朊病毒病治療方法的研究進(jìn)展

李書翔，安麗萍，梁德娟，王凱旋，趙建國(guó)

海南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，?？?70228

朊病毒病（prion disease）是由體內(nèi)正常朊蛋白（cellular prion protein，PrPC））在一定的條件下構(gòu)象改變而錯(cuò)誤折疊形成的一種具有抗蛋白酶水解特性的致病型羊癢病朊蛋白（pathogenic scrapie prion protein isoform，PrPSc）。PrPSc 主要通過(guò)沉積于人與動(dòng)物的中樞神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)而引發(fā)多種具有高度傳染性與致死性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括人庫(kù)魯病、人克雅氏癥、致死性家族型失眠癥、瘋牛病、羊瘙癢癥等，不僅影響畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，而且威脅人類的生命安全。世界衛(wèi)生組織曾預(yù)言，到2040 年，包括朊病毒病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率將上升至第2位，僅次于癌癥［1］。目前，臨床上尚無(wú)有效防治朊病毒病的方法，基于此，本文對(duì)目前朊病毒病治療方法進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，旨在為臨床防治朊病毒病提供參考依據(jù)。

1 傳統(tǒng)化學(xué)藥物

自1982 年發(fā)現(xiàn)PrPSc 起，人類即開始探尋治療朊病毒病的方法，首先對(duì)直接抑制PrPSc 的化學(xué)藥物進(jìn)行了篩選。早期研究指出多糖類化合物、雜環(huán)類化合物和抗生素等均能在一定程度上抑制PrPSc 增殖［1］。近年來(lái)，有研究者發(fā)現(xiàn)黃芩素［2］、樺褐孔菌乙醇粗提物［3］及白藜蘆醇［4-5］均有抑制PrPSc 的作用；同時(shí)，一些中藥提取物，如淫羊藿提取物［6］、鉤藤提取物［7］也有抑制PrPSc 的作用。但由于動(dòng)物體內(nèi)復(fù)雜的生理生化條件、血腦屏障（blood-brainbarrier，BBB）的阻擋，不同種類的朊病毒株、藥物本身造成的不良反應(yīng)使得以上藥物很大一部分僅停留在體外藥效試驗(yàn)階段，難以進(jìn)入臨床試驗(yàn)；而且大多數(shù)最新發(fā)現(xiàn)的化學(xué)物質(zhì)抑制PrPSc 的原理尚不明確，如黃芩素和樺褐孔菌乙醇粗提物的抗朊病毒作用僅通過(guò)推測(cè)認(rèn)為與細(xì)胞凋亡和抗氧化活性有關(guān)［2-3］，中藥提取物則由于其復(fù)雜的成分使得原理探究的過(guò)程更加困難，因而僅有少數(shù)藥物可以在動(dòng)物模型試驗(yàn)中繼續(xù)發(fā)揮作用，上述物質(zhì)中僅有白藜蘆醇在動(dòng)物模型中進(jìn)行了用藥試驗(yàn)并發(fā)現(xiàn)其作用于腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子上游通路［4］。有研究認(rèn)為，僅消除PrPSc聚集體不會(huì)消除PrPc的神經(jīng)毒性［8］，因此，通過(guò)篩選抗朊病毒化學(xué)物質(zhì)來(lái)獲得朊病毒病治療藥物具有不確定性。值得注意的是，最新發(fā)現(xiàn)的一系列關(guān)于PrPSc 的作用機(jī)制和信號(hào)通路，為朊病毒病藥物篩選提供了潛在靶點(diǎn)，并為化學(xué)藥物指明了新方向。

