粗毛纖孔菌產(chǎn)胞外黑色素發(fā)酵條件優(yōu)化及其抗氧化活性研究

李曉敏 袁 源 薛帆正 吳小平 傅俊生 ，

（1福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002； 2福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建 福州 350002）

粗毛纖孔菌［Inonotus hispidus（Bull.） P. Karst.］是一種名貴的藥用真菌，收錄于中國藥用真菌名錄，別名粗毛黃褐孔菌，隸屬于擔(dān)子菌門傘菌綱繡革孔菌目繡革孔菌科纖孔菌屬［1-2］。粗毛纖孔菌作為傳統(tǒng)中藥“桑黃”，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、保肝、增強(qiáng)免疫力等藥理價值［3-5］。在現(xiàn)代藥理學(xué)上，粗毛纖孔菌的藥用成分也逐漸被挖掘，如多糖、多酚、黃酮、萜類等活性物質(zhì)［6-8］。黑色素也是粗毛纖孔菌的活性成分之一，但關(guān)于粗毛纖孔菌黑色素的相關(guān)研究鮮有報道。

黑色素是一類分布極其廣泛的天然生物色素，是一種由酚類或吲哚氧化聚合形成的大分子［9］。黑色素具有良好的抗氧化［10］、抗腫瘤［11-12］、抗輻射、抗病毒、抑菌、自由基清除能力［13-14］、保肝［15］等生物活性，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域（如農(nóng)藥光保護(hù)劑［16］、生物吸附劑［17］、天然藥物［18］等）。有研究表明，粒毛盤菌（LachnumYM226）黑色素及其衍生物對H22荷瘤小鼠具有抗腫瘤活性［12］；在食品加工方面，黑色素可作為一種天然著色劑、抗氧化劑、抑菌劑，應(yīng)用于食品添加劑中起到調(diào)色、抗氧化等作用［19］；在工業(yè)上，因黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化性、光保護(hù)性，可應(yīng)用于防曬霜、抗衰老等產(chǎn)品開發(fā)，如斯氏假單胞菌產(chǎn)生的黑色素可以提高防曬霜的防曬系數(shù)［20］；在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，索拉菲尼（肝癌化療藥物）與黑色素結(jié)合構(gòu)建水溶性的納米藥物遞送的載體可用于小鼠腫瘤的治療［21］。

許多大型真菌都含有黑色素，這使得真菌成為獲取黑色素的重要來源。目前研究較多的有短梗霉屬、木耳屬、粒盤菌屬、層孔菌屬等來源的黑色素［22］。液體發(fā)酵培養(yǎng)有利于快速制備發(fā)酵產(chǎn)物，易于產(chǎn)業(yè)化。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵菌種、培養(yǎng)基配方以及培養(yǎng)條件等因素發(fā)揮著重要的作用［23］。培養(yǎng)基可以為微生物提供生長過程中所必需的營養(yǎng)要素，如碳源和氮源等，而發(fā)酵培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件則會對微生物的生長速度和代謝物的合成產(chǎn)生影響［23］。目前國內(nèi)外對粗毛纖孔菌產(chǎn)黑色素的液體深層發(fā)酵工藝研究的報道較少。本研究通過單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化粗毛纖孔菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件，以期從發(fā)酵液中獲得大量的胞外黑色素，并對其抗氧化活性進(jìn)行評價，為粗毛纖孔菌黑色素高效生產(chǎn)及天然黑色素的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗毛纖孔菌菌株：MS-5，由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心從寧夏中衛(wèi)市野生棗樹上生長的粗毛纖孔菌子實(shí)體分離獲得（NCBI登錄號：MF183947）。透析袋MD44（截留分子量為8 000～14 000 D）購于北京索萊寶科技有限公司。

試劑：葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、果糖、木糖、蔗糖、玉米粉、淀粉、乳糖、胰蛋白胨、酵母提取粉、牛肉浸膏、硝酸鉀、硝酸銨、酒石酸銨、脲、硫酸鎂、維生素B1（vitamin B1，VB1）、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、水楊酸、30%過氧化氫溶液（H2O2）、硫酸亞鐵溶液（FeSO4）等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl， DPPH）、2，2’-聯(lián)氮-雙（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽［2，2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate） diammonium salt， ABTS］等購自北京索萊寶科技有限公司。

