中藥對自噬調(diào)控的研究進(jìn)展及對皮膚色素沉著的治療啟示

謝波，宋秀祖

（杭州市第三人民醫(yī)院，浙江 杭州 310009）

自噬是程序化的細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制，通過溶酶體降解自身胞質(zhì)成分的過程，借此實(shí)現(xiàn)代謝及細(xì)胞器的更新。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，許多中藥被發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)細(xì)胞自噬。而自噬對黑素小體降解十分重要，促進(jìn)細(xì)胞自噬可能會(huì)成為色素增加性疾病治療的新方向[1]。

1 細(xì)胞自噬

自噬是真核生物中溶酶體介導(dǎo)的高度保守的降解過程。生理情況下，細(xì)胞通過自噬清除衰老和突變蛋白，與細(xì)胞存活、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。病理情況下，自噬可被多種刺激誘導(dǎo)，

如營養(yǎng)缺乏、激素和氧化應(yīng)激等。根據(jù)物質(zhì)運(yùn)輸途徑不同，將自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，以及選擇性自噬如線粒體自噬等。若自噬被過度激活，細(xì)胞則會(huì)大量死亡[1]。

自噬的分子機(jī)制及標(biāo)記物的檢測十分重要，自噬相關(guān)基因（Atg）及其蛋白產(chǎn)物在其中扮演重要角色。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是自噬過程中的關(guān)鍵分子，對自噬有反向調(diào)控作用。激活mTOR的通路如蛋白激酶（Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑可抑制自噬發(fā)生，而抑制mTOR的通路如AMPK和p53途徑則可促進(jìn)自噬發(fā)生。自噬小體的形成依賴于Atg1 Unc-51類自噬激活激酶（ULK1）蛋白激酶復(fù)合體，其接受上游自噬信號如mTOR的負(fù)向調(diào)控和AMPK的正向調(diào)控。PI3 Kinase Class Ⅲ復(fù)合體，包括Beclin-1和Atg14蛋白等，與自噬小泡的成核密切相關(guān)。Atg12-Atg5通過泛素樣反應(yīng)與自噬相關(guān)蛋白輕鏈（LC）3-Ⅱ形成復(fù)合物控制自噬小體的形成。p62蛋白，亦稱選擇性自噬接頭蛋白-1，其N端序列與LC3連接，LC3經(jīng)泛素修飾后定位于自噬泡膜表面。在自噬溶酶體系統(tǒng)降解蛋白的過程中，p62與LC3相互作用后定位于自噬體。p62可促進(jìn)泛素化底物向自噬體轉(zhuǎn)移，被廣泛用作自噬降解的標(biāo)志物。若自噬水平降低則會(huì)表現(xiàn)為p62大量聚集。LC3-Ⅰ是一種胞質(zhì)蛋白，而膜結(jié)合的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)于自噬小體、早期的自噬包涵體和自噬溶酶體，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化是自噬通量增加的重要標(biāo)志，與自噬體數(shù)量呈正相關(guān)。檢測LC3-Ⅱ和p62蛋白的水平被廣泛應(yīng)用于自噬通量的評估[1-2]。

2 中藥單體對細(xì)胞自噬的調(diào)控

中藥有效成分在干預(yù)自噬的過程中發(fā)揮重要作用，以下就常見有自噬調(diào)控作用的中藥單體研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

2.1 熊果酸 屬于五環(huán)三萜類化合物，源于熊果、枇杷葉、白花蛇舌草和迷迭香等植物，有較高生物活性，如抗腫瘤和抗炎作用等。由于其在細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)中的作用而引發(fā)關(guān)注。在乳腺癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，熊果酸可通過抑制PI3K-Ⅰ/Akt/mTOR信號通路來增強(qiáng)自噬活性[3]。熊果酸處理鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞后誘導(dǎo)了p62的積累，增加了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。除腫瘤細(xì)胞外，熊果酸尚對成纖維細(xì)胞的自噬有調(diào)節(jié)作用。熊果酸處理后成纖維細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)上調(diào)，自噬活性增強(qiáng)。而利用siBeclin-1抑制Beclin-1蛋白的表達(dá)則可顯著減弱熊果酸誘導(dǎo)的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，從而抑制成纖維細(xì)胞的活力和膠原合成[4]。