2 靶向胞內(nèi)信號(hào)通路藥物

2.1 靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)通路

目前針對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂的常見措施為上調(diào)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。UPR 功能包括在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)誘發(fā)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)累積或鈣離子濃度異常時(shí)，關(guān)閉翻譯系統(tǒng)以減少錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的堆積，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重受損時(shí)誘導(dǎo)促凋亡蛋白表達(dá)。UPR 主要的傳感器包括RNA 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白激酶（protein kinase RNA-like ER kinase，PERK），PERK 可以通過(guò)磷酸化真核轉(zhuǎn)錄啟始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）下調(diào)蛋白質(zhì)的翻譯。當(dāng)細(xì)胞受到PrPSc 感染時(shí)，胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)遭到破壞，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的破壞和UPR 的激活。有研究顯示，被PrPSc 感染的小鼠體內(nèi)細(xì)胞的PERK 持續(xù)激活，同時(shí)，eIF2α 表現(xiàn)出磷酸化作用，進(jìn)而使蛋白質(zhì)翻譯下調(diào)，最終的結(jié)果是蛋白質(zhì)合成量急劇減少導(dǎo)致突觸功能衰竭、神經(jīng)元死亡和其他神經(jīng)退行性病變［9］。

有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)朊病毒病小鼠使用小分子藥物GSK2606414 抑制PERK 可以恢復(fù)重要蛋白的合成，并阻止神經(jīng)退行性病變，但全面抑制UPR也會(huì)導(dǎo)致胰腺損傷［10］。因此，該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索使用綜合應(yīng)激反應(yīng)抑制劑（integrated stress response inhibitor，ISRIB）恢復(fù)重要蛋白合成，ISRIB通過(guò)阻止eIF2α介導(dǎo)的翻譯抑制，在保留了一些必要的UPR 的同時(shí)逆轉(zhuǎn)了蛋白質(zhì)合成的減少，使朊病毒病小鼠的整體蛋白質(zhì)合成率達(dá)到對(duì)照組的70%，并且未發(fā)現(xiàn)胰腺毒性反應(yīng)［10］。有研究者篩選出的鹽酸曲唑酮和二苯甲酰甲烷均能夠部分抑制eIF2 磷酸化和UPR 激活，并且均不存在胰腺毒性，同時(shí)，還表現(xiàn)出更好的藥代動(dòng)力學(xué)特性。經(jīng)過(guò)鹽酸曲唑酮和二苯甲酰甲烷治療的朊病毒病小鼠未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)臨床癥狀，同時(shí)生存期也顯著延長(zhǎng)［11］。在以UPR 為基礎(chǔ)的另一種治療思路中，研究人員證實(shí)了胍那芐衍生物sephin 1可以選擇性結(jié)合并抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基15A復(fù)合物，因此，該藥物可以通過(guò)延長(zhǎng)eIF2α 磷酸化時(shí)間，一定程度上抑制UPR 導(dǎo)致的促凋亡蛋白（如CHOP）的表達(dá)，以此起到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。該方法已經(jīng)在小鼠肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥模型中成功抑制了神經(jīng)退行性病變［12］，表明該方法具有應(yīng)用潛力。

2.2 靶向自噬反應(yīng)

自噬作用是普遍發(fā)生于真核細(xì)胞溶酶體內(nèi)的一種細(xì)胞行為，其可以降解胞內(nèi)各類折疊錯(cuò)誤或有毒性的蛋白，因此，在細(xì)胞的生命周期中扮演重要角色。目前，已有研究顯示，PrPSc 感染的細(xì)胞中，自噬小體數(shù)增多，自噬流活化，而在被阻斷自噬過(guò)程感染PrPSc 的細(xì)胞中，PrPSc 含量顯著上升［13］，這初步揭示了真核細(xì)胞的自噬作用與PrPSc 感染之間的關(guān)系，提示研究人員可以從調(diào)控細(xì)胞自噬入手尋找緩解或治療朊病毒病的藥物。