PDB加富培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、5 g胰蛋白胨、2 g硫酸鎂、1.5 g磷酸二氫鉀、10 mg VB1、1 L水，pH自然。

1.2 主要儀器與設(shè)備

VS-1300-U超凈工作臺，安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZF-50L立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；EG720KG3-NR1微波爐，美的微波爐電器制造有限公司；UV-5200紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Thermo Scientific Nicolet 10紅外光譜儀，武漢德盟科技有限公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗毛纖孔菌發(fā)酵液黑色素（IHEM）產(chǎn)量的測定 參照羅青等［24］的方法，并稍作修改。將粗毛纖孔菌發(fā)酵液過濾收集濾液，使用濃度為6 mol·L-1的HCl將濾液pH值調(diào)節(jié)至1.5～2.0，置于4 ℃靜止過夜。次日，將酸化過的發(fā)酵液于10 000 r·min-1離心10 min后棄上清，并使用去離子水將沉淀重復(fù)洗滌至pH呈中性，隨后離心收集沉淀。將沉淀冷凍干燥即獲得粗毛纖孔菌發(fā)酵 液 黑色素（extracellular melanin ofInonotus hispidus，IHEM）粗品，并稱重測其IHEM含量。沉淀依次采用有機(jī)試劑氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇、75%乙醇和蒸餾水沖洗，于10 000 r·min-1離心5 min，去上清。將 沉 淀先 用0.1 mol·L-1NaOH復(fù)溶，再用0.1 mol·L-1HCl將溶液pH調(diào)節(jié)至中性，流水透析48 h，將其冷凍干燥獲得IHEM純品，用于檢測IHEM的光譜特征及化學(xué)抗氧化試驗(yàn)。后續(xù)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)均以未除雜的IHEM粗品含量作為評價指標(biāo)（即IHEM含量）。

1.3.2 初始培養(yǎng)基及發(fā)酵條件 初始培養(yǎng)基為PDB加富培養(yǎng)基，初始發(fā)酵條件為接種7片直徑為0.7 cm的粗毛纖孔菌于裝有100 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每組試驗(yàn)設(shè)定3個生物學(xué)重復(fù)，并將三角瓶置于25 ℃、160 r·min-1搖床中發(fā)酵培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)結(jié)束后收集粗毛纖孔菌發(fā)酵液，并按照1.3.1的方法對其黑色素進(jìn)行提取。

1.3.3 單因素試驗(yàn) （1）碳源篩選試驗(yàn)：以PDB加富培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，碳源分別替換為甘露醇、玉米粉、蔗糖、果糖、淀粉、乳糖、木糖、葡萄糖和麥芽糖，以不添加碳源為對照組，氮源為胰蛋白胨，pH自然（pH值5.7），置于25 ℃、160 r·min-1的搖床中黑暗培養(yǎng)10 d，測定IHEM含量。

（2）氮源篩選試驗(yàn)：以上述篩選的碳源培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，氮源分別替換為酵母提取粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硝酸鉀、硝酸銨、酒石酸銨和脲，以不添加氮源為對照組，碳氮比為4∶1，pH自然（pH值5.7），置于25 ℃、160 r·min-1的搖床中黑暗培養(yǎng)10 d，測定IHEM含量。

（3）碳氮比試驗(yàn)：以上述篩選的碳源、氮源為條件，碳氮比分別設(shè)定為4∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1和80∶1，以碳氮比4∶1為對照組，置于25 ℃、160 r·min-1的搖床中黑暗培養(yǎng)10 d，測定IHEM含量。

（4）維生素篩選試驗(yàn)：以上述篩選的碳源、氮源、碳氮比為條件，維生素分別替換為VB1、葉酸（vitamin B9，VB9）、生物素（vitamin H，VH）、維生素B6（vitamin B6，VB6）、核 黃 素（riboflavin∕vitamin B2，VB2）、抗壞 血酸（vitamin C，VC）、尼克酸（nicotinic acid，Vpp），以不添加維生素為對照組，置于25 ℃、160 r·min-1的搖床中黑暗培養(yǎng)10 d，測定IHEM含量。

