藻菌共生體對養(yǎng)豬廢水中抗生素和常規(guī)污染物的去除效果研究

徐長江，趙永軍，劉 娟*，劉 麗

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

抗生素被廣泛用于預(yù)防和治療人類感染傳染病和獸醫(yī)治療，是一種具有抗細菌和抗真菌作用的活性物質(zhì)，尤其在畜牧業(yè)能夠促進牲畜生長和預(yù)防傳染性疾病[1]。然而，抗生素在人體和動物體內(nèi)的吸收率往往不足50%[2]。大部分抗生素直接經(jīng)人或動物的消化系統(tǒng)，以原形或代謝產(chǎn)物形式隨尿液和糞便排到環(huán)境中。國內(nèi)外的調(diào)查研究表明，在地表水、土壤及沉積物等環(huán)境介質(zhì)中廣泛地檢測到各類抗生素的存在。據(jù)報道，養(yǎng)豬廢水中抗生素含量較高，土霉素濃度為0.73～354.0 mg/kg，金霉素濃度為0.68～139.4 mg/kg，磺胺嘧啶濃度為0.68～98.8 mg/kg[3]。如果養(yǎng)豬廢水未經(jīng)任何處理直接排入環(huán)境中，廢水中殘留的抗生素將會對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生巨大的潛在危害，環(huán)境中的抗生素會沿食物鏈進入人體，使人體產(chǎn)生耐藥性，危害人體生命健康[3]；會改變土壤中細菌的抗藥性[4]；對水生動植物產(chǎn)生毒效應(yīng)[5]等。由于抗生素具有較高的水溶性和較低的生物可降解性，故很難將其從環(huán)境中去除。因此，加強抗生素去除相關(guān)的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究，開發(fā)去除抗生素的高效、綠色技術(shù)已迫在眉睫。

微藻是一類單細胞光合生物的總稱，包括藍藻及真核藻類，具有生長速率快、對環(huán)境無污染等特點。利用微藻進行廢水處理，既能高效去除抗生素、氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)，又能降低能耗。目前，關(guān)于微藻去除廢水中抗生素的有效性已被證實，相對于傳統(tǒng)的化學(xué)、物理去除方法，該生物技術(shù)具有處理效率高、成本低、不需要任何吸附劑或者催化劑，且可以有效同步去除水體中的營養(yǎng)物TP、TN 等優(yōu)點[6]。當(dāng)微藻接觸抗生素時，藻細胞為了生存會通過一系列反應(yīng)清除有毒抗生素。在此期間，藻細胞可通過吸附、積累、生物降解等途徑去除廢水中的抗生素[7]。周楠等[8]研究發(fā)現(xiàn)，微藻對頭孢拉定的去除率達到70%。Gojkovic 等[9]用一種耐熱性小球藻（Chlorella sorokiniana）對氧氟沙星12 d 的去除率達到65%，普通小球藻（Chlorella vulgaris）對土霉素12 d 的去除率為69%。最近研究發(fā)現(xiàn)，菌類微生物能夠強化微藻對廢水中抗生素和常規(guī)污染物的去除效果。Liu 等[10]構(gòu)建的微藻-細菌顆粒淤泥系統(tǒng)對四環(huán)素和磺胺嘧啶的去除率分別高達79.0%和94.0%。Bodin 等[11]證實了真菌也可以強化微藻對抗生素的去除效果，小球藻-黑曲霉菌共生體對廢水中雷尼替丁具有顯著的去除效果，去除率為(50±19)%，而真菌對雷尼替丁的去除率僅為(20±13)%。本研究通過構(gòu)建小球藻-靈芝菌共生體，研究其對模擬養(yǎng)豬廢水中鹽酸土霉素（OTC）、鹽酸環(huán)丙沙星（CPFX）、磺胺二甲嘧啶（SM2）三類抗生素和營養(yǎng)物質(zhì)TP、TN 的去除效果。同時，分析藻菌共生體的生長性能和光合性能，為藻技術(shù)在廢水處理領(lǐng)域的有效應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HZ-9310KBG 恒溫搖床培養(yǎng)箱，湖南邁達儀器有限公司；SW-CJ-2D 型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-75Sll 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-6000PC 紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司；AP-C100 掌上水體葉綠素?zé)晒鈨x，北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司；1260 型高效液相色譜儀，美國Agilent 公司。