在細(xì)胞自噬調(diào)控信號(hào)通路中，雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是最有效、最直接的相關(guān)信號(hào)通路。mTOR 是一種高分子量絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以磷酸化自噬啟動(dòng)因子未配位的51 樣激酶1/人類自噬相關(guān)蛋白1、人類自噬相關(guān)蛋白13 等自噬相關(guān)因子，使其失活從而抑制細(xì)胞自噬，因而mTOR 的降解被認(rèn)為是感染PrPSc 的細(xì)胞中自噬活化的主要原因［13］。已有研究證實(shí)，雷帕霉素通過(guò)結(jié)合mTOR 而在一定程度上促進(jìn)自噬，提高細(xì)胞清除PrPSc 的能力，且感染PrPSc 的實(shí)驗(yàn)小鼠在接受雷帕霉素治療后發(fā)病時(shí)間延遲，癥狀嚴(yán)重程度減輕，生存期也延長(zhǎng)近10%［14］。但在臨床實(shí)踐中，雷帕霉素對(duì)mTOR的抑制效果仍具有局限性，主要是由于mTOR 被抑制后負(fù)反饋調(diào)節(jié)激活了位于其上游的蛋白激酶B（protein kinase B，AKT），進(jìn)而使mTOR 被活化。有研究者使用mTOR 和ATK 的雙重抑制劑發(fā)現(xiàn)，對(duì)mTOR 通路具有良好的抑制效果［15-16］；富脯氨酸AKT 底 物40（protein-rich AKT substrate of 40-kDa，PRAS40）既是AKT底物，而且還可以抑制mTOR，轉(zhuǎn)染HA-PRAS40 的細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞朊病毒蛋白殘基106-126 處理后，與轉(zhuǎn)染空白載體的對(duì)照組相比，凋亡標(biāo)識(shí)蛋白水平約下降50%［17］。以上研究不僅提示PRAS40 在抑制mTOR 過(guò)度活化以保護(hù)細(xì)胞免受PrPSc 侵襲引起的凋亡中起作用，而且還為抑制mTOR，促進(jìn)細(xì)胞自噬清除PrPSc提供了新的方案。有研究者還發(fā)現(xiàn)，阿司咪唑和伊馬替尼這2 種已經(jīng)上市的藥物也可以促進(jìn)溶酶體自噬，從而提高PrPSc 的清除效率［18-19］。此外，他克莫司和鋰也可以通過(guò)誘導(dǎo)PrPSc 感染細(xì)胞中的自噬反應(yīng)來(lái)提高PrPSc 的清除效率［18，20］。值得注意的是，鋰元素還可以特異性緩解毒性多肽對(duì)抑制元件沉默性轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用，并恢復(fù)由抑制元件沉默性轉(zhuǎn)錄因子干擾引起的下游靶蛋白表達(dá)紊亂［21］，這些機(jī)制可能會(huì)為感染PrPSc 的神經(jīng)細(xì)胞提供保護(hù)作用，但關(guān)于細(xì)胞自噬如何緩解包括朊病毒病在內(nèi)的一系列神經(jīng)退行性疾病的具體機(jī)制尚未完全明確［22］，因此，此類以溶酶體自噬反應(yīng)為基礎(chǔ)藥物的進(jìn)一步篩選、改良還需相關(guān)基礎(chǔ)研究的繼續(xù)推進(jìn)。

2.3 靶向線粒體損傷

線粒體作為真核生物細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，其與胞內(nèi)的許多生理、病理過(guò)程相關(guān)，如線粒體在氧化磷酸化、鈣離子穩(wěn)態(tài)、活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除與程序性細(xì)胞死亡中均起主導(dǎo)作用［23］。而PrPSc 的感染可以導(dǎo)致不同程度的線粒體功能異常［24］。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在PrPSc 影響下穩(wěn)態(tài)受到破壞后，胞質(zhì)中鈣離子濃度失調(diào)導(dǎo)致線粒體膜電位喪失，同時(shí)，呼吸功能受到抑制，這可能產(chǎn)生大量導(dǎo)致氧化應(yīng)激的ROS，氧化應(yīng)激又可進(jìn)一步使線粒體損傷，導(dǎo)致其形態(tài)異常、膜功能損傷和功能障礙［25］，如在朊病毒株ME7 感染的小鼠模型中，線粒體分裂和融合的相關(guān)蛋白表達(dá)模式均發(fā)生了變化［26］，最終激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑主要與B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B-celllymphoma/leukemia-2，Bcl-2）蛋白家族有關(guān)，其中Bcl相關(guān)X蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）可以直接插入線粒體膜，引起細(xì)胞色素C 釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與凋亡活化因子相結(jié)合，促進(jìn)半胱天冬酶的產(chǎn)生并啟動(dòng)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。當(dāng)大量神經(jīng)元細(xì)胞凋亡時(shí)，患者會(huì)表現(xiàn)出一系列臨床癥狀并最終死亡。此外，線粒體的功能障礙可能還是中樞神經(jīng)突觸細(xì)胞變性的潛在機(jī)制［27］。