（5）pH值篩選試驗(yàn)：以上述篩選的碳源、氮源、碳氮比和維生素為條件，設(shè)定培養(yǎng)基pH值依次為5、5.5、6、6.5、7、7.5和8，以初始pH自然為對照組（pH值5.7），置于25 ℃、160 r·min-1的搖床中黑暗培養(yǎng)10 d，測定IHEM含量。

（6）搖床轉(zhuǎn)速篩選試驗(yàn)：以上述篩選的碳源、氮源、碳氮比、維生素、pH值為條件，以轉(zhuǎn)速160 r·min-1為對照組，將粗毛纖孔菌分別置于25 ℃，120、140、160、180和200 r·min-1的搖床中黑暗培養(yǎng)10 d，測定IHEM含量。

（7）溫度篩選試驗(yàn)：基于上述配方繼續(xù)優(yōu)化，將粗毛纖孔菌分別置于24、25、26、27和28 ℃的搖床中，以培養(yǎng)溫度25 ℃作為對照組，在160 r·min-1條件下黑暗培養(yǎng)10 d，測定IHEM含量。

1.3.4 正交試驗(yàn) 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以IHEM含量為評價指標(biāo)，對碳源、氮源、pH值和轉(zhuǎn)速進(jìn)行正交優(yōu)化，每個分組設(shè)定3個重復(fù)，詳見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 IHEM紫外全吸收光譜檢測 稱取1 mg IHEM，溶解于濃度為0.1 mol·L-1的NaOH溶液中，50～60 ℃水浴加熱并充分混勻，30 min后黑色素完全溶解，于3 000 r·min-1條件下離心10 min，將上清液置于200～700 nm波長范圍內(nèi)測定紫外全吸收光譜［25］。

1.3.6 IHEM紅外光譜檢測 參考李琦等［26］的方法，采用溴化鉀壓片法，在模具中加入1～2 mg純化后的IHEM粉末和200 mg KBr純品粉末，使用油壓機(jī)將其壓成透明薄片，在波數(shù)范圍4 000～400 cm-1、掃描次數(shù)32、分辨率4 cm-1參數(shù)下測定其紅外吸收光譜。

1.4 IHEM化學(xué)抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH自由基清除率測定 參照Ai等［27］的方法并稍作修改。在96孔板中依次滴加100 μL不同濃度的可溶性IHEM溶液（0.012 5、0.025、0.05、0.25、0.5、1、2、5 mg·mL-1）和120 μmol·L-1DPPH溶液，室溫黑暗反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測定吸光度值，記為AX。分 別 以100 μL無水乙醇 代 替IHEM溶液 和DPPH溶液，測定波長517 nm下的吸光度值，記作A0和AX0。同時，以VC作為陽性對照組，采用同樣的方法測定其DPPH清除率。試驗(yàn)設(shè)定3個重復(fù)，取平均值。清除率計(jì)算公式如下：

1.4.2 ABTS自由基清除率測定 參照王榮等［28］的方法并稍作修改。將7.0 mmol·L-1ABTS溶液與2.45 mmol·L-1過硫酸鉀水溶液充分混勻，25 ℃黑暗保存12～16 h，獲得ABTS+母液。用去離子水將ABTS+母液稀釋至734 nm處吸光值為（0.70±0.02），30 ℃水浴30 min獲得ABTS+工作液。在96孔板中分別滴加100 μL不同濃度的可溶性IHEM溶液（0.012 5、0.025、0.05、0.25、0.5、1 mg·mL-1）和ABTS+工作液，將其混勻后25 ℃避光反應(yīng)20 min，在734 nm波長處測定其吸光度值，記為AX。分別以100 μL去離子水代替IHEM溶液和ABTS+工作液，測定734 nm波長下的吸光度值，記為A0和AX0。采用同樣的方法對VC的ABTS清除率進(jìn)行測定并作為對照組。試驗(yàn)設(shè)定3個重復(fù)，取平均值，清除率計(jì)算同公式（1）。

