real-time PCR 熒光染料可以實現(xiàn)以特異性方式插入DNA 雙鏈中，并將熒光信號輸出，SYBR 熒光染料未插入DNA雙鏈中則分子不會出現(xiàn)熒光，對于熒光信號觀察過程中通過熒光信號的強(qiáng)弱程度來確定PCR 產(chǎn)物含量。DNA 擴(kuò)增后，該技術(shù)可以通過溶解曲線對單堿基突變進(jìn)行檢驗［43］。TaqMan real-time PCR熒光強(qiáng)度改變是通過熒光標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)解離來實現(xiàn)的。在探針完整的情況下，猝滅基團(tuán)可以將報告基團(tuán)的熒光信號吸收；而擴(kuò)增過程中，探針被酶切，2 個基團(tuán)分離，故產(chǎn)生熒光信號并被接收，最終通過熒光信號的強(qiáng)弱來觀測產(chǎn)物的形成。這樣的方式主要特點是模板與探針融合和水解使特異性更強(qiáng)，而且不需要進(jìn)行電泳，簡化了流程，可實現(xiàn)單個反應(yīng)將多種肉類同時進(jìn)行鑒定的目的。

Wang 等［44］以TaqMan real-time PCR 為基礎(chǔ)，根據(jù)牦牛細(xì)胞色素B 基因設(shè)計特異性引物和探針，并與其他動物物種的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，擴(kuò)增曲線僅牦牛能夠形成，并且與其他物種DNA 之間不存在交叉反應(yīng)，靈敏度可達(dá)到0.001%，對牛肉的摻假檢測具有重要意義。李亮等［45］則利用牛線粒體和16S rDNA 內(nèi)參基因進(jìn)行相應(yīng)的試驗，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中牛的DNA 水平和總DNA 水平，以此計算出回收率（平均回收率為98.62%）。由于線粒體DNA在不同組織中拷貝數(shù)不同，而細(xì)胞核DNA 具有高度保守性和一致性，且在同一物種的不同細(xì)胞中拷貝數(shù)基本一致。所以目標(biāo)基因的設(shè)立除了線粒體，還可以是核基因。Li等［46］利用單拷貝核基因設(shè)計引物和探針并運用熒光定量PCR 的方法進(jìn)行了羊肉的摻假檢測，由于在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，若僅應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量會存在一定的誤差，因此，該試驗中引入了1 個常數(shù)（修正因子）將摻假肉中的DNA 濃度轉(zhuǎn)化為目標(biāo)肉類所占的比例，以此提高肉類摻假檢測的準(zhǔn)確性。

5.3 數(shù)字PCR

實時熒光定量PCR 在肉及其制品的檢測上可以準(zhǔn)確的定性或定量，但也存在較多影響其擴(kuò)增效率的因素，導(dǎo)致Ct值發(fā)生變化，進(jìn)而使標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)偏差，最終導(dǎo)致實驗誤差。然而，隨著相關(guān)檢測部門的要求越來越高，實時熒光定量PCR 已無法滿足實際需求。數(shù)字PCR 不依靠循環(huán)閾值完成定量，而且擴(kuò)增效率不會被其他因子影響，因此，可實現(xiàn)DNA 復(fù)制數(shù)量的絕對定量，重復(fù)性和準(zhǔn)確性均較理想。ddPCR 一般先完成PCR 擴(kuò)增，然后再研究熒光信號，PCR 擴(kuò)增時稀釋待測樣品為單分子后再實驗，并在擴(kuò)增結(jié)束后采集各個反應(yīng)單元的熒光信號，然后利用泊松分布計算所測樣品DNA 的原始含量和大?。?7］。王珊等［48］建立了羊肉和豬肉源性的數(shù)字PCR 方法，并與SN/T2051—2008 標(biāo)準(zhǔn)［49］下的實時熒光定量PCR 方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，數(shù)字PCR 的準(zhǔn)確性更高。Chen 等［50］應(yīng)用數(shù)字PCR 定量檢測了羊肉單拷貝基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品質(zhì)量和DNA 拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，并將牛肉加入到樣品中作為內(nèi)標(biāo)，通過線性曲線的繪制，靶基因拷貝數(shù)可直接轉(zhuǎn)換為樣品質(zhì)量進(jìn)行計算，實驗發(fā)現(xiàn)對于羊肉源性成分為0.01%的情況下，對應(yīng)的結(jié)果是0.12 copies·μL-1，表明其可以準(zhǔn)確定量含量在5%以上的羊肉源性成分。Wang等［51］基于數(shù)字PCR技術(shù)，建立了一種高精度的肉制品中山羊和綿羊含量的定量分析方法；同時，建立了DNA 拷貝數(shù)的生肉重量計算公式。結(jié)果顯示山羊和綿羊檢測限和定量限分別為1 copies·μL-1和5 copies·μL-1。

5.4 等溫擴(kuò)增檢測技術(shù)