實驗所用的小球藻藻種購于中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫，編號為FACHB-8。靈芝菌菌種購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為5.765。BG11 培養(yǎng)基、PDW 培養(yǎng)基均購于海博生物技術(shù)有限公司。葡萄糖、尿素、NaHPO4·2H2O、KH2PO4、CaCl2、MgSO4均 為 分 析純，購于國藥集團。鹽酸土霉素（OTC）（CAS 號：2058-46-0）、鹽酸環(huán)丙沙星（CPFX）（CAS 號：93107-08-5）、磺胺二甲嘧啶（SM2)（CAS 號：57-68-1）、濃硫酸、丙酮、Ag2SO4等均為分析純。

1.2 藻菌共生體的構(gòu)建

小球藻在BG11 培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)至藻密度為107 個/mL，培養(yǎng)條件：25 ℃，光照強度為200 μmol·m-2·s-1，保持12 h 光照/12 h 黑暗的光周期。靈芝菌在PDW 培養(yǎng)基中搖成約0.5～1 cm 直徑的真菌球，培養(yǎng)條件：溫度為(28±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min，黑暗條件。

藻菌共生體干重接種比為藻：菌＝10：1，在超凈工作臺取小球藻泥和靈芝菌菌球加入模擬養(yǎng)豬廢水（由葡萄糖、尿素、NaHPO4·2H2O、KH2PO4、CaCl2、MgSO4配置而成，COD：1424 mg/L，TN：348 mg/L，TP：42 mg/L）中，置于恒溫搖床培養(yǎng)箱中25 ℃黑暗處理12 h，轉(zhuǎn)速為160 r/min，使小球藻完全吸附到靈芝菌菌球上。

1.3 養(yǎng)豬廢水凈化

分別以藻菌共生體、小球藻、靈芝菌處理模擬養(yǎng)豬廢水，實驗組及空白組均設(shè)置三組平行。實驗步驟：在超凈工作臺操作，向配置好的200 mL模擬養(yǎng)豬廢水中加入鹽酸土霉素，緊接著投入50個藻菌共生體。同時，向200 mL 模擬養(yǎng)豬廢水中分別加入與藻菌共生體同等干重的小球藻和靈芝菌菌球。將藻菌共生體凈化體系、小球藻單一培養(yǎng)凈化體系和靈芝菌菌球單一培養(yǎng)凈化體系分別置于恒溫搖床培養(yǎng)箱中，在25 ℃下進行實驗，保持12 h 光照/12 h 黑暗的光周期，轉(zhuǎn)速為160 r/min。空白組不加入任何生物材料，僅為含鹽酸土霉素的模擬養(yǎng)豬廢水。鹽酸環(huán)丙沙星與磺胺二甲基嘧啶凈化操作同上。其中，3 種抗生素的初始濃度均為60 mg/L，COD 含量為第1 天、第3天、第5 天取樣檢測，其余指標(biāo)均為每天檢測。

1.4 分析方法

1.4.1 葉綠素a（CHL-a）濃度測定

取4 mL 藻液或者一個藻菌共生體，離心（8000 r/min）處理10 min，棄去上清液，向沉淀中加入90%體積分數(shù)的丙酮，使用旋渦混合器混勻，使沉淀完全溶于丙酮，放置于4 ℃下黑暗環(huán)境處理24 h。24 h 后將樣品離心（8000 r/min）處理10 min，取上清液用紫外可見光分光光度計分別測量630 nm、645 nm、663 nm 和750 nm 處波長的吸光度，用90%丙酮做空白對照。葉綠素a（Chl-a）濃度計算見式（1）。

式（1）中：ρ(Chl-a)為葉綠素a 濃度，mg·L-1；A663、A750、A645、A630 分別為對應(yīng)波長下測得的樣品吸光度數(shù)值。

1.4.2 碳酸酐酶活性測定

采用Wilbur-Anderson 電量法測定。取4 mL小球藻液離心10 min，轉(zhuǎn)速為4000 r/min，將離心收集的沉淀用去離子水洗滌3 次，然后懸浮在4 mL預(yù)冷的1 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）和1 mmol/L EDTA 的0.010 mol/L Tris 緩沖液（pH 為8.3）中洗滌2 次。再次離心10 min，轉(zhuǎn)速為4000 r/min，將離心收集的沉淀懸浮在4 mL 預(yù)冷的上述Tris 緩沖液（pH 為8.3）中，再迅速加入4 mL 冰浴CO2飽和蒸餾水后，記錄pH 從8.3 下降到7.3 所需的時間。為保持實驗過程的溫度控制在4 ℃，整個過程在冰浴中進行。碳酸酐酶活性的計算公式見式（2）。

式（2）中：UA 為每個細胞的活性單位（units of activity），表示酶活性；T（black）為反應(yīng)體系中未加藻細胞的空白對照pH 下降所需的時間；T（test）為反應(yīng)體系中加藻細胞時pH 下降所需的時間。