1.4.3 羥基自由基清除率測定 參照白生文等［29］的方法并稍作修改。在96孔板中依次加入9 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液、9 mmol·L-1的FeSO4溶液、不同濃度（0.012 5、0.025、0.05、0.25、0.5、1、2、5 mg·mL-1）的可溶性IHFM溶液和8.8 mmol·L-1的H2O2溶液各15 μL，最后加入165 μL去離子水，混合均勻并置于37 ℃恒溫水溶鍋中水浴15 min，測定510 nm波長下的吸光度值，記為AX。以15 μL去離子水替代樣品溶液和H2O2測定吸光度，測定510 nm波長下的吸光度值，記為A0和AX0。試驗(yàn)設(shè)定3個重復(fù)，取平均值，清除率計(jì)算同公式（1）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要營養(yǎng)要素篩選結(jié)果

由圖1-A可知，相比未添加碳源的對照組，添加甘露醇、玉米粉可以極顯著提高發(fā)酵液中黑色素的含量（P<0.01），添加蔗糖和果糖也顯著提高了發(fā)酵液中黑色素的含量（P<0.05），其中甘露醇促進(jìn)效果最好。因此選擇甘露醇作為碳源繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1-B可知，相比未添加氮源的對照組，酵母提取粉極顯著促進(jìn)了粗毛纖孔菌發(fā)酵液產(chǎn)黑色素，胰蛋白胨次之，牛肉浸膏第三。硝酸銨、酒石酸銨等無機(jī)氮源添加處理的IHEM含量與對照無顯著差異。綜上所述，酵母提取粉為最適氮源。

以PDB加富培養(yǎng)基中的碳氮比4∶1作為對照組。由圖1-C可知，發(fā)酵液中黑色素的含量隨著碳氮比的增加而減少，當(dāng)碳氮比為4∶1（即甘露醇20 g，酵母提取粉5 g）時，IHEM的含量最高，因此選擇碳氮比4∶1繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 碳源、氮源及碳氮比對IHEM含量的影響Fig.1 Effects of carbon source， nitrogen source and carbon nitrogen ratio on IHEM content

2.2 生長因子篩選結(jié)果

由圖2可知，相比未添加維生素的對照組，添加VB1的發(fā)酵液顏色深于對照組的發(fā)酵液，且VB1極顯著提高了IHEM含量，而其他維生素均顯著或極顯著降低了IHEM含量。因此，粗毛纖孔菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最適維生素為VB1。

圖2 維生素對IHEM含量的影響Fig.2 Effect of vitamin on IHFM content

2.3 培養(yǎng)條件篩選結(jié)果

由圖3-A可知，初始pH自然條件下的IHEM含量最高，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH會不同程度地降低發(fā)酵液中IHEM的含量，其中pH自然條件下發(fā)酵液顏色最深，故而選擇pH自然繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖3-B可知，發(fā)酵液中IHEM的含量在轉(zhuǎn)速為160 r·min-1時最高，而后隨 著轉(zhuǎn)速 升 高，發(fā) 酵液中IHEM的含量降低，故選擇160 r·min-1繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖3-C可知，發(fā)酵液中IHEM的含量隨著溫度升高呈先升高后降低的趨勢，在溫度為25 ℃時最高，故選擇25 ℃繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 不同培養(yǎng)條件對IHEM含量的影響Fig.3 Effects of different culture conditions on IHEM content

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇碳源、氮源、pH值、轉(zhuǎn)速較佳的前三種方案開展三水平四因素的正交優(yōu)化試驗(yàn)，以IHEM含量為指標(biāo)，探究促進(jìn)粗毛纖孔菌高產(chǎn)黑色素的最優(yōu)培養(yǎng)條件。