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinant enzyme polymerase amplification，RPA）是利用重組酶和引物形成的蛋白-DNA 復(fù)合物在雙鏈DNA 中找到同源序列，然后發(fā)生鏈交換反應(yīng)并啟動DNA 合成對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)級擴(kuò)增的技術(shù)方法。防止肉類摻假，確定肉類和肉制品中的動物來源是關(guān)鍵，傳統(tǒng)方法操作存在技能要求較高、儀器昂貴等不足，而且不能提供快速移動現(xiàn)場檢測系統(tǒng)檢測肉制品中的污染物，因此，僅依靠RPA 技術(shù)不能直觀反映出肉類中是否摻假。Lin 等［52］、Fu等［53］和李婷婷［54］均在RPA 技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合了橫向流動試紙，通過試紙的顯色功能，肉眼即可觀測到實驗結(jié)果并進(jìn)行判斷，該方法準(zhǔn)確性良好且整個實驗均能在30 min 內(nèi)完成，可明顯減少測試時間，為現(xiàn)場快速檢測提供了一種更加方便、快捷的檢測手段。值得注意的是，Lin等［52］還對高溫處理后的肉樣進(jìn)行檢測以探究不同的烹飪手法是否會對實驗結(jié)果造成影響，最終測得鴨肉、牛肉、綿羊、雞肉和豬肉的檢測限分別為101、102、102、101和101copies·μL-1。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳和紫外光觀測等步驟，其是一種能夠在短時間（一般為1 h 內(nèi)），且在恒定溫度（通常為60～65 ℃）下即可進(jìn)行的核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有操作簡便、反應(yīng)快速、結(jié)果精確且成本低等優(yōu)點。朱凱［55］利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)分別對豬肉、驢肉、兔肉進(jìn)行檢測，通過對實驗溫度的優(yōu)化和體系的優(yōu)化，最終得出豬肉、驢肉、兔肉的實驗體系最適溫度分別為57、59、65 ℃，最低檢出限分別為1、1、8 pg。整個反應(yīng)可在20 min 內(nèi)完成，操作簡單、快速，且能特異性的區(qū)分目標(biāo)肉類。何藝梅等［56］也通過LAMP 技術(shù)對市場和超市中的牛羊肉進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)市售牛肉制品摻入的通常為豬肉和雞肉，而羊肉制品中摻入的通常為豬肉和鴨肉，其為肉類摻假檢測提供了可靠的方法。Girish等［57］使用堿性裂解（alkaline cleavage，AL）方法提取DNA，然后用LAMP 擴(kuò)增豬的mt-D 環(huán)區(qū)。在121 °C、30 min 熱處理肉類樣品中獲得了可靠的擴(kuò)增。該方法能夠檢測0.1%混合濃度的牛肉中的豬肉，DNA檢測限為0.5 ng·μL-1。

5.5 DNA條形碼和下一代測序

基于DNA 的檢測方法主要是針對特定靶向目標(biāo)的檢測，但在肉類摻假檢測過程中，還有很多未知的肉類物種較難識別［58］。根據(jù)此類檢測需求發(fā)展了一種新型的檢測方式，即DNA 條形碼技術(shù)［59-60］，指生物體內(nèi)相對較短的DNA片段，這些片段能代表該物種，具有足夠多的變異且易擴(kuò)增。該技術(shù)方法常用于生態(tài)學(xué)研究中的物種鑒定，故也可作為肉類檢測的重要檢測工具。早期的DNA 條形碼和微條形碼技術(shù)主要是依賴于動物細(xì)胞色素C 亞基Ⅰ（COⅠ）基因（約650 bp）區(qū)域標(biāo)記進(jìn)行Sanger DNA 測序［61-62］，隨后可在生命數(shù)據(jù)條形碼系統(tǒng)和美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，從而識別出摻假的肉類物種［63］。Hanan等［64］在實驗中結(jié)合DNA條形碼方法和數(shù)字PCR的方法對香腸中的肉類進(jìn)行摻假檢測。結(jié)果顯示，DNA 條形碼可以有效地檢測出香腸中的主要肉類，但在混合肉類中進(jìn)行定量分析的潛力有限。在現(xiàn)實生活中，多數(shù)食品進(jìn)行了一些中度或高度的加工，DNA 的質(zhì)量可能受到了嚴(yán)重的影響，而大多數(shù)加工樣品的降解會阻止長度超過250 bp 的片段PCR 擴(kuò)增［65］。此外，引物結(jié)合位點的降解也可能阻止COⅠ的擴(kuò)增［66］，因此，從樣品中進(jìn)行全長條形碼的PCR 擴(kuò)增可能具有挑戰(zhàn)性［65，67］。Xing 等［68］研究結(jié)果表明，52 個動物源性產(chǎn)品中只有29 個（56%）樣品顯示全長COⅠ的PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物測序成功，隨后使用了一套16S rRNA 通用引物，用于擴(kuò)增16S rRNA 基因的短片段，通過PCR 反應(yīng)擴(kuò)增和測序鑒定動物物種，最終所有的DNA 提取均產(chǎn)生了PCR 反應(yīng)產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠上可以看到預(yù)期大小的單條帶。從52個樣本中共獲得了49個微條形碼序列，成功測序的微條形碼的平均長度為199～225 bp。44 個樣本顯示與基因庫中物種條目的遺傳相似性≥98%，其中，完整的COⅠ條形碼結(jié)果顯示為1個物種，而微DNA 條形碼則揭示了4 個物種，提高了實驗的準(zhǔn)確性。然而，當(dāng)肉制品中含有較多種類的摻假成分時，傳統(tǒng)的Sanger 測序會產(chǎn)生多個或重疊的測序峰，從而導(dǎo)致錯誤的序列信息［69］。在此情況下，利用下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)有望在復(fù)雜樣品中實現(xiàn)多物種鑒定的方法。下一代DNA 測序的基本原理是在納米空洞中配置納米電極，用電測方法測量1 個DNA 的核酸堿基排列。Geoffrey 等［70］利用NGS 技術(shù)對4 種不同的肉類混合物進(jìn)行檢測，以評估該方法的準(zhǔn)確度、特異性和靈敏度，結(jié)果表明，所有測試樣品均能夠正確檢測和識別不同的物種，包括摻入1%時的摻雜物種。為提高測試加工樣品的適用性，該實驗在20 個牛肉樣本中加入1%的豬肉和1%的馴鹿肉，并在100 ℃下蒸煮270 min，以模擬制備膳食的熱工業(yè)過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些樣本中均檢測到馴鹿肉，并在19 個樣本中檢測到豬肉，最終得出NGS 工具的靈敏度接近1%。