1.4.3 小球藻光合性能測定

使用AquaPen 手持式葉綠素?zé)晒鉁y量儀進行測量。測量前取4 mL 小球藻進行暗適應(yīng)10 min，然后將其倒入測量儀配備的比色皿中，再放入葉綠素?zé)晒鉁y量儀，測量快速葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)（OJIP）參數(shù)。

1.4.4 總氮、總磷和化學(xué)需氧量測定

按照HJ 636—2012 的方法，用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定模擬養(yǎng)豬廢水中的總氮（TN）；按照GB 11893—89 的方法，用鉬酸銨分光光度法測定模擬養(yǎng)豬廢水中的總磷（TP）；按照GB 11914—89 的方法，用重鉻酸鉀法測定模擬養(yǎng)豬廢水中的化學(xué)需氧量（COD）。

1.4.5 抗生素含量測定

取4 mL 樣品離心（8000 r/min）處理10 min，將上清液過0.45 μm PES 濾膜，濾液用于抗生素含量測試。

其中，鹽酸土霉素采用高效液相色譜法測定，液相條件為：色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；洗脫流動相：乙腈與0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉的體積比為20%:80%；流速為1 mL·min-1；柱溫為35 ℃；檢測波長為355 nm；進樣量為20 μL。

鹽酸環(huán)丙沙星與磺胺二甲嘧啶采用分光光度法測定，分別于波長277 nm 與260 nm 處以純水做參比測定吸光度。其中，鹽酸土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0336x+1.4813，R2=0.9999；鹽酸環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=13.979x+0.5682，R2=1；磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=16.811x+0.4622，R2=1。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻菌共生體對抗生素的去除效果

3 種抗生素的初始濃度均為60 mg/L，小球藻、靈芝菌和藻菌共生體對3 種抗生素的去除效果見圖1。由圖1（a）可知，藻菌共生體對OTC 的去除效果較好，第5 天去除率高達(89.93±1.70)%；其次是小球藻，去除率為(60.41±2.21)%；靈芝菌去除率為(50.06±2.75)%。由圖1（b）和（c）可知，小球藻、靈芝菌和藻菌共生體對SM2 和CPFX 無明顯的去除效果。

圖1 抗生素去除效果Fig.1 Removal effect of antibiotic

由圖1（a）可知，在第1 天到第2 天、第3 天到第5 天，藻菌共生體對OTC 去除率的斜率與小球藻和靈芝菌單獨對OTC 去除率的斜率基本一致，可知藻菌共生體剛開始在OTC 的脅迫下不能進行良好的相互作用和物質(zhì)交換，因此初始階段去除率不高。結(jié)合CHL-a、CA 活性和OJIP 光合性能參數(shù)可知，在第3 天藻菌共生體對OTC 的去除率突然增長可能是發(fā)生了生物降解。隨著OTC濃度的降低，去除率也隨之降低，推測有兩種可能：一是OTC 的脅迫作用降低后，對藻菌共生系統(tǒng)的危害性降低，故后者也并不急需將OTC 進行生物降解；二是OTC 的濃度降低后，抗生素與藻菌共生系統(tǒng)的比例也隨之改變，而這個比例影響抗生素降解。除了生物降解還有另一種可能機制，Zhang 等[12]發(fā)現(xiàn)諾氟沙星的降解率與小球藻和Fe（Ⅲ）有關(guān)，分別測定了諾氟沙星在小球藻、Fe（Ⅲ）和小球藻加Fe（Ⅲ）中的光解情況，實驗結(jié)果與本實驗藻菌共生系統(tǒng)對OTC 的降解情況基本一致，諾氟沙星在含有藻類的溶液中通過藻類產(chǎn)生的羥基自由基氧化而快速降解，這一過程在Fe（Ⅲ）的協(xié)同下會加快，OTC 的單獨降解機理基本為光解，普通小球藻和靈芝菌可能產(chǎn)生促光解的基團或者自由基，而藻菌共生系統(tǒng)有可能產(chǎn)生促進光解過程的更強基團或自由基。