通過對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析（表2），發(fā)現(xiàn)在4個單因素的各均值中，碳源為甘露醇的均值最大，氮源為牛肉浸膏的均值最大，pH值為6的均值最大，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的均值最大。在此條件下，第3個優(yōu)化組合的IHEM含量最高，達(dá)到3.29 g·L-1。如圖4所示，觀察比較各組合發(fā)酵液的顏色，同樣發(fā)現(xiàn)第3個優(yōu)化組合的發(fā)酵液顏色最黑，由此表明粗毛纖孔菌在該配方下可獲得較高含量的IHEM。通過對極差（R）進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)4個因素的極差由大到小依次為轉(zhuǎn)速>碳源>氮源>pH值，說明轉(zhuǎn)速是影響IHEM含量的主要因素。方差分析結(jié)果表明（表3），4個因素的F值從大到小依次為轉(zhuǎn)速>碳源>氮源>pH值，與直觀分析結(jié)果一致。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

圖4 正交試驗(yàn)中各種配方對應(yīng)的粗毛纖孔菌發(fā)酵液Fig.4 The fermentation broth of Inonotus hispidus corresponding to each recipe in the orthogonal test

表2 IHEM含量正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析Table 2 Intuitionistic analysis of IHEM content by orthogonal test

2.5 IHEM紫外全吸收光譜和紅外光譜分析

紫外全吸收光譜和紅外光譜是鑒定黑色素基本特征的重要途徑［30］。如圖5-A所示，IHEM在紫外光區(qū)210 nm波長處具有最大吸收峰，其吸光值向可見光區(qū)逐漸下降，該特征符合黑色素的吸收特征［31］。在260 nm及280 nm處無吸收峰，表明IHEM純品無核酸和蛋白質(zhì)，提取的IHEM純品相對較純。如圖5-B所示，IHEM在波數(shù)3 430.887 cm-1處具有較強(qiáng)且寬的特征吸收，與吲哚環(huán)內(nèi)-OH基團(tuán)連接的-NH基團(tuán)相對應(yīng)，寬而強(qiáng)的吸收峰可能與-NH、-OH中形成了氫鍵有關(guān)［31］。2 923.679 cm-1對應(yīng)脂肪族-CH，1 637.337 cm-1對應(yīng)C=O拉伸或芳香C=C拉伸［32］。1 540.910 cm-1的峰值與-NH彎曲振動有關(guān)，1 438.697 cm-1左右的峰值則與-CN拉伸峰有關(guān)，說明其具有典型的黑色素吲哚結(jié)構(gòu)［32］。632.564 cm-1處吸收帶較弱，說明芳香環(huán)已被取代形成共軛體系［33］。以上結(jié)果表明，通過提取純化獲得的IHEM符合傳統(tǒng)黑色素的結(jié)構(gòu)特征。

圖5 IHEM光譜特性分析Fig.5 Spectral properties analysis of IHEM

2.6 IHEM體外抗氧化活性分析

在明確IHEM為黑色素后，研究其抗氧化活性。VC是一種強(qiáng)抗氧化劑，能有效抵御自由基對人體的傷害，降低脂質(zhì)過氧化等作用。由圖6可知，IHEM對ABTS自由基的清除效果最好，其次是清除DPPH自由基的能力，清除羥基自由基的效果較弱，其半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect， EC50）依 次 為0.019、0.170和1.932 mg·mL-1。當(dāng)IHEM濃度為0.25 mg·mL-1時，其對ABTS自由基的清除效果與VC無顯著差異，表明可溶性IHEM具有良好的體外抗氧化活性。

圖6 IHEM的抗氧化活性Fig.6 The antioxidant activity of IHEM

3 討論

在活性物質(zhì)研究中，研究較多的是來源于子實(shí)體活性物質(zhì)的生物學(xué)活性。藥用真菌發(fā)酵液中含有豐富的代謝產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)多樣，且發(fā)酵液比子實(shí)體更易獲取，周期更短，是活性物質(zhì)的重要來源之一［34］。黑色素作為粗毛纖孔菌的活性成分之一，存在于子實(shí)體和發(fā)酵液中，但對于液體發(fā)酵黑色素的研究鮮有報道。液體發(fā)酵在微生物工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方來提高黑色素的生物產(chǎn)量，可以為黑色素在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