5.6 其他核酸檢測技術(shù)

除上述的檢測方法外，還有很多基于核酸的檢測技術(shù)，如RAPD 指紋圖譜具有物種特異性，使用任意引物針對DNA 中的多個序列，產(chǎn)生復(fù)雜的圖譜，允許同時對多個位點進(jìn)行比較。因此，可以在物種之間檢測到高水平的多態(tài)性。此外，RAPD-PCR 無需了解所研究物種的DNA 序列。然而，Arslan 等［71］指出，RAPD 指紋技術(shù)存在一些缺陷，如在含有50%～55%雜交物種混合物的產(chǎn)品中，無法識別原始物種。此外，RAPD 分析對嚴(yán)重降解的材料靈敏度較低，如經(jīng)過高壓處理的樣品。PCR-SSP 方法則是使用1 對物種特異性引物擴(kuò)增1 個基因片段，然后進(jìn)行電泳檢測。有研究者［72-73］對單一和多重的PCR 檢測進(jìn)行了研究，多重PCR 用其中一種引物瞄準(zhǔn)目標(biāo)基因的保守區(qū)域，引物根據(jù)物種的不同而存在差異，因此，許多不同長度的擴(kuò)增子可被擴(kuò)增；單一的PCR 方法可以同時檢測多個物種，降低了成本和時間，然而，由于其固有的復(fù)雜性、擴(kuò)增效率低以及對不同長度模板的可變靈敏度，使其不適合用于目標(biāo)基因的定量。此外，Rahmati等［74］發(fā)現(xiàn)在單管中使用多個引物可能會導(dǎo)致問題，如錯誤引物的PCR 產(chǎn)物或引物-二聚體的形成增加，以及長DNA 片段的擴(kuò)增識別；另一方面，雖然單一PCR 不能在1個反應(yīng)中檢測到多個物種，但其被證明敏感度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均較高。PCR-RFLP 方法為使用1 對一致的序列特異性引物對多個物種的1 個大擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增，然后用1個或1組限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，以產(chǎn)生1 個物種特異性的限制性內(nèi)切片段模式。該方法在本質(zhì)上比SSP 更準(zhǔn)確，可以通過鑒別真實產(chǎn)品，進(jìn)而用于鑒別近緣物種。Doosti等［75］在2014年用分子分析在牛肉類漢堡中鑒定出了摻假豬肉；同年，Kumar 等［75］利用Alu1 和Taq1 酶對cyt-b基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用于肉品鑒定，對PCR-RFLP 檢測的結(jié)果重復(fù)進(jìn)行了10次驗證，結(jié)果均一致。

6 展望

食品摻假問題作為全球性的公共問題將會長期存在，但是傳統(tǒng)的物理學(xué)方法，即依靠感官的形態(tài)學(xué)鑒別已經(jīng)不能滿足監(jiān)管與檢測要求。目前，探尋一種適用、簡便的鑒定方法具有重要意義。近年來，基于光譜、免疫學(xué)、核酸的檢測方法逐漸應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域，但對于經(jīng)過深加工處理的肉類，如牛肉干、鹵牛肉等檢測存在一定的局限，故研究開發(fā)可以精確檢測加工后樣品的方法對市場監(jiān)管的發(fā)展具有重要作用；其次，各種技術(shù)的檢測方法大多依賴于一些大型進(jìn)口儀器，僅有規(guī)模較大的實驗室中配備，增加了現(xiàn)場快速檢測的難度。因此，未來仍需開發(fā)操作簡便、低成本、儀器設(shè)備簡單便攜的方法，以提高現(xiàn)場檢測工作的效率。