2.2 藻菌共生體對常規(guī)污染物的去除效果

圖2 為含OTC 的模擬養(yǎng)豬廢水中COD、TN和TP 的去除率，在第5 天藻菌共生體對TP、TN、COD 的去除效率分別是(76.42±1.51)%、(74.41±1.68)%、(46.05±9.30)%。通常來說，微藻單獨去除營養(yǎng)物的能力不如藻菌共生體，形成共生體后，真菌通過消耗有機物產(chǎn)生CO2供微藻用于光合作用。同時，微藻又釋放氧氣促進真菌生長，并且某些真菌胞外酶可以將大分子污染物轉(zhuǎn)化為小分子化合物，能夠提高微藻對營養(yǎng)物的去除率[13]。如圖2 所示，第1 天的TP、TN 去除率，藻菌共生體要高于單獨的微藻與靈芝菌，隨后去除率幾乎相同，推測是在高濃度的抗生素脅迫下，藻菌共生體吸收營養(yǎng)物的效率遭到了抑制。最終藻菌共生體對于污染物的去除無明顯優(yōu)勢，可以看到，靈芝菌和藻菌共生體對TP 的去除前期與小球藻相比有優(yōu)勢，但第4 天開始出現(xiàn)反彈。三者對TN的去除率不相上下，對COD 的去除靈芝菌較有優(yōu)勢。

圖2 藻菌共生體對模擬養(yǎng)豬廢水中TP、TN、COD的去除效率Fig.2 Removal efficiency of TP,TN and COD from simulated pig wastewater by microlgal-fungal symbiosis

2.3 藻菌共生體生長性能分析

2.3.1 Chl-a 含量

葉綠素a（Chl-a）是微藻內(nèi)的一種色素，用于吸收光進行光合作用，其含量可以作為判斷微藻生長情況的重要指標(biāo)[14]。圖3 分別是藻菌共生體和小球藻中小球藻在不同抗生素作用下的Chl-a含量變化。對小球藻而言，最初兩天3 種抗生素均能促進小球藻生長，這符合抗生素作用與藻類的普遍規(guī)律，由于藻類伴生雜菌的存在，一定濃度范圍內(nèi)的抗生素在第1 天均會不同程度地促進微藻的生長。姜思等[15]選用4 種抗生素作用于萊茵衣藻上，發(fā)現(xiàn)不同濃度的四環(huán)素在前兩天對微藻均有不同程度的促進作用，并呈現(xiàn)抗生素劑量依賴效應(yīng)。CPFX 與OTC 組分別在第3 天和第4 天對小球藻產(chǎn)生了明顯的抑制作用，聶湘平等[16]研究出鹽酸環(huán)丙沙星對蛋白核小球藻的毒性屬于中等。崔探[17]指出鹽酸環(huán)丙沙星對三角褐指藻的細胞形態(tài)、抗氧化性、膜透性及光合作用均產(chǎn)生毒性影響。對于OTC 影響的小球藻，在第4天Chl-a 猛然增長，隨后在第5 天達到峰值后又幾乎同趨勢減少，說明從第5 天開始藻的光合作用抑制率達到最大，藻細胞無法獲得充足的能量，生長受到抑制，甚至導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)破裂，從組織內(nèi)流出[18]。而SM2 幾乎對小球藻沒有明顯影響。由此可知，3 種抗生素中，CPFX 對普通小球藻毒性最大。對藻菌共生體而言，CPFX 與OTC 一開始就對藻菌共生體上的微藻有微弱的抑制作用；SM2 則對藻菌共生體有明顯的促進作用，這可能是磺胺類抗生素對雜菌的特異性抑菌機理造成的。徐明等[19]利用平菇菌和普通小球藻構(gòu)建藻菌共生體，小球藻的生物量顯著增加。

圖3 不同抗生素對藻菌共生體和小球藻Chl-a含量的影響Fig.3 Changes of Chl-a content in microalgalfungal symbiosis and Chlorella vulgaris with different antibiotics

2.3.2 碳酸酐酶活性

碳酸酐酶（carbonic anhydrase,CA）是一種含鋅金屬酶，是微藻中固定CO2的關(guān)鍵酶，其作用是催化CO2轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽[20]。由圖4 可知，OTC和CPFX 對普通小球藻CA 活性有抑制作用，其中CPFX 尤為明顯，從第4 天開始CA 活性明顯下降，SM2 則對CA 活性無明顯影響。正如Chen等[21]發(fā)現(xiàn)喹諾酮類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類對藍藻胞外碳酸酐酶均有不同程度的抑制作用一樣，這可能與喹諾酮類和四環(huán)素類對藻類的抑制作用有關(guān)。在藻菌共生體上也是如此，由圖4 可知，OTC 和CPFX 對藻菌共生體的CA活性也有抑制作用。第4 天OTC 組CA 活性突然增加，結(jié)合OTC 第4 天的降解率突然增加，CA 的活性與OTC 的降解效率高度相關(guān)，有可能是胞外碳酸酐酶的活性提高促進了CO2的固定，加速了光能向化學(xué)能的轉(zhuǎn)換，促進了OTC 進入藻細胞進行生物降解。SM2 小球藻的CA 活性有促進作用，這與CHL-a 的結(jié)果高度一致，推測是磺胺類抗生素對雜菌的特異性抑制作用。實驗結(jié)果與小球藻的CHL-a 含量結(jié)果基本一致。