以上機(jī)制為研究者提供了一種尋找朊病毒病治療藥物的思路，即可通過(guò)使用靶向線粒體損傷藥物降低ROS 水平，保護(hù)線粒體，或者阻止由線粒體介導(dǎo)的凋亡過(guò)程，從而保護(hù)患者神經(jīng)元。通過(guò)篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)MitoQ和積雪草酸2種線粒體靶向抗氧化劑，均在被PrPSc 感染的細(xì)胞系中發(fā)揮重要作用，從而降低了ROS 水平，緩解了線粒體的氧化應(yīng)激損傷，修復(fù)了線粒體功能，使PrPSc感染細(xì)胞的存活率上升了約1倍［23］。另外一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)，利用胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 預(yù)處理細(xì)胞后，再利用細(xì)胞朊病毒蛋白殘基106-126 則無(wú)法誘導(dǎo)Bax 易位和細(xì)胞色素C 的釋放。表明胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 可以通過(guò)阻斷Bax 易位來(lái)防止PrPSc 誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1可以通過(guò)抑制線粒體功能障礙來(lái)減弱ROS的產(chǎn)生［28］。

PrPSc 相關(guān)的線粒體信號(hào)通路可能作為藥物篩選的潛在靶點(diǎn)，其中磷酸酶及張力蛋白同源物誘導(dǎo)的激酶1（PTEN-induced kinase 1，PINK1）和Parkin 這兩種調(diào)節(jié)線粒體自噬活性的線粒體蛋白受到了臨床的廣泛關(guān)注。在線粒體自噬中，激活的PINK1通過(guò)磷酸化多泛素鏈修飾受損線粒體上的線粒體膜蛋白，進(jìn)而招募Parkin 并引發(fā)一系列下游反應(yīng)降解受損的線粒體。有研究在感染PrPSc的小鼠腦組織切片中觀察到PINK1和Parkin的異常上調(diào)，同時(shí)，抑制受PrPSc 感染的細(xì)胞系中PINK1 或Parkin 的表達(dá)可以緩解線粒體自噬［29］，表明PrPSc 感染細(xì)胞中，誘發(fā)神經(jīng)元壞死現(xiàn)象的線粒體自噬行為與PINK1/Parkin 通路相關(guān)。有學(xué)者研究了線粒體發(fā)動(dòng)蛋白樣蛋白1（dynamin-like protein 1，DLP1）介導(dǎo)的線粒體分裂過(guò)程。通常情況下，DLP1 存在于細(xì)胞質(zhì)中，被線粒體膜上受體樣分子招募以調(diào)節(jié)線粒體分裂復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，朊病毒病倉(cāng)鼠模型中，DLP1 調(diào)節(jié)的線粒體碎裂導(dǎo)致神經(jīng)元活性降低、凋亡及突觸可塑性改變，而抑制DLP1 表達(dá)可以抑制細(xì)胞朊病毒蛋白殘基106-126 處理后細(xì)胞線粒體碎裂的現(xiàn)象［30］。值得注意的是，在該項(xiàng)研究中，研究人員抑制DLP1 時(shí)使用了RNA 干擾技術(shù)，探明了潛在的DLP1 相關(guān)治療措施。以上研究結(jié)果表明，靶向線粒體損傷藥物在緩解PrPSc 感染方面具有巨大潛力，但進(jìn)一步的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)以及更多種類的靶向線粒體損傷藥物的篩選還有待更深入地開展研究，相關(guān)藥物短時(shí)間內(nèi)尚難以進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段。

3 基因治療

3.1 RNA干擾

已有研究顯示，敲除朊蛋白基因（prion protein gene，PRNP）或PRNP表達(dá)量降低的動(dòng)物可以有效抵抗朊病毒病，然而考慮到倫理、生物安全、臨床可行性等問(wèn)題，降低PRNP表達(dá)量是比敲除PRNP更佳的基因治療方法。