2.2 木犀草素 是一種存在于木犀草、金銀花、菊花和紫蘇等植物中的黃酮類化合物，有抗腫瘤、抗氧化和止咳化痰等作用。木犀草素可通過增強(qiáng)自噬抑制腫瘤細(xì)胞生長及改善神經(jīng)損傷等[5-6]。木犀草素通過增加自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和Atg的表達(dá)以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬[5]。在改善神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面，木犀草素可通過激活p62/keap1/Nrf2通路增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞自噬改善大鼠外傷誘導(dǎo)的腦出血模型。這一作用可被自噬抑制劑氯喹所逆轉(zhuǎn)[6]。

2.3 白藜蘆醇 是一種天然多酚類物質(zhì)，有抗炎、抗腫瘤和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等作用。來源于虎杖、桑椹、葡萄和花生等植物。白藜蘆醇處理白血病人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞（MOLT-4）24 h后，LC3-Ⅱ和p62蛋白升高，通過促進(jìn)細(xì)胞自噬而抑制其生長[7]。在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中，白藜蘆醇起到和雷帕霉素類似的作用，即通過抑制mTOR通路來激活自噬通過該機(jī)制可抑制細(xì)胞復(fù)制性衰老，并逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[8]。

2.4 人參皂苷 屬于固醇類化合物，來源于中藥人參，有廣泛的藥理學(xué)活性，如抗炎、抗氧化和抑制腫瘤細(xì)胞生長等。既往研究已經(jīng)注意到自噬對細(xì)胞衰老的重要性。人參皂苷Rh2處理后的衰老乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞與非處理組相比，自噬水平提高了五倍，這與對核因子-κB（NF-κB）的抑制和白細(xì)胞介素-8（IL-8）分泌減少有關(guān)[9]。人參皂苷Rg1能顯著減輕糖尿病大鼠腎足細(xì)胞病變導(dǎo)致的腎纖維化，通過調(diào)節(jié)AKT/GSK3β/β-catenin信號通路恢復(fù)細(xì)胞自噬活性[10]。人參皂苷Rg5可明顯上調(diào)LC3B-Ⅱ、Beclin-1、Atg-5和Atg-12的表達(dá)，抑制p62表達(dá)，通過增強(qiáng)自噬抑制胃癌細(xì)胞生長，這一作用可被自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤逆轉(zhuǎn)[11]。

2.5 其他 積雪草苷、厚樸酚、姜黃素、青蒿素、黃芩苷、大黃素和苦參堿等許多中藥單體也有增強(qiáng)自噬的作用。在腫瘤細(xì)胞中，厚樸酚和積雪草苷可通過增強(qiáng)自噬分別抑制非小細(xì)胞癌和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長；姜黃素聯(lián)合葡萄糖載體蛋白-1（GLUT-1）反義寡核苷酸可通過提高自噬升高喉癌細(xì)胞對放療的敏感性[12-13]。在成纖維細(xì)胞中，青蒿素通過Wnt/β-catenin PI3K/AKT/mTRO信號通路調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的自噬而影響纖維化進(jìn)程；黃芩苷則通過AMPK-mTOR途徑誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞自噬，保護(hù)其免受中波紫外線（UVB）照射誘導(dǎo)的凋亡[14]。此外，大黃素通過PI3K/AKT/mTOR途徑誘導(dǎo)人肝細(xì)胞自噬而抗細(xì)胞凋亡[15]?？鄥A則可通過抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)線粒體自噬來增強(qiáng)自我保護(hù)[16]。

3 中藥通過自噬調(diào)控皮膚色素沉著的啟示

3.1 自噬與皮膚色素代謝 近年研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）和黑素細(xì)胞（MC）對黑素小體的自噬在色素代謝中發(fā)揮重要作用，許多可促進(jìn)自噬的相關(guān)化合物也成為研究熱點(diǎn)[1]。皮膚色素沉著是由于黑素合成、黑素小體向KC轉(zhuǎn)運(yùn)及黑素小體降解過程發(fā)生異常導(dǎo)致的。自噬則通過向溶酶體傳遞靶物質(zhì)即黑素小體來誘導(dǎo)其降解。已被證實(shí)：KC的自噬活性與皮膚色素沉著程度呈負(fù)相關(guān)，即黑素小體數(shù)量與KC自噬活性之間的失衡是色素沉著的主因[17]。在對黃褐斑患者KC進(jìn)行microRNA和mRNA表達(dá)譜的微陣列分析中發(fā)現(xiàn)，KC中miR-1299的下調(diào)和精氨酸酶-2（ARG-2）的過表達(dá)對MC中酪氨酸酶（TYR）及黑素小體特異性蛋白前黑素小體蛋白17（PMEL17）的表達(dá)有促進(jìn)作用。miR-1299的下調(diào)和ARG-2的過表達(dá)通過刺激KC的衰老來降低其自噬活性，從而導(dǎo)致色素沉著發(fā)生[18]。研究表明，自噬的增加可誘導(dǎo)KC和MC中黑素體降解。通過對自噬標(biāo)記物共定位的黑素小體觀察，增強(qiáng)自噬通量可導(dǎo)致黑素小體減少。分離含黑素體的KC和MC后得到的細(xì)胞沉淀顏色顯著變淺。結(jié)果表明ULKBeclin 1自噬軸和mTOR通路在黑素小體自噬中發(fā)揮重要作用。Ser2448-p-mTOR則可直接導(dǎo)致MC中黑素小體的降解[1]。