本研究單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，甘露醇作為碳源可顯著提高IHEM含量，這與其具有調(diào)節(jié)滲透壓、抗逆性等活性相關(guān)［35］。甘露醇可通過調(diào)節(jié)粗毛纖孔菌的滲透壓來促進(jìn)粗毛纖孔菌的代謝，進(jìn)而提高IHEM的含量。氮源可分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酵母提取粉、胰蛋白胨和牛肉浸膏等有機(jī)氮源均能顯著提高IHEM含量，但硝酸鉀、硝酸銨、酒石酸銨、脲等無機(jī)氮源未顯著提高IHEM含量，表明有機(jī)氮能為IHEM的產(chǎn)生提供優(yōu)質(zhì)的有機(jī)營養(yǎng)；當(dāng)脲為氮源時，粗毛纖孔菌幾乎不產(chǎn)黑色素，可能是因?yàn)殡遄鳛橐辉獕A影響了培養(yǎng)基的pH值，從而不利于粗毛纖孔菌的正常生長。IHEM含量隨著碳氮比的增加而逐漸減少，當(dāng)碳氮比為4∶1時，IHEM含量最高，可能與氮源及粗毛纖孔菌黑色素合成途徑相關(guān)。維生素作為一種生長因子［36］，不同維生素可能具有不同作用，本研究發(fā)現(xiàn)，添加VB1可顯著提高IHEM含量，而其他維生素對IHEM產(chǎn)生有一定的抑制作用，這可能是因?yàn)閂B1能促進(jìn)菌體的生長，從而促進(jìn)黑色素的生成，這與唐少軍等［7］的研究結(jié)果相似。同時，培養(yǎng)條件也會影響微生物的生長情況和代謝產(chǎn)物的合成［26］。本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基pH值為5.5、5.7（自然）和6時的IHEM含量均較高，推測粗毛纖孔菌在弱酸性條件下更易產(chǎn)生黑色素，而強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件可能會影響菌絲的細(xì)胞膜透性；搖床轉(zhuǎn)速亦會影響IHEM含量，隨著培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的增加，IHEM含量呈先增后減的趨勢，轉(zhuǎn)速為140、160、180 r·min-1時的IHEM含量較高，表明適當(dāng)加快轉(zhuǎn)速有利于增加發(fā)酵液中的溶解氧含量，以促進(jìn)黑色素的產(chǎn)生，但轉(zhuǎn)速過大會對菌絲體造成機(jī)械損傷，不利于菌絲體的生長及黑色素的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)速過低可能會導(dǎo)致發(fā)酵液中的溶解氧含量不足以供給粗毛纖孔菌生長所需；粗毛纖孔菌在25 ℃時的IHEM含量最高，可能是由于溫度過高會影響真菌細(xì)胞內(nèi)的酶活力及粗毛纖孔菌的生長與代謝。

通過測定IHEM清除自由基的能力，發(fā)現(xiàn)IHEM具有良好的抗氧化活性，這與袁源等［37］報道的黑木耳黑色素具有良好抗氧化性的結(jié)果基本一致。表明IHEM可以作為新型抗氧化劑應(yīng)用在食品、化妝品等領(lǐng)域。本研究為粗毛纖孔菌黑色素的開發(fā)及應(yīng)用提供了新思路。

4 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)探索了碳源、氮源、碳氮比、溫度等因素對粗毛纖孔菌產(chǎn)胞外黑色素的影響，在此基礎(chǔ)上以正交試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。結(jié)果表明，粗毛纖孔菌高產(chǎn)胞外黑色素的最佳培養(yǎng)基配方為甘露醇20 g·L-1、牛肉浸膏5 g·L-1、碳氮比4∶1、維生素B110 mg·L-1，最優(yōu)發(fā)酵條件為初始pH值6、轉(zhuǎn)速180 r·min-1以及發(fā)酵溫度25 ℃，在此培養(yǎng)條件下，IHEM含量高達(dá)3.29 g·L-1，較優(yōu)化前提高了17.32倍，表明該培養(yǎng)配方可作為大量生產(chǎn)IHEM的有效配方。以紫外全吸收光譜和紅外光譜對胞外黑色素進(jìn)行鑒定，光譜特征符合黑色素的吸收特征。黑色素抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，黑色素具有良好的抗氧化活性。