RNA 干擾是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，其通過(guò)雙鏈RNA 啟動(dòng)，可導(dǎo)致具有同源序列mRNA的降解，進(jìn)而快速、有效地減少目的基因表達(dá)，是一項(xiàng)很有潛力的基因治療技術(shù)。為研究其對(duì)PRNP基因表達(dá)的作用效果，研究人員設(shè)計(jì)了針對(duì)牛PRNP外顯子區(qū)域的干擾序列，將其轉(zhuǎn)染至胎牛成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示，篩選的陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)PRNP的抑制率可達(dá)78%［31］。有研究者設(shè)計(jì)了針對(duì)PrPSc 在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和聚集必需蛋白，即37 kD/67 kD層粘連蛋白受體前體（laminin receptor precursor，LRP）的特異性小分子干擾RNA（small interference RNA，siRNA）。目前已在體外試驗(yàn)證明LRP 為PrPSc 在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和聚集所必需的蛋白［1］，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對(duì)其施以下調(diào)、抑制等措施成功降低了PrPSc 水平。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，向小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)區(qū)注射LRPsiRNA 后15 d 內(nèi)，37 kD/67 kD 層粘連蛋白受體水平分別降低62%和82%，將LRPsiRNA 注射到海馬區(qū)后，小鼠腦內(nèi)LRP 和PrPSc 水平分別降低36%和41%，且朊病毒病潛伏期顯著延長(zhǎng)［32］。以上研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了RNA 干擾技術(shù)抑制朊病毒基因表達(dá)的可操作性，并展現(xiàn)出RNA 干擾技術(shù)治療朊病毒病靶點(diǎn)的多樣性。

3.2 反義寡核苷酸

除RNA 干擾外，反義寡核苷酸（antisenseoligonucleotide，ASO）因具有高度特異性的基因表達(dá)阻斷作用而被廣泛應(yīng)用于研究與治療遺傳相關(guān)疾病中。Raymond 等［33］設(shè)計(jì)了幾種與小 鼠PRNP mRNA 互補(bǔ)的ASO，從感染前15 天開始，每2～3個(gè)月向小鼠進(jìn)行注射，2 種不同的ASO 分別使小鼠感染PrPSc 后存活時(shí)間延長(zhǎng)了81%和98%，感染后4 個(gè)月單次注射使存活率上升了55%，并延遲了臨床癥狀發(fā)作時(shí)間。更換ASO 種類后，在感染PrPSc 2.5 個(gè)月后每3 個(gè)月施加1 次大劑量治療能夠使小鼠存活時(shí)間增加約3 倍，在接近臨床癥狀發(fā)作時(shí)，進(jìn)行干預(yù)使存活時(shí)間提高了19%。ASO 藥代動(dòng)力學(xué)和安全性研究表明，每1～4 個(gè)月1 次的治療對(duì)人和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物均是無(wú)害的。有研究者還發(fā)現(xiàn)，ASO 療效對(duì)于不同的朊病毒株存在差異，提示未來(lái)可能需要根據(jù)患者的疾病發(fā)展階段和所感染毒株調(diào)整治療方案［34］。以上研究證明ASO 與PrPc mRNA 靶向性結(jié)合，并通過(guò)腦室注射實(shí)現(xiàn)ASO 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的廣泛分布，提示通過(guò)以上途徑可解決朊病毒治療中的給藥難題。未來(lái)可拓展ASO 技術(shù)的靶點(diǎn)范圍，進(jìn)而發(fā)展為治療朊病毒病的潛在方法。