3.2 有自噬作用的中藥對皮膚色素的影響 熊果酸、木犀草素、白藜蘆醇、人參皂苷、積雪草苷和姜黃素等有自噬活性的中藥單體亦可減輕皮膚色素沉著。開放性臨床試驗(yàn)表明，以熊果酸、黃芩根提取物、四已基癸抗壞血酸和輔酶Q為主要成分的保濕霜可改善皮膚整體外觀，包括面部色素沉著[19]。在韓國，一項(xiàng)針對50種海洋植物提取物的抗TYR篩選研究表明：紅纖維蝦海藻提取物，活性成分為7-硫酸木犀草素，可顯著抑制小鼠黑色素瘤B16/F10細(xì)胞和人類表皮MC的黑素合成，其作用要強(qiáng)于木犀草素和熊果苷[20]。而白藜蘆醇則不僅可抑制TYR的催化活性，還干擾TYR的基因表達(dá)和翻譯后成熟，并且已在體外實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中證實(shí)其脫色效應(yīng)。含有1.0%白藜蘆醇、4.4%煙酰胺、0.5%視黃醇和1.1%的己基間苯二酚的保濕乳膏可顯著改善皮膚色素沉著。但由于其化學(xué)性質(zhì)的不穩(wěn)定，許多白藜蘆醇衍生物正在被研究中，如白藜蘆醇三乙酸酯和藜蘆醇甘油三酸酯等[21]。此外，人參及其活性成分亦可能是潛在的新型皮膚美白劑。人參提取物、粉末或某些成分在體內(nèi)或體外都能抑制黑素生成。潛在的機(jī)制包括直接抑制TYR及參與黑素生成的轉(zhuǎn)錄因子，亦或是減少黑素生成的誘導(dǎo)因素等。如人參皂苷 Rb2、Rd、Re、Rh6 和 Rh23[22]等可降低斑馬魚模型中黑素含量和TYR活性。含0.1%人參皂苷F1（Rg1的代謝物）的乳膏在使用8周后對曬黑的皮膚顯示出明顯的美白效果，但人參皂苷F1不抑制正常人表皮MC TYR的mRNA的表達(dá)，而是通過促進(jìn)人表皮γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-13來顯著降低MC TYR的mRNA表達(dá)和蛋白含量，降低黑素合成[23]。由于黑素合成受小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）的調(diào)控。積雪草苷則可通過降低小鼠B16/F10黑素瘤細(xì)胞中MITF和DNA的親和力來抑制TYR的mRNA表達(dá)，可能對色素沉著類疾病或皮膚美白亦有益效[24]。此外，外用姜黃素可通過抑制TYR減輕皮膚色素沉著，但缺點(diǎn)是其溶解度低。研究發(fā)現(xiàn)，將姜黃素包裹到固體脂質(zhì)納米粒中，則可促進(jìn)其在皮膚中滲透[25]。

4 結(jié)語

目前臨床上對黃褐斑等色素增加性疾病的外用治療藥物主要為TYR抑制劑，但臨床療效不明顯，因此自噬誘導(dǎo)劑的研發(fā)對色素沉著性疾病有重要意義，但目前尚無促進(jìn)黑素小體降解的治療性自噬誘導(dǎo)劑。在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，許多中藥單體有抗炎、抗氧化和增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性的作用，而我國對中藥的使用歷史悠久，中藥有來源豐富和獲取便利等特點(diǎn)。已有大量研究表明，中藥單體可調(diào)控細(xì)胞自噬。本文旨在對常見有自噬調(diào)控作用的中藥單體研究進(jìn)展做一總結(jié)，以期為今后黑素小體自噬相關(guān)研究提供思路，對臨床美白護(hù)膚類藥物的研發(fā)有啟示作用。