圖4 不同抗生素對藻菌共生體和小球藻CA 活性的影響Fig.4 Effects of different antibiotics on CA activity of microalgal-fungal symbiosis and Chlorella vulgaris

2.4 藻菌共生體光合性能分析

不同抗生素廢水中藻菌共生體和小球藻第4天的葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)見表1。對暴露在抗生素下的小球藻，3 種抗生素的FV/FM和PIABS均處在正常區(qū)間，其中OTC 中小球藻的最大光學(xué)效率最高，性能指數(shù)最明顯，光合性能最好。對于藻菌共生體，OTC 和SM2 的Fv/FM和PIABS遠高于CPFX，ΨO、ΦEO和ΦDO的變化透露出微藻對光能的吸收和電子傳遞效率下降，最大電子傳遞產(chǎn)量降低，幾乎無法進行PSⅡ。結(jié)果均表明CPFX 對小球藻的脅迫作用最大，這與CHL-a 和CA 活性結(jié)果基本一致。

表1 不同抗生素第4 天藻菌共生體和小球藻葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)

圖5 為OTC 組藻菌共生體上小球藻OJIP 各個參數(shù)的變化情況，前兩天的數(shù)據(jù)表示，微藻在OTC 的脅迫下，光能的吸收性能指數(shù)（PIABS）降低，捕獲的機子能導(dǎo)致電子傳遞的效率（ΨO）降低，電子傳遞的量子產(chǎn)額（ΦEO）降低，進而導(dǎo)致微藻的最大光學(xué)效率（Fv/FM）在逐漸降低，預(yù)示著有活性的反應(yīng)中心數(shù)目下降，所以微藻便迫使剩余的有活性反應(yīng)中心的效率提高，從而導(dǎo)致吸收的光能增加（ABS/RC），熱耗散（ΦDO）增加。然后便開始轉(zhuǎn)變，首先是第2 天光系統(tǒng)捕獲機子導(dǎo)致電子傳遞的效率（ΨO）開始增加，緊接著其他參數(shù)均在第3天出現(xiàn)拐點，結(jié)合此時OTC 的降解率猛然增加，脅迫微藻的抗生素濃度在一天時間內(nèi)減少了至少40%，微藻的最大光學(xué)效率和性能指數(shù)開始上升，且后者上升更加明顯，這表明PIABS能夠更加靈敏地反映光學(xué)反應(yīng)的變化[23]，隨后各個參數(shù)的反彈，均表明在OTC 濃度降低后微藻的光合作用得到緩解，這也進一步證明OTC 被逐漸降解成對微藻沒有脅迫作用的產(chǎn)物，揭示了OTC 的降解途徑為生物降解而非生物吸附和生物積累。

圖5 OTC 作用下藻菌共生體的OJIP 各個參數(shù)變化情況Fig.5 Changes of OJIP parameters of microalgal-fungal symbiosis under the action of OTC

3 結(jié)論

小球藻-靈芝菌共生體對OTC 有明顯的去除能力，第5 天的去除效率高達(89.93±1.70)%，同樣條件下小球藻和靈芝菌對OTC 的去除效率分別為(60.41±2.21)%和(50.06±2.75)%，藻菌共生體對OTC的降解有明顯的優(yōu)勢，但是三者對SM2 和CPFX均無去除效果。藻菌共生體對TP、TN、COD 的最終去除效率分別為(76.42±1.51)%、(74.41±1.68)%、(46.05±9.30)%。無論在哪種抗生素體系中，小球藻、靈芝菌和藻菌共生體對TP、TN、COD 的去除效果均大同小異。第4 天的小球藻Chl-a、CA 和藻菌共生體葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)均表明：CPFX 無論是對小球藻還是藻菌共生體均有明顯的脅迫作用，說明高濃度CPFX 對小球藻毒性較大。雖然SM2 能促進藻菌共生體的生長，但和小球藻之間無明顯相互影響。本文構(gòu)建的小球藻-靈芝菌共生體，對鹽酸土霉素具有很強的去除效率，對生物方法處理廢水中抗生素具有一定的理論指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值。在后期研究中，應(yīng)關(guān)注如何將藻菌共生體系應(yīng)用于環(huán)境污染抗生素處理并實際應(yīng)用，同時進一步完善藻菌共生體處理抗生素的機理研究。