4 免疫治療

通過(guò)主動(dòng)免疫途徑、被動(dòng)免疫途徑防治各類疾病一直以來(lái)都在動(dòng)物醫(yī)學(xué)和人類公共衛(wèi)生健康事業(yè)中占據(jù)重要地位，因而研究者對(duì)于PrPSc 外源抗體與疫苗進(jìn)行了深入的研究。目前已有多種PrPc 單克隆抗體被成功制備，同時(shí)，一些單鏈抗體和駱駝PrPc 抗體還表現(xiàn)出了可穿過(guò)血腦屏障的良好擴(kuò)散性［35-36］。此外，在抗體的結(jié)合位點(diǎn)方面，有研究證明，針對(duì)非整聯(lián)蛋白37 kD/67 kD 層粘連蛋白受體、淋巴毒素β受體等與PrPSc作用相關(guān)蛋白的抗體同樣可以抑制朊病毒病的發(fā)展［1，37］。在主動(dòng)免疫途徑中，突破機(jī)體對(duì)PrPc 的免疫耐受是研發(fā)疫苗的關(guān)鍵步驟，而一系列實(shí)驗(yàn)通過(guò)施加免疫佐劑［38］、修飾抗原肽［39］、制備PrPc二聚體［40-41］可能引發(fā)機(jī)體針對(duì)PrPc的免疫反應(yīng)。

但通過(guò)主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫治療朊病毒病仍面臨一些問(wèn)題，如實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的抗體大多數(shù)難以穿過(guò)血腦屏障，從而使得免疫治療在出現(xiàn)臨床癥狀后無(wú)法發(fā)揮效果，而對(duì)于尚未出現(xiàn)癥狀的朊病毒疾病早期階段，提早發(fā)現(xiàn)極為困難，部分有望穿過(guò)血腦屏障的小分子抗體又面臨半衰期過(guò)短、效果不佳等問(wèn)題，這二者間的矛盾目前難以調(diào)和，即使未來(lái)通過(guò)腦室內(nèi)注射進(jìn)行治療也很難實(shí)現(xiàn)大分子抗體在腦內(nèi)的廣泛分布。此外，單克隆抗體在進(jìn)入大腦后還可通過(guò)引起PrPc 的交聯(lián)作用誘發(fā)細(xì)胞凋亡，相關(guān)實(shí)驗(yàn)中注射IgGD13 和IgGP 的小鼠中分別有80%和70%的個(gè)體表現(xiàn)出海馬區(qū)域神經(jīng)元死亡［42］，因此，利用抗體抑制或預(yù)防PrPSc感染時(shí)必須十分謹(jǐn)慎，這也可能是近期被動(dòng)免疫方法治療朊病毒病進(jìn)展較緩慢的原因；并且朊病毒病免疫療法面臨抗體特異性的問(wèn)題，尤其是對(duì)于朊病毒病疫苗，其優(yōu)勢(shì)為機(jī)體產(chǎn)生的抗體能在暴露后及早清除潛在病原體以預(yù)防當(dāng)前不可治愈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，因而抗體需要高效地識(shí)別并結(jié)合PrPSc，否則攝入食物中攜帶的PrPc 將消耗大量抗體，降低體液中抗體濃度，削弱疫苗對(duì)PrPSc 的防御作用。有研究者已逐步發(fā)現(xiàn)PrPc 二聚體［40］、PrPc 淀粉樣蛋白［43］、非致病性的抗蛋白酶K 重組PrPc 低聚體［44］等與PrPSc 有更多相似表位的免疫原，利用免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性更強(qiáng)的抗體，有望在未來(lái)推動(dòng)朊病毒病疫苗的研發(fā)。

5 異源朊蛋白

PrPSc 的形成嚴(yán)重依賴自身與宿主細(xì)胞PrPc之間序列的同源性，異源朊蛋白（heterologous prion proteins，HetPrP）的存在通常被認(rèn)為可以抑制該過(guò)程。HetPrP 對(duì)PrPSc 形成的干擾效果早已在胞外實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)，但直到近幾年，研究人員才在體內(nèi)觀察到重組倉(cāng)鼠朊蛋白對(duì)羊瘙癢病小鼠適應(yīng)株的抑制效果，實(shí)驗(yàn)中施用高劑量HetPrP 延緩和減輕了小鼠臨床癥狀的發(fā)作時(shí)間，并延長(zhǎng)了生存時(shí)間。此外，當(dāng)在感染后452 天終止研究時(shí)，高劑量治療組中50%的小鼠未表現(xiàn)出臨床癥狀，分析原因?yàn)镠etPrP 與PrPSc 結(jié)合形成了無(wú)活性復(fù)合物，或是直接抑制了PrPSc 體內(nèi)轉(zhuǎn)化過(guò)程［45］。但HetPrP 的遞送方案還需進(jìn)一步研究，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)腦室內(nèi)注射將藥物直接送達(dá)病變區(qū)域，但與ASO 不同，HetPrP 在大腦中可能難以充分接觸PrPSc。此外，更有效的HetPrP 序列也有待進(jìn)一步開發(fā)。

6 展望

朊病毒病作為一種致命的神經(jīng)退行性疾病，死亡率極高，近40年來(lái)，為攻克這一難題，朊病毒病的檢測(cè)方法、動(dòng)物模型也均在逐步發(fā)展。目前檢測(cè)朊病毒病的金標(biāo)準(zhǔn)仍是對(duì)患者或患病動(dòng)物的腦組織進(jìn)行活檢［46］，但對(duì)朊病毒病特征性標(biāo)志物PrPSc 的檢測(cè)方法也在不斷進(jìn)步，特別是近年來(lái)實(shí)時(shí)震動(dòng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和連續(xù)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增法的應(yīng)用大大提升了對(duì)微量PrPSc 的檢測(cè)精度，使得從包括血液和皮膚在內(nèi)的各類組織與體液中發(fā)現(xiàn)PrPSc 感染的早期證據(jù)成為可能［47］。此外，通過(guò)免疫學(xué)方法對(duì)朊病毒病替代生物標(biāo)志物的檢測(cè)、腦電圖以及生物學(xué)成像也被用于朊病毒病的臨床診斷中［48］。朊病毒病的動(dòng)物模型長(zhǎng)期以來(lái)以嚙齒類動(dòng)物為主，如小鼠、倉(cāng)鼠、田鼠均有應(yīng)用［49］。在最新的研究中發(fā)現(xiàn)果蠅有望通過(guò)基因改造技術(shù)表現(xiàn)哺乳動(dòng)物朊病毒病的某些病理學(xué)特征［50］，若新型的無(wú)脊椎動(dòng)物模型能夠成功建立，將大大提高實(shí)驗(yàn)可操作性，降低實(shí)驗(yàn)成本，促進(jìn)對(duì)PrPSc和朊病毒病的研究。

但在尋找朊病毒病治療方法的過(guò)程中，傳統(tǒng)化學(xué)藥物的篩選大多仍停留在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上。究其原因?yàn)椋瑢?duì)于PrPSc 及其致病機(jī)理了解不夠充分，因而部分學(xué)者致力于PrPSc 作用機(jī)制和神經(jīng)退行性病變調(diào)控因素的研究。目前一些影響朊病毒病致病過(guò)程的調(diào)控因子和信號(hào)通路引起了人們廣泛的關(guān)注，如核轉(zhuǎn)錄因子-κB［51］、鈣調(diào)蛋白［52］、抑制元件沉默性轉(zhuǎn)錄因子［21］、典型Wnt/β-catenin 信號(hào)通路等［53］，為尋找朊病毒病的治療方法帶來(lái)了新的思路和希望；另外，不同朊病毒病治療方案的聯(lián)用效果也有待進(jìn)一步研究，沉積的PrPSc 對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響是多方面的，也是階段性的，作用機(jī)制不同的藥物可以產(chǎn)生良好的互補(bǔ)效應(yīng)，提升治療效果，目前他克莫司和米諾環(huán)素的聯(lián)合使用已被證實(shí)能夠在病程的不同階段通過(guò)多種通路減輕神經(jīng)元和突觸失調(diào)，提高小鼠的存活率［54］，而且在未來(lái)的研究中，一旦研發(fā)出能投入實(shí)際應(yīng)用的基因治療、免疫治療等方法，針對(duì)何種靶點(diǎn)的藥物更適合聯(lián)合使用也需要進(jìn)一步探索。未來(lái)隨著對(duì)PrPSc 致病分子機(jī)制不斷了解及已有藥物的深入發(fā)掘，必將開發(fā)出能夠投入臨床使用的朊病毒病治療方法。